劉妍，張凱，陳容娟，李奇，許智慧，思蘭蘭，藺淑梅，徐東平

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染仍然是威脅人類健康的全球性問(wèn)題。目前各相關(guān)指南將血清HBsAg消失或轉(zhuǎn)換作為HBV臨床治愈的主要指標(biāo)之一[1-3]，然而HBsAg陰性也見(jiàn)于隱匿性HBV感染(occult hepatitis B virus infection，OBI)，即通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)血清HBsAg陰性，但血清和(或)肝組織HBV DNA陽(yáng)性的一種特殊HBV感染狀態(tài)[4]。近年來(lái)研究證實(shí)OBI與HBV漏診、肝臟疾病進(jìn)展、輸血傳播、再激活及疫苗接種失敗等密切相關(guān)[4-9]。OBI發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，目前研究認(rèn)為與HBV S基因區(qū)突變有關(guān)[6,10-11]。HBV S基因編碼由226個(gè)氨基酸(aa)殘基組成的主蛋白即HBsAg，其主要親水區(qū)(MHR，aa99-169)尤其MHR區(qū)的“a”決定簇(aa124-127)是抗-HBs中和抗體結(jié)合的表位，對(duì)HBsAg抗原性具有重要意義[11]。MHR區(qū)內(nèi)發(fā)生aa替換、插入或缺失突變，可能會(huì)引入N-糖基化突變，即在原有s146-148NCT N-糖基化位點(diǎn)基礎(chǔ)上，增加NXT/S(X為P以外的任何aa殘基)新N-糖基化位點(diǎn)。我國(guó)學(xué)者于德敏等[12]研究認(rèn)為MHR區(qū)N-糖基化突變可降低抗-HBs與HBsAg的親和力，引起免疫逃逸。本研究對(duì)2例OBI患者S基因MHR區(qū)檢出的4種N-糖基化突變形式(其中M1－M3為新型突變)，分析其抗原性以及與多種HBsAg臨床檢測(cè)試劑反應(yīng)性，以期揭示S基因N-糖基化突變與OBI的關(guān)系及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 本實(shí)驗(yàn)室前期從2例OBI患者S基因MHR區(qū)檢出的4種N-糖基化突變，分別為：aa115-116“INGTST”插入突變(M1)、aa126-127“RPCMNCTI”插入突變(M2)、aa113-118 TSTTST→NST+aa131-133 TSM→NST突變(M3)和sQ129N(M4)，1例發(fā)生M1、M2和M4突變，1例發(fā)生M3突變，M1－M3為本課題組首次發(fā)現(xiàn)的新型突變。本研究采用前期構(gòu)建成功的野生型及突變型pcDNA3.1(-)/myc-His A-HBsAg重組質(zhì)粒[13-14]，用于表達(dá)HBsAg-myc-His融合蛋白。本研究經(jīng)解放軍302醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 主要試劑 真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)/myc-His A購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；轉(zhuǎn)染質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；X-tremeGENE HP轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自德國(guó)Roche公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；去糖基化酶PNGase F購(gòu)自美國(guó)NEB公司；HRP標(biāo)記的His、未標(biāo)記His及myc標(biāo)簽蛋白小鼠單克隆抗體，HBsAg馬多克隆抗體和HRP標(biāo)記的抗馬二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購(gòu)自北京全式金公司；Super Signal West Pico化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；免疫熒光染色專用8孔腔室載玻片購(gòu)自德國(guó)Ibidi公司；Cy3標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司；DyLight650標(biāo)記的山羊抗馬二抗購(gòu)自美國(guó)Bethyl公司；細(xì)胞核染液DAPI購(gòu)自北京碧云天公司；HBsAg檢測(cè)采用德國(guó)Roche公司Elecsys定量及定性試劑。美國(guó)Alpha Diagnostic International(ADI)、美國(guó)Bio-Rad、北京萬(wàn)泰和上?？迫A4個(gè)公司的ELISA試劑盒，4種試劑均通過(guò)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)批準(zhǔn)用于臨床檢測(cè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 本研究采用HepG2、Huh7肝癌細(xì)胞系。采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞傳代培養(yǎng)至最佳狀態(tài)，HepG2細(xì)胞按4×105/孔接種至6孔板，Huh7細(xì)胞按4.5×104/孔接種到8孔腔室載玻片；培養(yǎng)約20h后用X-tremeGENE HP轉(zhuǎn)染試劑將pcDNA3.1(-)/myc-His A重組質(zhì)粒按2.5:1比例(轉(zhuǎn)染試劑:重組質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染，48h或72h后處理，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 Western blotting分析突變?nèi)诤系鞍?轉(zhuǎn)染48h后收集HepG2細(xì)胞，用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰上裂解30min，離心后吸取上清，將同一份樣品分為2份，一份用沸水煮10min使蛋白充分變性，一份用去糖基化酶PNGase F按說(shuō)明書(shū)去糖基化處理；融合蛋白變性樣品及去糖基化后樣品分別用12% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉后用抗-His標(biāo)簽蛋白小鼠單克隆抗體(稀釋比例1:1000)為一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后用HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗(1:2000)室溫孵育2h，發(fā)光液顯色，在Tanon5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)一步分析。

