劉佳梁，唐子淋，李樂，張凱，邵金曼，紀(jì)冬，李進(jìn)，徐東平，劉妍，陳國(guó)鳳

乙型病毒性肝炎嚴(yán)重威脅人類健康，世界衛(wèi)生組織2017年最新發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示在全球范圍內(nèi)約有2.57億人患有慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染[1]，僅我國(guó)就有約9300萬(wàn)HBsAg陽(yáng)性攜帶者[2]。HBV血清學(xué)標(biāo)志物5項(xiàng)(HBsAg、Anti-HBs、HBeAg、Anti-HBe以及Anti-HBc)是目前臨床應(yīng)用最為廣泛的HBV感染檢測(cè)與篩查指標(biāo)。其中，HBsAg陽(yáng)性通常提示HBV感染，Anti-HBs則被認(rèn)為是人體應(yīng)對(duì)HBV感染所產(chǎn)生的對(duì)抗HBsAg的保護(hù)性抗體[3]。傳統(tǒng)的免疫學(xué)理論認(rèn)為Anti-HBs的出現(xiàn)代表機(jī)體對(duì)HBV的抵抗與免疫，HBsAg與Anti-HBs不會(huì)長(zhǎng)時(shí)間同時(shí)存在，然而在實(shí)際臨床工作中卻時(shí)常見到HBsAg與Anti-HBs共同陽(yáng)性的情況[4]，這種現(xiàn)象在HBV感染患者中的發(fā)生率在不同地區(qū)不盡相同，我國(guó)相關(guān)研究報(bào)道的發(fā)生率為2.48%～22.65%[5-7]。有研究提示HBsAg與Anti-HBs共同陽(yáng)性可能與乙型肝炎的疾病嚴(yán)重程度，甚至HCC的發(fā)生有關(guān)[8-9]，但是在乙型肝炎肝硬化這一特定階段內(nèi)HBsAg與Anti-HBs共同陽(yáng)性的意義與成因卻并不明確，本研究旨在通過探索上述問題，為臨床實(shí)踐及進(jìn)一步相關(guān)研究提供幫助。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2007年8月－2015年12月于解放軍302醫(yī)院就診并進(jìn)行HBV DNA定量檢測(cè)的5334例HBsAg(+)患者的相關(guān)病歷資料，其中376例為HBsAg/Anti-HBs共同陽(yáng)性。HBsAg/Anti-HBs共同陽(yáng)性組(以下簡(jiǎn)稱共同陽(yáng)性組)納入標(biāo)準(zhǔn)：①間隔不少于6個(gè)月連續(xù)2次檢測(cè)確認(rèn)HBsAg(+)且同時(shí)Anti-HBs(+)；②無(wú)丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)重疊感染；③腹部超聲、CT、MRI等影像學(xué)檢查或肝臟組織病理學(xué)檢查明確診斷為肝硬化且未提示原發(fā)性肝癌。共81例患者符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)依照上述標(biāo)準(zhǔn)抽取167例HBsAg(+)且Anti-HBs(–)的乙型肝炎肝硬化病例為HBsAg單陽(yáng)性組(以下簡(jiǎn)稱單陽(yáng)性組)。乙型肝炎肝硬化診斷依據(jù)為我國(guó)《慢性乙型肝炎防治指南(2015年)》[10]。納入研究的248例患者均簽署相關(guān)知情同意書，本研究經(jīng)解放軍302醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HBV血清學(xué)標(biāo)志物及HBV DNA定量檢測(cè)HBV血清學(xué)標(biāo)志物(包括HBsAg、Anti-HBs、HBeAg、Anti-HBe、Anti-HBc)由解放軍302醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心采用化學(xué)發(fā)光法定性檢測(cè)。HBV DNA定量檢測(cè)采用羅氏公司商品試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)下限為100IU/ml。

1.2.2 HBV DNA S區(qū)序列測(cè)定 采用DNA out試劑盒提取血清HBV DNA，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。采用本課題組自主研發(fā)的一管式巢式聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法擴(kuò)增HBV S基因技術(shù)(國(guó)家發(fā)明專利：ZL 200910092331.1，HBV DNA序列測(cè)定的下限約為20IU/ml)。所用試劑、引物及具體實(shí)驗(yàn)方法參見本課題組既往報(bào)道[11]，PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，送北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定，每個(gè)樣品均進(jìn)行正反雙向測(cè)序，并進(jìn)行基因測(cè)序分析。

