段淑芳 胡江

浙江省中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科（杭州 310005）

糖尿病腎病（DN）是全球終末期腎病的主要原因，終末期腎病有54%來自糖尿病腎病［1］。糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展與炎癥反應(yīng)所致胰島素抵抗密切相關(guān)［2］。前期研究已證實，大黃酸可以通過減少尿白蛋白排泄量，減緩血肌酐水平的升高，延緩糖尿病腎病發(fā)展，但是具體機制不明確［3］。本研究通過體外實驗，觀察大黃酸對高糖誘導(dǎo)的大鼠腎臟系膜細胞（mesangial cell，MsC）凋亡率及相關(guān)信號蛋白氨基末端激酶（p-JNK）和氧化物酶體增殖體激活受體γ（PPARγ）表達的調(diào)控，闡述大黃酸延緩糖尿病腎病發(fā)展的可能機制，為糖尿病腎病防治和大黃酸的進一步開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥材及制備大黃酸（批號：20121220，純度：≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司，經(jīng)本校中藥鑒定室鑒定屬正品。大黃酸用二甲基亞砜（DMSO）溶解后，加入無血清DMEM稀釋，并經(jīng)0.22 μm過濾消毒備用。DMSO終濃度小于0.01%，以0.01%DMSO作為溶劑對照組，實驗顯示溶劑對細胞無毒性作用。

1.2 主要試劑與儀器DMEM培養(yǎng)基（GIBCO，USA）（每升含10%胎牛血清，100 U/mL的青霉素，100 μg/mL的鏈霉素，2 mmol/L的L-谷氨酰胺，100 μM的非必需氨基酸，1 mmol/L的丙酮酸，pH 7.4）；胰酶（MERCK，USA）；Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit（Bender Med System）；p-JNK（Thr183/Tyr185）（98F2）Rabbit mAb 和PPARγ（81B8）Rabbit mAb（Cell Signaling Technology，MA，USA）；GAPDH（Santa Cruz，CA，USA）。RT-PCR試劑盒（TAKARA）；PPARγ引物、BcL-2引物、β-Actin（Invitrogen）。

1.3 方法

1.3.1 大鼠MsC的體外培養(yǎng)細胞株MsC購自上海復(fù)蒙基因生物科技有限公司，低糖（5.5 mmol/L）DMEM培養(yǎng)液常規(guī)傳代保存。

1.3.2 實驗分組將生長良好的MSC調(diào)整細胞比例為2×106/培養(yǎng)皿，接種于100 mm dishes，待24 h后細胞長滿，棄上清更換為無血清培養(yǎng)基，隨機分組為：（1）正常對照組（MsC無任何誘導(dǎo)劑）；（2）模型組：MsC+高糖（30 mmol/L）DMEM培養(yǎng)基；（3）MsC+30 mmol/L高糖+大黃酸（250 μg/mL）；（4）MsC+30 mmol/L 高糖+大黃酸（125 μg/mL）；（5）MsC+30 mmol/L 高糖+大黃酸（62.5 μg/mL）。各組更換無血清培養(yǎng)基后先給與相應(yīng)濃度各中藥干預(yù)4 h，再加入終濃度為30 mmol/L的高糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)作用18 h后進行各項檢測。

1.3.3 流式細胞術(shù)流式細胞儀Annexin V/PI雙染法檢測大黃酸對高糖所致大鼠腎臟系膜細胞凋亡率的影響：然后先用0.25%的胰酶（不含EDTA）消化，1 000 r/min×5 min離心收集細胞，用PBS洗滌細胞2次，將細胞重懸于195 μL的1×Binding Buffer中，輕輕吹打混勻再轉(zhuǎn)移至5 mL的流式管中，加入5 μL Annexin V-FITC染色液和5 μL的質(zhì)量濃度為20 μg/mL的碘化丙啶（PI），混勻后室溫下避光孵育15 min，每個樣品采集約1×105個細胞，半小時內(nèi)上機檢測凋亡細胞百分比。