1.3.3 激光共聚焦分析突變HBsAg抗原性 Huh7細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后棄上清，1×PBS清洗后加100μl/孔4%多聚甲醛固定20min，清洗后用0.1% Triton X-100穿孔10min，3% BSA室溫封閉2h，之后用HBsAg馬多克隆抗體(1:250)和抗-His標(biāo)簽蛋白小鼠單克隆抗體(1:1000)為一抗37℃孵育2h，清洗后加DyLight650標(biāo)記的山羊抗馬二抗(1:500)和Cy3標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(1:500)37℃避光孵育40min，然后用DAPI染核10min，再次清洗后在Olympus FV1000共聚焦顯微鏡下觀察分析結(jié)果，每個(gè)樣本捕獲至少10張不同視野下的共聚焦圖片。抗原性改變的檢測(cè)是分別用抗-HBs、抗-His檢測(cè)HBsAg-His標(biāo)簽融合蛋白，計(jì)算抗-HBs/抗-His比值，通過(guò)比較突變株與野生株的比值來(lái)評(píng)估。

1.3.4 雙抗體夾心法分析突變HBsAg抗原性HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染72h后，胰酶消化收集細(xì)胞，離心棄上清，加適量PBS、超聲裂解細(xì)胞，離心后收集上清于–80℃凍存?zhèn)溆?；用包被?0.05mol/L，pH 9.6的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液)將抗-myc標(biāo)簽蛋白小鼠單克隆抗體稀釋至10μg/ml，100μl/孔包被2個(gè)96孔ELISA板，4℃過(guò)夜；TBST清洗后用5%脫脂牛奶室溫封閉2h；清洗后每個(gè)ELISA板上樣100μl/孔野生型及突變型HBsAg-myc-His融合蛋白，37℃孵育1h；再次清洗后1個(gè)板加HRP標(biāo)記的His標(biāo)簽蛋白小鼠單克隆抗體(1:1000)，另1個(gè)板加HBsAg馬多克隆抗體(1:200)，37℃孵育1h，第2板再加HRP標(biāo)記的馬二抗(1:5000)37℃孵育30min；加HRP發(fā)光底物37℃孵育30min后加終止液終止反應(yīng)，檢測(cè)450nm處吸光度(OD)值，分別讀取HBsAg馬多克隆抗體和抗-His標(biāo)簽蛋白抗體檢測(cè)的OD值，求各樣品HBsAg/His標(biāo)簽檢測(cè)比值。每個(gè)樣品3個(gè)復(fù)孔，獨(dú)立操作至少3次。

1.3.5 HBsAg臨床檢測(cè)試劑檢出突變HBsAg能力的評(píng)估 先測(cè)定胞內(nèi)野生型及突變型HBsAg-His標(biāo)簽融合蛋白濃度，具體為采用抗-His標(biāo)簽蛋白單抗檢測(cè)野生型/突變型融合蛋白表達(dá)(Western blotting)，采用Image J軟件讀取灰度值，求出各樣品融合蛋白含量比值(即以His標(biāo)簽蛋白檢測(cè)值作為融合蛋白表達(dá)內(nèi)參，該過(guò)程重復(fù)3次求均值)，然后將野生型融合蛋白用德國(guó)Roche Elecsys試劑進(jìn)行絕對(duì)定量(IU/ml)，根據(jù)比值得出各突變樣品HBsAg-His標(biāo)簽融合蛋白濃度。隨后將各樣品稀釋為2.5、0.5、0.1ng/ml 3種濃度梯度(2IU/ml≈1ng/ml)，用Roche公司Elecsys定量及定性試劑，美國(guó)ADI和Bio-Rad、北京萬(wàn)泰及上?？迫A公司的ELISA試劑檢測(cè)HBsAg，具體過(guò)程及結(jié)果分析根據(jù)說(shuō)明書(shū)操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析或兩因素方差分析，組內(nèi)多重比較采用Dunnett t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 N-糖基化突變驗(yàn)證 Western blotting結(jié)果顯示，野生株產(chǎn)生的HBsAg-His標(biāo)簽融合蛋白由2個(gè)條帶組成，即1條固有s146-148NCT N-糖基化條帶和1條27kD非糖基化條帶(HBsAg分子量24kD，融合His和myc標(biāo)簽后增加約3kD)，而4種突變?nèi)诤系鞍拙@示3個(gè)條帶，且每增加一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，分子量增加約3kD；用去糖基化酶PNGase F去糖基化處理后，所有融合蛋白只剩余1條27kD的非糖基化條帶(圖1)。