1.2.3 HBV基因型、S蛋白主要親水區(qū)免疫逃逸相關(guān)變異與新增N-糖基化位點(diǎn)變異分析 將測(cè)序所得HBV DNA序列與NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpagex.cgi) 收錄的HBV基因型全基因組標(biāo)準(zhǔn)序列的S基因相比較以檢測(cè)HBV基因型。使用DNASTAR Lasergene MegAlign軟件將上述數(shù)據(jù)庫(kù)中4條HBV C基因型序列(序列號(hào)：AB014381、AB048704、AB074755、AF182804)作為標(biāo)準(zhǔn)與測(cè)序所得序列進(jìn)行比對(duì)以分析S區(qū)變異，進(jìn)而得出S蛋白氨基酸變異情況。主要親水區(qū)(major hydrophilic region，MHR)指S蛋白第99－169位氨基酸，新增N-糖基化位點(diǎn)變異指在原有s146-148NCT N-糖基化位點(diǎn)基礎(chǔ)上，新增NXT/S(X為P以外的任何氨基酸殘基)N-糖基化位點(diǎn)。本研究重點(diǎn)分析既往文獻(xiàn)[12-16]報(bào)道過的46種HBV S基因MHR區(qū)免疫逃逸相關(guān)位點(diǎn)的變異(表1)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0及Microsoft Excel 2016軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)[M(Min，Max)]表示，正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及百分比表示。考慮本研究檢測(cè)方法檢測(cè)下限約為20IU/ml，故樣本HBV DNA檢測(cè)結(jié)果低于檢測(cè)下限(100IU/ml)均按照中間值60IU/ml計(jì)，即1.78 log10IU/ml。PT延長(zhǎng)時(shí)間為實(shí)際測(cè)得PT時(shí)間減去14.0s。依據(jù)數(shù)據(jù)類型分別采用χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)或U檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 既往報(bào)道的HBV S蛋白MHR區(qū)免疫逃逸相關(guān)變異Tab.1 Immune escape related mutations within MHR of HBV S protein in previous reports

2 結(jié) 果

2.1 兩組乙型肝炎肝硬化患者一般臨床特征分析HBsAg/Anti-HBs共同陽(yáng)性組81例患者年齡46.8±9.4歲，其中70例(86.4%)為男性，而HBsAg單陽(yáng)性組167例患者年齡47.8±10.2歲，其中152例(91.0%)為男性。共同陽(yáng)性組定量檢測(cè)HBV DNA數(shù)為5.07±1.86 log10IU/ml，單陽(yáng)性組HBV DNA數(shù)為5.04±2.07 log10IU/ml，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HBV測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)序列比照結(jié)果顯示共同陽(yáng)性組與單陽(yáng)性組HBV基因型均為C型。共同陽(yáng)性組HBeAg陽(yáng)性率為50.6%，單陽(yáng)性組為50.9%，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。共同陽(yáng)性組與單陽(yáng)性組在年齡、性別構(gòu)成、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，總膽紅素(TBIL)、白蛋白(ALB)等生化指標(biāo)、PT延長(zhǎng)時(shí)間、HBV DNA水平和HBeAg陽(yáng)性率上均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2 兩組乙型肝炎肝硬化患者一般臨床特征情況Tab.2 General clinical characteristics of two groups of patients with hepatitis B related liver cirrhosis patients

2.2 兩組乙型肝炎肝硬化患者中HBeAg陽(yáng)性/陰性與HBV DNA水平分析 共同陽(yáng)性組中HBeAg(+)患者(50.6%，41/81)的HBV DNA值為5.46±1.99 log10IU/ml，HBeAg(–)患者HBV DNA值為4.65±1.68 log10IU/ml，共同陽(yáng)性組內(nèi)兩類患者間HBV DNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單陽(yáng)性組中HBeAg(+)患者(50.9%，85/167)的HBV DNA值明顯高于HBeAg(–)患者HBV DNA值(P＜0.001，表3)。

表3 HBeAg陽(yáng)性/陰性兩組患者HBV DNA水平分析(log10IU/ml, ±s)Tab.3 Analysis of HBV DNA level in two groups of patients with or without HBeAg (log10IU/ml, ±s)

表3 HBeAg陽(yáng)性/陰性兩組患者HBV DNA水平分析(log10IU/ml, ±s)Tab.3 Analysis of HBV DNA level in two groups of patients with or without HBeAg (log10IU/ml, ±s)

Group HBeAg (+)HBeAg (-)P value Co-existence group (n=81)5.46±1.994.67±1.64 0.06 Single positive group (n=167)5.65±2.044.39±1.90 ＜0.001