1.3.4 RT-PCR檢測大黃酸對高糖誘導(dǎo)的MsC相關(guān)因子PPARγ、BcL-2的基因表達cDNA擴增采用固定模式：95℃ 4 min；30個循環(huán)94℃（30 s），56℃（30 s）和72℃（30 s）；72℃ 7 min；最后一步冷卻。引物：Bcl-2的上游引物：5′-TTCTTTGAGTTCGGTGGGG-3′，下游引物：5′-TCACTTGTGGCTCAGATAGGC-3′，退火溫度56℃，擴增產(chǎn)物：387 bp。PPARγ 上游引物：5′-GGTTGATTTCTCCAGCATTTC-3′，下游引物：5′-GCTTCAATCGGATGGTTCTT-3′，退火溫度54℃，擴增產(chǎn)物311 bp。GAPDH的上游引物：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，退火溫度55 ℃，擴增產(chǎn)物405 bp。

1.3.5 Western blot半定量檢測p-JNK和PPARγ含量觀察大黃酸調(diào)控高糖所致大鼠腎臟系膜細胞凋亡的可能作用機制。在實驗各組藥物干預(yù)18 h后，棄上清加入200 μL裂解液，刮下細胞冰上裂解30 min后，12 000 r/min，4℃，離心10 min收集上清，加入等體積2×sample buffer，煮沸10 min，上樣20 μL，160 V電壓電泳60 min后，電流400 A轉(zhuǎn)膜120 min，5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗封閉過夜后，TBST洗膜5次，二抗封閉1 h，TBST洗膜5次，然后曝光。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包統(tǒng)計，計量資料各組數(shù)據(jù)均采用±s來表示，各組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細胞儀Annexin V/PI雙染法檢測大黃酸對高糖所致大鼠腎臟系膜細胞凋亡率的影響高糖誘導(dǎo)細胞凋亡率達（75.6±8.2）%與正常組（3.5±0.2）%差異明顯（P＜0.05），不同劑量大黃酸干預(yù)后分別能把細胞凋亡率降低到（30.9±2.1）%，（44.7±3.8）%，（52.1±6.0）%，與高糖模型組具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表明這三種濃度大黃酸均能有效抑制高糖所致的細胞凋亡（P＞0.05），其中尤其是大劑量組（250 μg/mL）作用最佳，存在劑量依賴關(guān)系。見圖1。

圖1 大黃酸對高糖誘導(dǎo)大鼠腎臟系膜細胞凋亡率的影響Fig.1 Effects of the Rheic acid on the apoptosis rate in rats’mesangial cells induced by high glucose

2.2 大黃酸對高糖誘導(dǎo)大鼠腎臟系膜細胞凋亡基因（Bcl-2）和氧化物酶體增殖體激活受體γ（PPARγ）的影響與正常組比較，高糖（30 mmol/L）作用于大鼠腎臟系膜細胞（MsC）后，Bcl-2、PPARγ活性被抑制（0.16±0.04vs0.82±0.07，0.23±0.04vs0.70±0.08），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。不同濃度大黃酸（250、125、62.5 μg/mL）干預(yù)后，BcL-2活性提高分別為0.65±0.06、0.59±0.04、0.27±0.03，與模型組比較均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而PPARγ活性分別提高為0.55±0.04，0.49±0.03，0.27±0.05，大黃酸（250、125 μg/mL）組與模型組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而大黃酸（62.5 μg/mL）組與模型組比較無統(tǒng)計學意義。見圖2。

圖2 大黃酸對高糖誘導(dǎo)大鼠腎臟系膜細胞Bcl-2和PPARγ的影響Fig.2 Effects of the Rheic acid on the expression of Bcl-2 and PPARγ in rats′mesangial cells induced by high glucose

2.3 大黃酸對高糖誘導(dǎo)大鼠腎臟系膜細胞相關(guān)信號蛋白氨基末端激酶（p-JNK）和氧化物酶體增殖體激活受體γ（PPARγ）的影響與正常組比較，高糖（30 mmol/L）作用于大鼠腎臟系膜細胞（MsC）后，p-JNK的表達被激活（0.92±0.07vs0.28±0.03），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。不同濃度大黃酸（250，125，62.5 μg/mL）干預(yù)后，p-JNK的表達分別被抑制為0.35±0.06，0.40±0.06，0.56±0.04，大黃酸（250，125，62.5 μg/mL）組與模型組比較均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。MsC細胞的PPARγ表達能夠被高糖顯著抑制（0.33±0.05vs0.88±0.07）（P＜0.05），不同濃度大黃酸（250，125，62.5 μg/mL）干預(yù)后，PPARγ的表達分別被提升為0.62±0.07，0.48±0.03，0.41±0.04，大黃酸（250，125 μg/mL）組與模型組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而大黃酸（62.5 μg/mL）組與模型組比較無統(tǒng)計學意義。可見大黃酸（250，125 μg/mL）可以顯著抑制被高糖激活的P-JNK活性和提高被抑制的PPARγ活性（圖3）。

