劉志強(qiáng),王博龍
(宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院,江西,宜春 336000)
表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)是原癌基因c-erbB1編碼表達(dá)的一種酪氨酸激受體[1],廣泛分布在人類各種腫瘤細(xì)胞中,其過度表達(dá)或自我激活能促進(jìn)腫瘤增殖、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移[2-3]。研究證明[4-5],EGFR功能的異常,能導(dǎo)致卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌、鼻咽癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。隨著腫瘤分子生物學(xué)和靶向藥物研究的深入,表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)類藥物已成為腫瘤治療的研究熱點(diǎn)[6]。2003年,美國(guó) FDA批準(zhǔn)第一代EGFR-TKI吉非替尼上市,推薦它為晚期非小細(xì)胞肺癌治療的一線標(biāo)準(zhǔn)藥物之一[7-8]。此外,厄洛替尼、埃克替尼、拉帕提尼以及單抗類EGFR-TKI藥物也取得了令人滿意的臨床抗腫瘤療效[9]。
盡管EGFR-TKI的出現(xiàn)使過去許多不能治療的惡性腫瘤得到了有效控制,但現(xiàn)存藥物仍存在毒副作用以及耐藥性等問題,因此開發(fā)新一代高效低毒的EGFR-TKI勢(shì)在必行。中醫(yī)藥抗腫瘤具有效果好、安全、副作用小等優(yōu)點(diǎn),從傳統(tǒng)中藥提取抗腫瘤有效成分已經(jīng)得到國(guó)際認(rèn)可[10]。已知首次被報(bào)道的中藥小分子EGFR-TKI是槲皮素和金雀異黃酮(染料木黃酮),兩者除具有抑制 EGFR作用外,還能通過其他多種機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞增殖[11]。此后,任偉光等[12]發(fā)現(xiàn)艾葉乙酸乙酯提取物中芹菜素、棕矢車菊素、木犀草素、槲皮素等成分具有抑制EGFR激酶的活性。本研究基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP)挖掘中藥小分子EGFR-TKI,運(yùn)用反向分子對(duì)接技術(shù)對(duì)中藥小分子進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)性驗(yàn)證,并系統(tǒng)闡述中藥小分子EGFR-TKI的研究現(xiàn)狀,為進(jìn)一步研究中藥小分子EGFR-TKI提供線索與參考。
(1)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)TCMSP(http: // ibts. hkbu. edu. hk/ LSP/ tcmsp.php)。TCMSP是由西北農(nóng)林科技大學(xué)開發(fā)的中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái),其通過文獻(xiàn)挖掘和數(shù)據(jù)庫(kù)整合,得到500味常用中藥、30069個(gè)中藥化合物的藥物代謝動(dòng)力學(xué)、藥物化學(xué)和藥物-靶標(biāo)蛋白網(wǎng)絡(luò)-疾病網(wǎng)絡(luò)的基本信息[13]。(2)反向分子對(duì)接服務(wù)器 DRAR-CPI(https: // cpi. bio-x. cn/ drar/)。DRAR-CPI是上海交通大學(xué)Bio-X研究所楊輪博士等[14]采用的 DOCK中的算法,通過重疊球體定義受體分子潛在結(jié)合位點(diǎn),將藥物分子與多個(gè)蛋白結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行反向?qū)臃?wù)器,主要用于藥物?靶蛋白相互作用的模擬研究。服務(wù)器采用Z變換將對(duì)接分?jǐn)?shù)Docking scores變換為綜合分?jǐn)?shù)Z'-score,以提高模擬表示準(zhǔn)確性,規(guī)定Z'-score<-0.5時(shí)化合物與靶點(diǎn)有潛在結(jié)合的可能性。
挖掘TCMSP中以EGFR為靶點(diǎn)的中藥小分子化合物,將標(biāo)注為“Validated”的已驗(yàn)證中藥小分子統(tǒng)一保存為 mol2格式。查閱相關(guān)文獻(xiàn)與數(shù)據(jù)庫(kù)核對(duì)化合物 CAS號(hào)碼與結(jié)構(gòu)等基本信息,確保分子準(zhǔn)確無誤。在DRAR-CPI服務(wù)器進(jìn)行反向分子對(duì)接,研究篩選化合物能否與EGFR結(jié)合成功,以及兩者結(jié)合強(qiáng)度如何,并與吉非替尼進(jìn)行比較分析。
TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)包含的 EGFR-TKI且標(biāo)注為“Validated”的已驗(yàn)證中藥小分子共有7個(gè),其基本信息見表1。
表1 中藥小分子基本信息Table 1 Information of small molecules from Chinese medicine
