石文龍 巫姜 李炳軍，2 李南林 凌瑞 陳江浩

1空軍軍醫(yī)大學(xué)（第四軍醫(yī)大學(xué)）西京醫(yī)院甲乳血管外科（西安710032）；2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院乳腺甲狀腺外二科（烏魯木齊830001）

在全世界范圍內(nèi)，乳腺癌（breast cancer）是女性最常見的惡性腫瘤。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌是導(dǎo)致美國(guó)婦女死亡的第2位病因。我國(guó)乳腺癌發(fā)病率較發(fā)達(dá)國(guó)家低，但人口基數(shù)大，總患病人數(shù)也相當(dāng)?shù)凝嫶蟆Ｒ虼巳橄侔┑姆乐问遣蝗莺鲆暤?。乳腺癌的發(fā)病及病情進(jìn)展與多種因素有關(guān)［1］，特別地，不同民族人群之間有所不同［2］。維吾爾族是生活在我國(guó)西北地區(qū)的最主要少數(shù)民族，其乳腺癌發(fā)病有特點(diǎn)，在病理特征上也有特異之處，具有的不良預(yù)后因素較多［3］。人類表皮生長(zhǎng)因子受體-2（HER-2）是乳腺癌預(yù)后相關(guān)因子。HER-2過(guò)表達(dá)（HER-2陽(yáng)性）的乳腺癌是一種特殊類型的亞型，該亞型惡性程度高，預(yù)后較差。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族中的重要成員，它具有抑制Caspase-9參與的內(nèi)源性凋亡途徑的作用，進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞凋亡之目的。本研究旨在分析HER-2陽(yáng)性及陰性的維吾爾族乳腺癌患者Survivin和Caspase-9表達(dá)差異并分析其相關(guān)性。初步探明Survivin和Caspase-9兩基因在維吾爾族不同HER-2表型乳腺癌發(fā)病中可能存在的作用及機(jī)制，為乳腺癌發(fā)病機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料實(shí)驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，選取2014年6月至2016年12月在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院及西京醫(yī)院初次確診為乳腺癌的維吾爾族女性患者為研究對(duì)象，經(jīng)免疫組化或FISH檢查確定HER-2表達(dá)情況共72例，其中HER-2陽(yáng)性39例（A組），HER-2陰性33例（B組），年齡33～67歲。以病理確診為良性病變的40例維吾爾族女性患者為正常對(duì)照（C組），年齡28～62歲。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)倫理委員會(huì)審查通過(guò)，患者簽署知情同意書。其中早期浸潤(rùn)癌19例，浸潤(rùn)性特殊癌17例，浸潤(rùn)性非特殊癌26例。按國(guó)際抗癌聯(lián)盟TNM分期：Ⅰ期3例，Ⅱ期38例，Ⅲ期27例，Ⅳ期4例。兩組患者在年齡、病理分型及病變分期等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），具有可比性。見表1。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：病理確診為乳腺癌的維吾爾族女性患者，且明確診斷HER-2表達(dá)為陽(yáng)性者；HER-2確診標(biāo)準(zhǔn)：（1）免疫組化HER-2（3+）為陽(yáng)性；（2）HER-2 FISH檢測(cè)比值 ＞ 2.2者；（3）免疫組化檢查HER-2（1+或-）為陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：入組前已行化療、免疫或生物治療等系統(tǒng)治療；非女性患者；非首次確診及診治的患者。

1.3 試劑與儀器反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR GreenⅠreal-time PCR試劑盒（日本Takara），Trizol Reagent（美國(guó)Invitrogen），DEPC（美國(guó)Sigma），PCR產(chǎn)物純化試劑盒（北京TIANGEN），一抗工作液：兔抗人Survivin多克隆抗體和兔抗人Caspase-9多克隆抗體（美國(guó)Santa-Cruz），羊抗兔二抗及DAB染色試劑盒（北京中杉金橋）。

表1 HER-2陽(yáng)性患者及HER-2陰性組患者基本情況Tab.1 Condition of HER-2 Positive patients and the HER-2 Negative group 例

Real-time RT-qPCR儀（CFX96TM，美國(guó)BIORAD），低溫高速離心機(jī)（美國(guó)BIO-RAD），蛋白電泳儀（美國(guó)BIO-RAD），PCR儀（C1000TM，美國(guó)BIO-RAD），凝膠成像儀（美國(guó)BIO-RAD）核酸蛋白測(cè)定儀（NanoDrop1000，美國(guó)Thermo）。