2.3 兩組乙型肝炎肝硬化患者HBV S蛋白MHR內(nèi)免疫逃逸相關(guān)變異分析 兩組患者共檢出20種MHR內(nèi)免疫逃逸相關(guān)變異(表4)，共同陽(yáng)性組中有38例(46.9%)檢出MHR變異，其中17例(21.0%)可發(fā)現(xiàn)2種或2種以上的多位點(diǎn)聯(lián)合變異，而在單陽(yáng)性組有42例(25.2%)檢出MHR變異，其中僅12例(7.2%)為多位點(diǎn)聯(lián)合變異(表5)。sL110I/S、sT113N/S、sI/T126A/N/S這3個(gè)單位點(diǎn)變異在共同陽(yáng)性組的檢出率明顯高于單陽(yáng)性組(P＜0.05)。共同陽(yáng)性組總體變異檢出率和多位點(diǎn)聯(lián)合免疫逃逸相關(guān)變異檢出率均明顯高于單陽(yáng)性組(P＜0.05，46.9% vs. 25.2%，21.0% vs. 7.2%)。

2.4 兩組患者HBV S蛋白MHR內(nèi)新增N-糖基化位點(diǎn)變異分析 共同陽(yáng)性組81例患者中，共8例(9.9%，8/81)HBV S蛋白MHR內(nèi)發(fā)生新增N-糖基化位點(diǎn)變異，其中s113-115 TST?NTT 2例、s116-118 TST?NST 1例、s131-133 TSM?NST 5例；單陽(yáng)性組167例患者中僅2例(1.2%，2/167)MHR內(nèi)發(fā)生新增N-糖基化位點(diǎn)變異，其中s116-118 TST?NST 1例、s131-133 TSM?NST 1例，共同陽(yáng)性組MHR內(nèi)新增N-糖基化位點(diǎn)變異檢出率明顯高于單陽(yáng)性組(P=0.007，9.9% vs. 1.2%，表6)。

表4 兩組患者M(jìn)HR內(nèi)免疫逃逸相關(guān)位點(diǎn)變異分析 (%)Tab.4 Analysis of immune escape related mutants in MHR of two groups of patients (%)

表5 兩組患者M(jìn)HR內(nèi)免疫逃逸相關(guān)多位點(diǎn)聯(lián)合變異情況Tab.5 Multi-immune escape related mutations in MHR of two groups of patients

表6 兩組患者M(jìn)HR內(nèi)新增N-糖基化位點(diǎn)變異分析Tab.6 Analysis of additional N-glycosylation mutations in MHR of two groups of patients

3 討 論

HBsAg/Anti-HBs共同陽(yáng)性是HBV感染后乙肝血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果中的一種特殊模式，在本研究納入的81例HBsAg/Anti-HBs共同陽(yáng)性與167例HBsAg單陽(yáng)性乙型肝炎肝硬化患者的性別、年齡構(gòu)成以及ALT、TBIL、ALB等生化指標(biāo)、PT延長(zhǎng)時(shí)間、HBV DNA載量和HBeAg陽(yáng)性率上均未見明顯差異，提示在已經(jīng)進(jìn)展至肝硬化的乙型肝炎患者中，HBsAg/Anti-HBs共同陽(yáng)性并不能提示病情嚴(yán)重程度的不同。

值得注意的是，HBeAg在臨床工作中常用于評(píng)估HBV復(fù)制的活躍程度，HBeAg(+)多意味著患者體內(nèi)HBV復(fù)制相對(duì)活躍，且在抗病毒治療過程中HBeAg轉(zhuǎn)陰也常被認(rèn)為是病情好轉(zhuǎn)的標(biāo)志之一，也是判斷抗病毒藥物停藥時(shí)機(jī)常用的參考指標(biāo)[10]，在本研究167例單陽(yáng)性患者中，HBeAg(–)患者的總體HBV DNA水平低于HBeAg(+)患者，這與臨床實(shí)際情況相符。但在共同陽(yáng)性組內(nèi)HBeAg(–)與HBeAg(+)患者的HBV DNA水平并無(wú)明顯差異，說明HBeAg這一指標(biāo)在HBsAg/Anti-HBs共同陽(yáng)性乙型肝炎肝硬化患者中反映HBV復(fù)制的能力相對(duì)較弱，提示臨床醫(yī)生在面對(duì)此類患者時(shí)要更加慎重地依靠HBeAg去判斷病情和制定診療計(jì)劃。

