周文君，張振，許寧寧，李雙喜，陳宏

胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一種由腸道L細(xì)胞分泌的腸促胰素，可作用于胰島β細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制其凋亡，促進(jìn)胰島素的釋放并明顯改善胰島細(xì)胞的功能[1-2]。此外，在脂肪細(xì)胞中，GLP-1受體激活劑可改善其對(duì)胰島素敏感性，并抑制其增殖[3]。腸促胰島素效應(yīng)的減弱可導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能障礙和胰島素抵抗[4]，最終將發(fā)展成2型糖尿病，而腸道L細(xì)胞的早期炎癥損傷可能是GLP-1分泌減少的關(guān)鍵原因[5]。因此，探討腸道L細(xì)胞早期炎癥損傷的發(fā)生機(jī)制對(duì)糖尿病的防治研究具有重要意義。晚期糖基化的過(guò)程導(dǎo)致糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)積累，加速了糖尿病、腎衰竭、炎癥、神經(jīng)病變和衰老的進(jìn)程[6-7]。AGEs作用于糖基化終產(chǎn)物受體(receptor of advanced glycation end products，RAGE)可導(dǎo)致NADPH積累，最終導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)信號(hào)通路的激活，在誘導(dǎo)細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)表達(dá)的過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，加劇了糖尿病糖耐量受損階段的病理改變。而p38MAPK作為NF-κB的重要上游激酶，可被氧化產(chǎn)物激活后誘導(dǎo)NF-κB的活化[8]。2型糖尿病長(zhǎng)期的慢性低度炎癥可能是腸道L細(xì)胞發(fā)生早期炎癥損傷并導(dǎo)致腸促胰島素分泌減少的關(guān)鍵原因，與AGEs/RAGE/NADPH/p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路密切相關(guān)。但是，上述通路在腸道L細(xì)胞炎癥損傷中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討AGEs在p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)的腸道L細(xì)胞早期損傷中的作用及機(jī)制，以期為研究2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 腸道L細(xì)胞株由加拿大多倫多大學(xué)Druker實(shí)驗(yàn)室的Drucker DJ教授惠贈(zèng)。10%胎牛血清、DMEM低糖培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)，兔抗鼠NF-κB p65抗體、鼠抗β-actin單克隆抗體(碧云天公司)，兔抗鼠phospho-p38MAPK抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(美國(guó)R&D公司)，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(美國(guó)R&D公司)，GLP-1、白細(xì)胞介素1(IL-1)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(美國(guó)Sigma公司)，Trizol SYBR及反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TAKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將腸道L細(xì)胞按文獻(xiàn)[9]的方式進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，消化傳代。將胎牛血清白蛋白(BSA)和D-葡萄糖溶于PBS中，避光孵育12周制備AGEs-BSA。以熒光分光光度計(jì)鑒定AGEs-BSA。采用24孔板鋪板細(xì)胞，用DMEM低糖培養(yǎng)基預(yù)處理，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h，使其處于同步化狀態(tài)，每24h換液。實(shí)驗(yàn)分為6組：空白對(duì)照組(NC組，即不加入干預(yù)因素，僅培養(yǎng)于DMEM低糖培養(yǎng)基中)、BSA對(duì)照組(即培養(yǎng)于加入BSA的DMEM低糖培養(yǎng)基中)、AGEs 100μg/ml組(培養(yǎng)于含100μg/ml AGEs的DMEM低糖培養(yǎng)基中)、AGEs 200μg/ml組(培養(yǎng)于含200μg/ml AGEs的DMEM低糖培養(yǎng)基中)、AGEs 300μg/ml組(培養(yǎng)于含300μg/ml AGEs的DMEM低糖培養(yǎng)基中)、AGEs+apocynin組(培養(yǎng)于含200μg/ml AGEs和600μmol/L apocynin的DMEM低糖培養(yǎng)基中[9])，干預(yù)方法同前。各組細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.2 GLP-1分泌水平檢測(cè) 采用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)，其可測(cè)范圍為4.1～1000pmol/L，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為5%和12%。按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀上測(cè)定波長(zhǎng)450nm處的吸光度(OD)值和樣本濃度。