1.4 標(biāo)本采集及處理采集術(shù)前微創(chuàng)穿刺或者術(shù)后腫瘤組織，一分為二，其中一份迅速經(jīng)液氮冷凍后轉(zhuǎn)至超低溫冰箱中保存。另外一份經(jīng)10%甲醛溶液固定。

1.5 real-time RT-PCR檢測(cè)Survivin和Caspase-9表達(dá)取冰凍組織50 g，于液氮中迅速研磨，采用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，分別檢測(cè)Survivin和Caspase-9基因的表達(dá)；引物由大連寶生物公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列見表2。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95.0℃/3 min，變性95.0℃/10 s，退火30 s，Survivin、Caspase-9和 β-actin退火溫度分別58.6、61.2和53.9℃，分別38個(gè)循環(huán)；實(shí)驗(yàn)以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行數(shù)據(jù)分析［1］。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Tab.2 Real-time quantitative PCR primer sequences

1.6 免疫組化檢測(cè)Survivin和Caspase-9表達(dá)取固定好的組織標(biāo)本，石蠟包埋切片，免疫組化染色，具體參考課題組前期實(shí)驗(yàn)步驟［1］。實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。兩位病理科高年資醫(yī)生，采取雙盲法在400倍下隨機(jī)選擇5個(gè)不重復(fù)視野，Survivin和Caspase-9表達(dá)以細(xì)胞漿或（和）細(xì)胞膜被染成棕黃色或黃色者定義為陽(yáng)性細(xì)胞，讀取染色深度（0分為陰性，1分弱陽(yáng)性，2分中等強(qiáng)度陽(yáng)性，3分為強(qiáng)陽(yáng)性）和面積（0分：＜5%，1分：5%～24%，2分：25%～50%，3分：51%～75%，4分：＞75%）。兩者賦分乘積大于1分定義為陽(yáng)性［1］。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析，計(jì)量資料用±s表示，多組分析用方差分析，進(jìn)一步組間比較用LSD檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 real-time RT-PCR檢測(cè)Survivin mRNA結(jié)果Survivin/β-actin比值作為相對(duì)表達(dá)量，在3組組織中均有一定表達(dá)，但表達(dá)各有差異（F=3.08，P＜0.05）。A組與B組比較，A組與C組比較，Survivin表達(dá)均增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。B組與C組比較，Survivin表達(dá)前者略高，但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3、圖1。

表3 Survivin mRNA在維吾爾族乳腺癌與正常對(duì)照組中的表達(dá)Tab.3 Expression of Survivin mRNA in Uygur ethnic breast cancer and control group ±s

表3 Survivin mRNA在維吾爾族乳腺癌與正常對(duì)照組中的表達(dá)Tab.3 Expression of Survivin mRNA in Uygur ethnic breast cancer and control group ±s

分組HER-2陽(yáng)性組（A組）HER-2陰性組（B組）對(duì)照組(C組)例數(shù)39 33 40 Survivin/β-actin(×10-5)1.135±0.581 1.036±0.461 0.495±0.321 F值3.08＜0.05 P值

2.2 real-time RT-PCR檢測(cè)Caspase-9 mRNA結(jié)果Caspase-9/β-actin比值作為相對(duì)表達(dá)量，在各組中均有一定表達(dá)，但表達(dá)各有差異（F=3.01，P＜0.05）。A組與B組比較，A組與C組比較，Caspase-9表達(dá)均減弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。B組與C組比較，Caspase-9表達(dá)前者略低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4、圖2。

2.3 免疫組化檢測(cè)Survivin蛋白表達(dá)結(jié)果根據(jù)免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，Survivin蛋白在各組組織中均有一定表達(dá)，其表達(dá)量不全相同（χ2=32.409，P＜0.001）。A組與B性組比較，A組與C組比較，Survivin表達(dá)均增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。B組與C組比較，Survivin表達(dá)前者略高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5、圖3。

圖1 Survivin在維吾爾族不同HER-2表達(dá)狀態(tài)乳腺癌組織中表達(dá)的PCR結(jié)果圖Fig.1 PCR results of Survivin expression of different HER-2 status in Uighur breast cancer

表4 Caspase-9 mRNA在維吾爾族乳腺癌與正常對(duì)照組中的表達(dá)Tab.4 Expression of Caspase-9 mRNA in Uygur ethnic breast cancer and Control group ±s

表4 Caspase-9 mRNA在維吾爾族乳腺癌與正常對(duì)照組中的表達(dá)Tab.4 Expression of Caspase-9 mRNA in Uygur ethnic breast cancer and Control group ±s