圖1 N-糖基化突變位點(diǎn)的Western blotting分析Fig.1 Confirmation of additional N-linked glycosylation sites (Western blotting)

2.2 N-糖基化突變HBsAg抗原性分析 激光共聚焦結(jié)果(圖2A、B)顯示，與野生株相比，4種N-糖基化突變HBsAg/His標(biāo)簽的熒光強(qiáng)度比值分別降低了76.3%、53.4%、67.1%和52.7%(P＜0.00001)。雙抗體夾心法得出類似結(jié)果(圖2C)，4種N-糖基化突變HBsAg/His標(biāo)簽的OD值相對(duì)比值較野生株比值分別降低了63.8%、45.1%、45.6%和33.6%(P＜0.00001)。

2.3 HBsAg臨床檢測(cè)試劑檢測(cè)突變HBsAg 采用6種HBsAg臨床檢測(cè)試劑檢測(cè)胞內(nèi)HBsAg-His標(biāo)簽融合蛋白的結(jié)果顯示，與野生株相比，新型突變株M1、M2和M3產(chǎn)生的突變HBsAg對(duì)6種HBsAg檢測(cè)試劑反應(yīng)性均明顯降低(P＜0.05)，M4產(chǎn)生的HBsAg僅對(duì)ADI、萬(wàn)泰和科華的ELISA試劑的反應(yīng)性降低；M3的突變HBsAg對(duì)6種試劑的反應(yīng)性均降低且最明顯，突變蛋白在0.5ng/ml和0.1ng/ml 2個(gè)濃度水平不能被ADI、Bio-Rad、萬(wàn)泰及科華4種試劑檢測(cè)到，在2.5、0.5、0.1ng/ml的3個(gè)濃度水平均不能被萬(wàn)泰ELISA試劑檢測(cè)到(圖3)。

圖2 4種N-糖基化突變HBsAg抗原性分析Fig.2 Evaluation of HBsAg antigenicity of 4 N-glycosylation mutations

圖3 6種HBsAg商業(yè)檢測(cè)試劑與4種突變型及野生型融合蛋白反應(yīng)性檢測(cè)Fig.3 Detection profile of four OBI-related mutants and the wild-type against 6 commercial HBsAg detection assays

3 討 論

N-糖基化是一種重要的蛋白翻譯后修飾方式，在蛋白折疊與轉(zhuǎn)運(yùn)、免疫應(yīng)答、病毒入侵、病毒感染力及維持蛋白穩(wěn)定等多種過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。HBV S基因MHR區(qū)的“a”決定簇由半胱氨酸殘基經(jīng)二硫鍵形成兩個(gè)袢環(huán)(第1個(gè)袢環(huán)位于aa124－137，第2個(gè)袢環(huán)位于aa139－147)，該空間結(jié)構(gòu)是中和抗體抗-HBs作用的靶區(qū)域，對(duì)維持HBsAg抗原性具有重要意義。第2個(gè)袢環(huán)結(jié)構(gòu)aa146位置潛藏有一個(gè)高度保守的N-糖基化位點(diǎn)，僅在約50%的包膜蛋白中發(fā)揮作用，利于病毒包裝，并對(duì)保護(hù)決定簇結(jié)構(gòu)域免受抗-HBs影響有一定作用。目前已報(bào)道的N-糖基化位點(diǎn)主要位于aa 113、114、115、116、117、118、123、129、130、131和136，其中最常見(jiàn)的位點(diǎn)是aa115、129、130和131，以aa替換突變形式為主[12,15-17]。

本研究采用去糖基化酶PNGase F處理隱藏N-糖基化突變位點(diǎn)的樣品，并對(duì)比處理前后的Western blotting結(jié)果，以野生株和已知N-糖基化突變sQ129N作為對(duì)照，證實(shí)了M1－M3為新型N-糖基化突變，其中M2發(fā)生位點(diǎn)和突變形式為本課題組首次報(bào)道，M1、M3發(fā)生位點(diǎn)已被報(bào)道，但突變形式為本課題組首次報(bào)道。M1、M2分別在aa115－116和aa126－127之間插入aa序列“INGTST”和“RPCMNCTI”，分別形成1個(gè)新增的N-糖基化修飾，分子量增加約3kD；M3在aa113－118和aa131－133之間同時(shí)發(fā)生缺失、替換突變，形成雙N-糖基化修飾，分子量增加約6kD。