圖3 大黃酸對高糖誘導(dǎo)大鼠腎臟系膜細胞p-JNK和PPARγ的影響Fig.3 Effects of the Rheic acid on the expression of p-jnk and PPAR in rats’mesangial cells induced by high glucose

3 討論

糖尿病腎?。―N）是發(fā)生終末期腎病的主要原因［1］，糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展與多種通路有關(guān)，包括多元醇途徑、晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）途徑、蛋白激酶C（PKC）、氨基己糖途徑、巨噬細胞激活、內(nèi)皮功能障礙等，而這些通路均與高糖環(huán)境下炎癥反應(yīng)導(dǎo)致胰島素作用信號缺失相關(guān)［2-3］。目前研究發(fā)現(xiàn)：炎癥級聯(lián)反應(yīng)引起胰島素抵抗，兩者共同激活體內(nèi)相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而產(chǎn)生腎小球系膜細胞表型和功能的改變，最終導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)生和持續(xù)性進展［4-5］，同時抑制2型糖尿病大鼠循環(huán)中炎癥細胞因子，可以明顯改善胰島功能，糾正蛋白尿和腎小球肥大等［6-7］。因此在糖尿病腎病干預(yù)治療中，重點是尋找安全有效的藥物，抑制炎癥反應(yīng)，從而改善胰島素抵抗，保護腎小球系膜細胞，最終預(yù)防和延緩糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。

胰島素抵抗是一種胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的缺陷狀態(tài)，其中過氧化物酶體增殖體激活受體γ（PPARγ）是胰島素作用的重要蛋白［8］，腎系膜細胞、腎小管細胞及足細胞上均存在PPARγ受體。炎癥反應(yīng)與多種信號通路有關(guān)，其中氨基末端激酶（JNK）是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員之一，是炎癥、氧化應(yīng)激引起的死亡途徑的重要組成部分，同時也與多種代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)?；罨腏NK可以通過FasL、Bim等促凋亡蛋白表達，同時抑制Bcl-2、Bcl-xL等抗凋亡蛋白表達，從而啟動凋亡進程加速腎臟損害［9］，同時JNK通路可以通過調(diào)控PPARγ的表達，抑制胰島細胞和腎小球系膜細胞凋亡，改善胰島素抵抗，延緩腎損傷［10-11］。所以研究糖尿病腎病的炎癥反應(yīng)靶基因及相關(guān)信號蛋白表達，增加胰島素敏感性，成為防治糖尿病腎病的靶點。

前期研究［12-13］已證實大黃酸可以明顯降低尿白蛋白排泄量，預(yù)防血肌酐水平的升高，延緩腎小球系膜細胞的炎癥反應(yīng)。但是具體機制不明確，限制了大黃的進一步開發(fā)和臨床循證使用。本實驗結(jié)果顯示：大黃酸可以顯著提高抗凋亡基因Bcl-2表達，減少高糖所致腎臟系膜細胞凋亡率，并且存在劑量依賴關(guān)系。同時，高糖作用于大鼠腎臟系膜細胞（MsC）后，p-JNK被激活，PPARγ被抑制，符合糖尿病的炎癥反應(yīng)后胰島素抵抗改變。大黃酸干預(yù)組（250 μg/mL和125 μg/mL）均可以有效減少p-JNK的蛋白表達，提高PPARγ的蛋白表達，而大黃酸干預(yù)組（62.5 μg/mL）能有效抑制p-JNK，但是不能提高PPARγ的基因和蛋白表達，考慮可能與改善胰島素抵抗需足量抗炎作用有關(guān)。以上結(jié)果提示大黃酸通過調(diào)控p-JNK改善PPARγ表達的作用，有效抑制腎臟系膜細胞炎癥反應(yīng)，改善胰島素抵抗，延緩糖尿病腎病發(fā)展，存在劑量依賴關(guān)系。但是欠缺阻斷PPARγ表達后觀察大黃酸對腎小球細胞細胞的作用，有待進一步觀察研究，為大黃酸對糖尿病腎病的作用機制奠定基礎(chǔ)。

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