分組HER-2陽(yáng)性組（A組）HER-2陰性組（B組）對(duì)照組（C組）例數(shù)39 33 40 Caspase-9/β-actin(×10-6)7.374±0.803 8.325±0.898 8.472±0.926 F值P值3.01＜0.05

圖2 Caspase-9在維吾爾族不同HER-2表達(dá)狀態(tài)乳腺癌組織中表達(dá)的PCR結(jié)果圖Fig.2 PCR results of Caspase-9 expression of different HER-2 status in Uighur breast cancer

2.4 免疫組化檢測(cè)Caspase-9結(jié)果根據(jù)免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，Caspase-9蛋白在各組組織中都有一定表達(dá)，其表達(dá)量不全相同（χ2=29.843，P＜0.001）。A組與B組比較，Caspase-9表達(dá)均減弱，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。A組與C組比較，Caspase-9表達(dá)減弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。B組與C組比較，Caspase-9表達(dá)前者低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表6、圖4。

表5 免疫組化檢測(cè)Survivin表達(dá)情況Tab.5 Immunohistochemical detection of Survivin expression例

2.5 Survivin和Caspase-9基因的相關(guān)性分析對(duì)納入實(shí)驗(yàn)的新疆維吾爾族婦女HER-2陽(yáng)性乳腺癌患者進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，real-time RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示Survivin和Caspase-9表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.648，P＜0.01，表7）。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示Survivin和Caspase-9表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.581，P＜0.05）。見表8。

圖3 Survivin在乳腺癌組織中表達(dá)的IHC結(jié)果圖（SP×400）Fig.3 IHC results of Survivin expression in breast cancer（SP × 400）

圖4 Caspase-9在乳腺癌組織中表達(dá)的IHC結(jié)果圖（SP×400）Fig.4 IHC results of Caspase-9 expression in breast cancer（SP × 400）

表6 免疫組化檢測(cè)Caspase-9表達(dá)情況Tab.6 Immunohistochemical detection of Caspase-9 expression 例

表7 HER-2陽(yáng)性患者Survivin和Caspase-9的相關(guān)性（real-time RT-PCR）Tab.7 Correlation between Survivin and Caspase-9 of HER-2 positive patients（real-time RT-PCR） 例

3 討論

乳腺癌為乳腺腺上皮來(lái)源的惡性腫瘤，作為 女性的多發(fā)癌，是威脅她們身心健康的癌腫之首，也是女性最常見的惡性腫瘤之一。乳腺癌的發(fā)生與患者的遺傳背景、生活環(huán)境等因素有著密切的關(guān)系。在我國(guó)不同種族和（或）地區(qū)之間，其發(fā)病率和預(yù)后有所不同［2］。維吾爾族是我國(guó)西北地區(qū)主要的少數(shù)民族之一，具有人口眾多、婚配大多局限本民族等特點(diǎn)。維吾爾族女性乳腺癌的發(fā)病與其他種族人群相比，既有共性也有特性。然而，維吾爾族人群乳腺癌的具體發(fā)病機(jī)制及特點(diǎn)目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道［2，4-5］。

表8 HER-2陽(yáng)性患者Survivin和Caspase-9的相關(guān)性（免疫組化）Tab.8 Correlation between Survivin and Caspase-9 of HER-2 positive patients（Immunohistochemistry） 例