包膜蛋白每增加1次N-糖基化修飾，其分子量增加約3kD，新增N-糖基化引起HBsAg過(guò)度糖基化修飾，可能掩蓋B細(xì)胞表位，干擾HBsAg與抗-HBs識(shí)別，導(dǎo)致免疫逃逸。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，N-糖基化突變可促進(jìn)病毒分泌，減弱與中和抗體反應(yīng)性，而不影響HBsAg表達(dá)[12,16-17]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[14,18]，用Roche定量試劑檢測(cè)N-糖基化突變株轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清和胞內(nèi)HBsAg水平，均較野生株水平顯著降低。但用抗-His標(biāo)簽抗體檢測(cè)胞內(nèi)HBsAg-His標(biāo)簽融合蛋白，其表達(dá)量并未降低或輕度降低，說(shuō)明用HBsAg分泌及表達(dá)水平下降并不能很好地解釋OBI現(xiàn)象。筆者推測(cè)可能主要由于HBsAg經(jīng)新增N-糖基化修飾后，掩蓋了HBsAg抗原表位，干擾抗-HBs結(jié)合；另外新增N-糖基化修飾可能引起包膜蛋白錯(cuò)誤折疊，導(dǎo)致HBsAg空間構(gòu)象改變，不能被抗-HBs識(shí)別；二者導(dǎo)致突變HBsAg抗原性降低，不能被當(dāng)前HBsAg臨床檢測(cè)試劑有效檢出。

為闡明N-糖基化突變能否降低HBsAg抗原性，本研究采用體外表達(dá)HBsAg-His標(biāo)簽融合蛋白，融合蛋白仍具有很好的抗原性，且His標(biāo)簽不涉及抗原性、能夠較真實(shí)反映HBsAg融合蛋白實(shí)際表達(dá)水平，故將His標(biāo)簽作為內(nèi)參、用抗-His標(biāo)簽抗體檢測(cè)，該研究策略已經(jīng)在既往研究中得到驗(yàn)證[12,19]。激光共聚焦和雙抗體夾心法兩種結(jié)果顯示，N-糖基化突變M1-M4的HBsAg抗原性均較野生株顯著降低，支持我們的推測(cè)。本課題組進(jìn)一步用HBsAg臨床檢測(cè)試劑檢測(cè)野生株及4種突變株，結(jié)果顯示新型突變株M1、M2、M3對(duì)6種檢測(cè)試劑(包括德國(guó)Roche公司HBsAg定量、定性試劑)的反應(yīng)性均較野生株明顯降低，M4對(duì)3種試劑的反應(yīng)性較野生株降低；新型突變株M3對(duì)6種試劑反應(yīng)性降低且最差，突變抗原在0.5ng/ml和0.1ng/ml水平時(shí)，4種ELISA試劑均檢測(cè)失敗。業(yè)已證實(shí)M3新增2個(gè)N-糖基化修飾，研究表明隨著N-糖基化修飾數(shù)量增多，包膜蛋白呈高糖基化狀態(tài)，突變HBsAg越不容易被抗-HBs結(jié)合或識(shí)別，進(jìn)一步證實(shí)了本研究推測(cè)。

本研究有1例OBI患者(攜帶突變株M1、M2和M4)發(fā)生HBV相關(guān)的原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)。既往研究顯示前S/S基因突變與肝臟疾病尤其是HCC的進(jìn)展密切相關(guān)[9,20]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在HBsAg和抗-HBs雙陽(yáng)性患者中MHR區(qū)N-糖基化突變是HCC所謂危險(xiǎn)因素之一[21]。N-糖基化突變會(huì)降低HBsAg抗原性，導(dǎo)致免疫逃逸從而無(wú)法被機(jī)體有效清除，吏機(jī)體長(zhǎng)期處于隱匿性感染狀態(tài)，另外包膜蛋白錯(cuò)誤折疊，聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，DNA氧化損傷，可促進(jìn)肝臟疾病進(jìn)展直至發(fā)生HCC。因此本例患者攜帶的3種N-糖基化突變與其他因素共同作用，可能促使其發(fā)生HCC。

綜上所述，N-糖基化突變與OBI發(fā)生密切相關(guān)，其抗原性降低為引發(fā)OBI的主要原因，3種新型N-糖基化突變株表達(dá)的突變HBsAg顯著影響了目前臨床常用的HBsAg檢測(cè)試劑的敏感性。本研究結(jié)果對(duì)OBI發(fā)生機(jī)制提供了新認(rèn)識(shí)，為改進(jìn)HBsAg檢測(cè)試劑提供了一定理論依據(jù)。

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