1.2.3 p38MAPK、NF-κB p65 mRA水平檢測(cè) 采用RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)。使用Trizol試劑從β細(xì)胞提取總RNA，再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用2–ΔΔCt法檢測(cè)p38MAPK、NF-κB p65的相對(duì)基因表達(dá)水平。

1.2.4 p-p38MAPK、p38MAPK、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blotting法進(jìn)行檢測(cè)。提取細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性，8% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。7.5%脫脂牛奶封閉2h，分別加入特異性一抗phospho-p38MAPK(1:1000)、NF-κB p65(1:1000)和內(nèi)參β-actin(1:10 000)4℃孵育過(guò)夜。洗膜，加入二抗(1:1000羊抗兔IgG抗體)孵育1h，洗膜，采用Bio-Rad凝膠掃描成像系統(tǒng)顯影拍照，Quantity One圖像軟件分析目的蛋白和內(nèi)參蛋白的灰度值，計(jì)算相對(duì)灰度值。

1.2.5 炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6水平的檢測(cè)采用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。TNF-α的可測(cè)范圍為50～2450pg/ml，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為5%和12%；IL-1的可測(cè)范圍為0.01～1000pg/ml，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為5%和12%。IL-6的可測(cè)范圍為0.01～100pg/ml，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為5%和12%。按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm波長(zhǎng)處的OD值和樣本濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組GLP-1分泌水平的比較 與NC組(92.30±5.10pmol/L)、BSA組(87.75±7.10pmol/L)相比，不同濃度(100、200、300μg/ml)AGEs處理組的GLP-1分泌水平(分別為70.03±4.32、55.28±6.25、38.15±6.10pmol/L)均明顯下降(P＜0.05)，且呈濃度依賴(lài)性(P＜0.05)，采用apocynin抑制NADPH酶的活性后，AGEs+apocynin組GLP-1分泌水平(83.60±7.28pmol/L)較AGEs組明顯上升(P＜0.05)。

2.2 各組p38MAPK、NF-κB p65 mRNA的表達(dá)水平比較 與NC、BSA組相比，隨著AGEs濃度的升高，AGEs處理組p38MAPK、NF-κB p65 mRNA有升高的趨勢(shì)，并與AGEs濃度呈正相關(guān)，在200μg/ml和300μg/ml AGEs處理組中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。NADPH酶抑制劑apocynin干預(yù)明顯抑制了AGEs對(duì)p38MAPK、NF-κB p65 mRNA的上調(diào)作用，即p38MAPK、NF-κB p65 mRNA水平明顯降低(P＜0.05，圖1)。

圖1 AGEs對(duì)p38MAPK、NF-κB p65 mRNA水平的調(diào)控Fig.1 Effect of AGEs on the level of p38MAPK, NF-κB p65 mRNA

2.3 AGEs對(duì)p38MAPK、p-P38MAPK、NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響 各組p38MAPK蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但p38MAPK蛋白磷酸化(p-p38MAPK)和NF-κB p65蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fp-p38MAPK=101.600，F(xiàn)NF-κB=46.666，P=0.000)。其中，各濃度AGEs組p-p38MAPK和NF-κB p65蛋白表達(dá)水平較NC組、BSA組明顯升高(P＜0.05)，且呈濃度依賴(lài)性，表明隨著AGEs濃度的上升，p38MAPK磷酸化水平升高(P＜0.05)。而用apocynin抑制NADPH酶的活性后，與AGEs組比較，AGEs+apocynin組p-p38MAPK和NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯下降(P＜0.05，圖2)。

2.4 AGEs對(duì)TNF-α、IL-1、IL-6分泌水平的影響

與NC組、BSA組比較，AGEs各濃度組炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6分泌水平均上升(P＜0.05)，呈濃度依賴(lài)性，表明AGEs的促炎癥作用與其濃度相關(guān)。而用apocynin抑制NADPH酶的活性后，TNF-α、IL-1、IL-6表達(dá)水平較AGEs組明顯下降(P＜0.05，表1)。