共同陽(yáng)性組與單陽(yáng)性組之間的HBV DNA總體水平未見明顯差異，提示在乙型肝炎肝硬化的共同陽(yáng)性患者中，Anti-HBs并不能有效地抵抗HBV感染以及中和HBsAg。HBsAg共226個(gè)氨基酸(aa)，可分為N-端(aa 1-98)、MHR(aa 99-169)和C-端(aa 170-226)，其中MHR的第124–147位氨基酸殘基又被稱為“α”決定簇，是中和抗體的主要結(jié)合靶位。已有研究表明S蛋白變異可致免疫逃逸發(fā)生，導(dǎo)致HBsAg與Anti-HBs共同陽(yáng)性[17-19]。在本課題組既往研究以及查閱的文獻(xiàn)中共報(bào)道了46種MHR內(nèi)免疫逃逸相關(guān)變異，本研究共同陽(yáng)性組內(nèi)上述免疫逃逸相關(guān)變異的檢出率以及同時(shí)有2種或2種以上的多位點(diǎn)聯(lián)合變異檢出率均明顯高于單陽(yáng)性組。其中sL110I/S、sT113N/S、sI/T126A/N/S這3種變異在共同陽(yáng)性組的發(fā)生率較單陽(yáng)性組明顯升高，提示這3個(gè)位點(diǎn)以及多位點(diǎn)聯(lián)合變異可能是導(dǎo)致共同陽(yáng)性現(xiàn)象出現(xiàn)的主要原因之一。

N-糖基化是蛋白翻譯后的一種特殊修飾方式，影響蛋白質(zhì)空間構(gòu)象，調(diào)節(jié)蛋白抗原性，過度糖基化有可能導(dǎo)致蛋白抗原表位被掩蓋，從而造成病毒的免疫逃逸。在HBV原有s146-148NCT之外的其他位點(diǎn)上出現(xiàn)NXT/S(X不為P)形式的氨基酸殘基組合，即新增N-糖基化位點(diǎn)變異。Yu等[20]的研究表明MHR內(nèi)新增N-糖基化變異是造成HBV免疫逃逸的主要原因之一。本課題組前期實(shí)驗(yàn)也證實(shí)MHR內(nèi)新增N-糖基化變異能夠使HBV抗原性改變，導(dǎo)致Anti-HBs與HBsAg結(jié)合能力下降[11]。本研究分析結(jié)果顯示，在已進(jìn)展至肝硬化的HBsAg/Anti-HBs共同陽(yáng)性乙型肝炎患者中MHR內(nèi)新增N-糖基化位點(diǎn)變異檢出率同樣明顯高于HBsAg單陽(yáng)性患者，提示在已進(jìn)展至肝硬化階段的乙型肝炎患者同樣存在因MHR內(nèi)新增N-糖基化位點(diǎn)變異所致的HBV免疫逃逸可能。Yu等[20]研究中HBsAg/Anti-HBs共同陽(yáng)性組患者新增N-糖基化變異檢出率高達(dá)21.8%，遠(yuǎn)高于本研究9.9%的檢出率，此差異可能是由于本研究所納入研究對(duì)象均為已明確進(jìn)展至乙型肝炎肝硬化的患者，而Yu等[20]的研究人群則包含慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化及乙肝相關(guān)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的患者。

因本研究為回顧性研究，所以臨床資料中腹水量、血肌酐水平等指標(biāo)難以全部獲得，故不能使用Child-Pugh、MELD等臨床評(píng)估肝硬化患者嚴(yán)重程度常用的評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步量化分析。本研究所納入患者均為核苷(酸)類似物經(jīng)治的肝硬化患者，所以更加接近臨床實(shí)踐中多數(shù)肝硬化患者病史較長(zhǎng)且經(jīng)歷過一種甚至多種抗病毒治療的實(shí)際情況，這樣所得出的結(jié)論更能夠反映真實(shí)世界的現(xiàn)實(shí)情況，但另一方面，在分析HBV變異過程中也可能存在藥物因素所致的干擾，這也是本研究的局限之一。

總之，已明確進(jìn)展至肝硬化的HBsAg/Anti-HBs共同陽(yáng)性患者的一般臨床表現(xiàn)與HBsAg單陽(yáng)性患者無(wú)明顯差異。在HBsAg/Anti-HBs共同陽(yáng)性乙型肝炎肝硬化患者中，應(yīng)謹(jǐn)慎評(píng)價(jià)HBeAg反映HBV復(fù)制活躍程度的能力。相較于HBsAg單陽(yáng)性患者，在已進(jìn)展至肝硬化的HBsAg/Anti-HBs共同陽(yáng)性患者中，HBV S蛋白MHR內(nèi)免疫逃逸相關(guān)變異檢出率更高、變異形式更加多樣、聯(lián)合變異更加復(fù)雜，且新增N-糖基化位點(diǎn)變異的檢出率也明顯升高，這些變異均可能是HBsAg/Anti-HBs共同陽(yáng)性的驅(qū)動(dòng)因素之一。當(dāng)然，乙型病毒性肝炎的總體疾病進(jìn)展是由HBV自身的活動(dòng)與宿主免疫系統(tǒng)等多種因素的動(dòng)態(tài)變化與相互作用所共同決定，本研究?jī)H在HBV病毒學(xué)方面進(jìn)行了一些探索，要全面闡明HBsAg/Anti-HBs共同陽(yáng)性的機(jī)制，仍須更進(jìn)一步深入研究。

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