HER-2在正常人體的細(xì)胞膜表面也有HER-2蛋白的表達(dá)；由于HER-2蛋白可以參與信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)及分裂；因此，當(dāng)乳腺癌細(xì)胞HER-2過(guò)表達(dá)時(shí)，其信號(hào)可刺激癌細(xì)胞的不斷生長(zhǎng)或增加癌細(xì)胞的侵襲性，進(jìn)而使得乳腺癌患者的病情快速進(jìn)展，最終導(dǎo)致不良的預(yù)后。因此，HER-2或是判斷乳腺癌預(yù)后因素的指標(biāo)之一［6］，也是研究乳腺癌發(fā)病及治療的重要環(huán)節(jié)之一。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族成員之一。具有對(duì)抗細(xì)胞周期G2～M期凋亡的誘導(dǎo)［7］作用，同時(shí)有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)血管生成的作用［8］。其具有腫瘤特異性，在正常分化成熟組織中很少表達(dá)，當(dāng)癌變時(shí)，其表達(dá)增加。因此Survivin主要表達(dá)于癌組織表面，被認(rèn)為是惡性腫瘤診斷和治療的良好指標(biāo)和靶點(diǎn)［8-9］。GUZMAN 等［10］和管海濤等［11］研究表明：乳腺癌等癌變組織中Survivin基因表達(dá)增強(qiáng)。Survivin表達(dá)下調(diào)反而可誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡［12］。本研究結(jié)果顯示：免疫組化和real-time RT-PCR結(jié)果均顯示，HER-2陽(yáng)性組、HER-2陰性組Survivin基因表達(dá)均強(qiáng)于對(duì)照組。而進(jìn)一步分析顯示：HER-2陽(yáng)性組較HER-2陰性組Survivin基因表達(dá)增強(qiáng)；而HER-2陰性組也較正常對(duì)照組表達(dá)增強(qiáng)，但差異沒(méi)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果顯示：維吾爾族HER-2陽(yáng)性乳腺癌組織中Survivin基因高表達(dá)，這與GUZMAN等［13］及阿衣夏木古麗等［1］報(bào)道一致。這也初步說(shuō)明Survivin高表達(dá)可能在促進(jìn)維吾爾族HER-2陽(yáng)性乳腺癌變過(guò)程中起著一定的促進(jìn)作用。當(dāng)然這需要進(jìn)一步的研究進(jìn)行證實(shí)。

ZUMBR?GEL等［14］發(fā)現(xiàn)Survivin作為生存素，其抗凋亡作用是主要是通過(guò)抑制Caspase-9的作用參與的內(nèi)源性凋亡途徑而實(shí)現(xiàn)的。具體機(jī)制是Survivin基因可直接參與并抑制凋亡終末效應(yīng)酶Caspase3和Caspase7的活性［15］；然而這二者的活化可以由由活化后的Caspase-9所誘導(dǎo)［16］。在凋亡終末效應(yīng)酶誘導(dǎo)的整個(gè)凋亡過(guò)程中，Caspase-9與Survivin則表現(xiàn)為抑制的效應(yīng)［17］。本研究在免疫組化和real-time RT-PCR的結(jié)果均顯示：HER-2陽(yáng)性組、HER-2陰性組Caspase-9基因表達(dá)均低于正常對(duì)照組。這與張丙信等［18］的研究結(jié)果有相似之處。進(jìn)一步分析，real-time RT-PCR結(jié)果表明：HER-2陽(yáng)性組較HER-2陰性組Caspase-9基因表達(dá)減弱；而HER-2陰性組較對(duì)照組Caspase-9基因表達(dá)略低，差異沒(méi)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化結(jié)果卻顯示：HER-2陽(yáng)性組、HER-2陰性組與正常對(duì)照組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。分析兩種試驗(yàn)方法檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，在新疆維吾爾族婦女HER-2陽(yáng)性乳腺癌患者中，Survivin基因表達(dá)增強(qiáng)，Caspase-9基因表達(dá)減弱，Survivin和Caspase-9基因呈負(fù)相關(guān)；根據(jù)如上研究結(jié)果可初步說(shuō)明，Survivin基因可能通過(guò)抑制Caspase-9基因的激活，從而導(dǎo)致維吾爾族女性HER-2陽(yáng)性乳腺癌的發(fā)生。但結(jié)果不是很明確，究其原因，一方面可能和納入研究的樣本數(shù)量較少有一定關(guān)系；另一方面，也可能是Caspase-9在維吾爾族HER-2陽(yáng)性及HER-2陰性乳腺癌發(fā)病過(guò)程中差異不明顯，但是其具體機(jī)制這需要進(jìn)一步的深入研究得以證實(shí)。

終上所述，Survivin基因作為抑制凋亡發(fā)生的重要因子之一，可能在維吾爾族女性HER-2陽(yáng)性乳腺癌發(fā)病過(guò)程中中起著潛在的促進(jìn)作用，主要通過(guò)該基因過(guò)表達(dá)發(fā)揮其促進(jìn)作用。研究還顯示，Caspase-9基因通過(guò)低表達(dá)在維吾爾族HER-2陽(yáng)性乳腺癌中也起到促進(jìn)作用，且二者可能存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。當(dāng)然，本研究尚處于基礎(chǔ)的階段，二者的確實(shí)關(guān)系需要進(jìn)一步明確。這需要在進(jìn)一步在兩基因相互作用機(jī)制中更加深入和更廣的研究；以探明Survivin和Caspase-9基因在維吾爾族HER-2陽(yáng)性乳腺癌中的意義，為乳腺癌的發(fā)病機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

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