3 討 論

AGEs與RAGE結(jié)合可引起氧化應(yīng)激并激活多條細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘發(fā)一系列促炎、促凝血反應(yīng)，促進(jìn)糖尿病并發(fā)癥如動(dòng)脈粥樣硬化、腎臟病變的發(fā)生與發(fā)展[10-11]。本研究前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，AGEs作用于腸道L細(xì)胞，可上調(diào)細(xì)胞RAGE表達(dá)，從而激活NADPH氧化酶，使細(xì)胞內(nèi)ROS生成增多，誘導(dǎo)腸道L細(xì)胞的凋亡。此外，AGEs與RAGE結(jié)合后不僅導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，還可誘發(fā)炎癥反應(yīng)，現(xiàn)許多研究表明，AGEs可促進(jìn)炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6的分泌，從而損傷細(xì)胞，但AGEs的促炎癥作用對(duì)腸道L細(xì)胞的影響尚未見(jiàn)報(bào)道[12-13]。GLP-1是腸道L細(xì)胞受消化食物刺激后分泌的一種腸促胰素，能夠抑制食物的攝取，促進(jìn)胃排空，改善胰島素的敏感性，還可作用于α、β細(xì)胞，產(chǎn)生雙向調(diào)節(jié)作用。GLP-1受體激動(dòng)劑以及GLP-1類(lèi)似物目前已廣泛應(yīng)用于治療2型糖尿病，成為近年來(lái)糖尿病防治領(lǐng)域的重要進(jìn)展[14]。目前動(dòng)物研究表明，GLP-1可明顯改善胰島β細(xì)胞的功能，促進(jìn)β細(xì)胞增殖并抑制其凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示，隨著AGEs濃度的升高，腸道L細(xì)胞TNF-α、IL-1、IL-6表達(dá)水平升高，即說(shuō)明了AGEs的促炎癥作用。而隨著環(huán)境中炎癥因子水平的上升，又直接影響了腸道L細(xì)胞的分泌功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞GLP-1分泌水平下降。采用apocynin抑制NADPH酶活性后，TNF-α、IL-1、IL-6表達(dá)水平明顯下降，且GLP-1分泌水平恢復(fù)，提示AGEs可誘導(dǎo)腸道L細(xì)胞產(chǎn)生炎癥損傷，且該作用與NADPH酶的激活有關(guān)。

圖2 AGEs對(duì)p38MAPK、p-p38MAPK、NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of AGEs on the protein expression of p38MAPK, p-p38MAPK and NF-κB p65

表1 AGEs對(duì)TNF-α、IL-1、IL-6分泌水平的影響(pg/ml，±s)Tab.1 Effect of AGEs on the secretion of TNF-α、IL-1、IL-6 (pg/ml, ±s)

表1 AGEs對(duì)TNF-α、IL-1、IL-6分泌水平的影響(pg/ml，±s)Tab.1 Effect of AGEs on the secretion of TNF-α、IL-1、IL-6 (pg/ml, ±s)

APO. Apocynin; (1)P＜0.05 compared with NC group and BSA group; (2)P＜0.05 compared with 100μg/ml AGEs group; (3)P＜0.05 compared with 200μg/ml AGEs group; (4)P＜0.05 compared with 300μg/ml AGEs group

Group TNF-α IL-1 IL-6 NC 15.30±1.71 50.67±4.99 43.80±5.94 BSA 16.10±2.15 55.33±6.06 50.40±5.64 100μg/ml AGEs 27.23±4.25(1) 136.50±13.05(1) 95.93±12.29(1)200μg/ml AGEs 38.93±3.62(1)(2) 197.17±12.01(1)(2) 177.93±9.26(1)(2)300μg/ml AGEs 54.47±5.85(1)(2)(3) 287.70±13.75(1)(2)(3) 234.27±19.74(1)(2)(3)AGEs+apocynin 18.40±3.75(2)(3)(4) 68.17±8.72(2)(3)(4) 63.50±7.62(2)(3)(4)

NF-κB作為一種主要的轉(zhuǎn)錄因子，可以結(jié)合在免疫球蛋白輕鏈基因增強(qiáng)子上的B細(xì)胞特異核蛋白，存在于不同類(lèi)型細(xì)胞中且控制多種基因的表達(dá)，這些基因的增強(qiáng)子中均含有NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，激活的NF-κB能啟動(dòng)這些靶基因的轉(zhuǎn)錄，在炎癥和自身免疫反應(yīng)中起重要作用[4,16]。一般情況下，非活化的NF-κB復(fù)合物位于細(xì)胞質(zhì)中，該復(fù)合物包括功能性亞基p65和抑制性亞基IκBα。功能性亞基可以直接與DNA結(jié)合，從而進(jìn)一步引起基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，而抑制性亞基IκBα則可阻止功能性亞基的分離。在應(yīng)激反應(yīng)中，IκB激酶(IKK)使抑制型亞基IκBα降解，最終導(dǎo)致功能性亞基p65釋放，并向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，與DNA結(jié)合后引起基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控[17]。p38MAPK是NF-κB的上游激酶，p38MAPK的激活能進(jìn)一步誘導(dǎo)NF-κB活化，在NF-κB通路的激活中起著重要的作用。Nick等[18]證實(shí)LPS刺激中性粒細(xì)胞可激活p38MAPK磷酸化，最終調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附及NF-κB活化，并增強(qiáng)TNF-α mRNA及蛋白的表達(dá)，提示p38MAPK對(duì)NF-κB具有正向調(diào)控作用。

有研究表明，血管內(nèi)皮NADPH氧化酶亞單位Nox-4過(guò)度表達(dá)，與p22phox一起構(gòu)成活化的復(fù)合物，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生超氧陰離子，并使p38MAPK磷酸化[19]。Sun等[20]研究發(fā)現(xiàn)，AGEs可通過(guò)RAGE/p38MAPK/NF-κB途徑引起人內(nèi)皮祖細(xì)胞功能紊亂，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成。Yeh等[21]對(duì)人單核細(xì)胞的研究表明，AGEs和RAGE結(jié)合引起p38MAPK磷酸化，導(dǎo)致NF-κB通路活化，促進(jìn)炎癥因子TNF-α、IL-1、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)的表達(dá)和釋放，該機(jī)制在糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。這提示我們上述AGEs通路的促炎癥作用也可能參與腸道L細(xì)胞的炎癥發(fā)生過(guò)程，然而目前尚未有研究明確報(bào)道。本研究結(jié)果提示，隨著AGEs處理濃度的提高，p38MAPK磷酸化水平和NF-κB表達(dá)量呈劑量依賴(lài)性增加，表明NF-κB通路被激活，而用apocynin特異性抑制NADPH氧化酶的活性后，細(xì)胞內(nèi)p38MAPK磷酸化和NF-κB表達(dá)量水平下降，說(shuō)明AGEs與RAGE結(jié)合后激活了NADPH氧化酶，繼而激活p38MAPK/NF-κB通路，誘導(dǎo)腸道L細(xì)胞的炎癥損傷，符合之前的研究猜想。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，AGEs作用于腸道L細(xì)胞，與RAGE結(jié)合后激活NADPH氧化酶，進(jìn)而通過(guò)p38MAPK/NF-κB途徑促進(jìn)TNF-α、IL-1、IL-6的分泌，使L細(xì)胞出現(xiàn)炎癥損傷，最終導(dǎo)致GLP-1分泌減少。用apocynin抑制NADPH氧化酶后可減輕AGEs對(duì)腸道L細(xì)胞的炎癥損傷作用，GLP-1分泌可以得到一定程度的恢復(fù)。本研究為減輕腸道L細(xì)胞的炎癥反應(yīng)以及提高GLP-1分泌水平，從而改善2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展提供了新的思路，為apocynin的應(yīng)用提供了研究基礎(chǔ)，但L細(xì)胞的炎癥作用于p38MAPK/NF-κB通路的相關(guān)機(jī)制尚需進(jìn)一步探索。

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