首先以已上市的EGFR-TKI吉非替尼為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行在DRAR-CPI服務(wù)器反向分子對(duì)接,觀察吉非替尼與EGFR的結(jié)合分?jǐn)?shù),結(jié)果如圖1、表2所示,兩者結(jié)合強(qiáng)度良好(為-1.12227)。然后以挖掘得到的 7個(gè)中藥小分子 EGFR-TKI為研究對(duì)象,在DRAR-CPI進(jìn)行反向分子對(duì)接,試驗(yàn)結(jié)果顯示木犀草素、槲皮素、金雀異黃酮、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、漆黃素5種中藥小分子EGFR-TKI在DRAR-CPI服務(wù)器可以與EGFR靶蛋白結(jié)合,且符合服務(wù)器規(guī)定的<-0.5要求,而煙堿、N-反式-對(duì)香豆酰酪胺 2種中藥小分子與EGFR靶蛋白結(jié)合,Z'-score≥-0.5,不符合服務(wù)器規(guī)定要求。7種中藥小分子按Z'-score排名見表2。7種中藥小分子與EGFR靶蛋白三維模擬結(jié)合見圖2~8。雖然吉非替尼結(jié)合分?jǐn)?shù)沒有前5種中藥小分子高,但由于反向分子對(duì)接仍處于初級(jí)階段,加上藥物在體內(nèi)的實(shí)際代謝過程十分復(fù)雜,故5種中藥小分子與EGFR結(jié)合強(qiáng)度以及抗腫瘤效果,仍需大量實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。
圖1 吉非替尼與EGFRFig.1 Gefitinib and EGFR
圖2 木犀草素與EGFRFig.2 Luteolin and EGFR
圖3 漆黃素與EGFRFig.3 Fisetin and EGFR
表2 反向分子對(duì)接結(jié)果Table 2 The results of reverse molecular docking
圖4 金雀異黃酮與EGFRFig.4 Genistein and EGFR
圖5 表沒食子兒茶素沒食子酸酯與EGFRFig.5 Epigallocatechin-3-gallate and EGFR
圖6 槲皮素與EGFRFig.6 Quercetin and EGFR
圖7 N-反式-對(duì)香豆酰酪胺與EGFRFig.7 n-Coumaroyltyramine and EGFR
圖8 煙堿與EGFRFig.8 Nicotine and EGFR
已知類藥性(Drug-likeness,DL)是指分子包含的化學(xué)結(jié)構(gòu)與大多數(shù)藥物有相似的物理特征。據(jù)報(bào)道[13],一般DL>0.18時(shí)具有良好的成藥性,而口服利用度(Oral bioavailability,OB)>30%的分子具有較好的成藥可能。另外,根據(jù)Lipinski成藥性原則可知化合物的分子量(Molecular Weight,MW)小于500Da,脂水分配系數(shù)對(duì)數(shù)AlogP在-2到5之間,最有可能成為口服藥物。表3為反向分子對(duì)接結(jié)果 Z'-score<-0.5的 5種中藥小分子EGFR-TKI藥物代謝動(dòng)力學(xué)相關(guān)參數(shù),由表可知除金雀異黃酮OB稍低外,均符合以上成藥性規(guī)則,說明5種中藥小分子均有較好的開發(fā)利用前景。
表3 藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)表Table 3 Pharmacokinetic parameters
本研究對(duì)TCMSP中30069個(gè)中藥化合物進(jìn)行發(fā)掘整理,發(fā)現(xiàn)其中木犀草素、槲皮素、金雀異黃酮、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、漆黃素、煙堿、N-反式-對(duì)香豆酰酪胺等7種小分子具有抑制EGFR的作用。進(jìn)一步用DRAR-CPI服務(wù)器對(duì)其進(jìn)行預(yù)測(cè)驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)木犀草素、槲皮素、金雀異黃酮、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、漆黃素5種中藥小分子與EGFR結(jié)合強(qiáng)度較好。木犀草素為黃酮類化學(xué)物質(zhì),具有抗腫瘤、抗菌消炎、保護(hù)心臟等多種藥理作用[14-15]。隋佳琪[16]用 Western blot法檢測(cè)木犀草素對(duì)表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal growth factor,EGF)誘導(dǎo)的EGFR蛋白磷酸化水平,結(jié)果表明EGF能明顯促進(jìn) EGFR蛋白磷酸化水平,而木犀草素能夠顯著地抑制 EGF誘導(dǎo)的EGFR磷酸化。洪專[17]通過體內(nèi)、外研究發(fā)現(xiàn),木犀草素不僅能夠下調(diào)L858R/T790M突變型EGFR磷酸化水平,還能夠抑制HSP90蛋白伴侶的活性,從多個(gè)靶點(diǎn)促進(jìn)EGFR繼發(fā)突變型肺癌細(xì)胞的凋亡,表明木犀草素具有治療EGFR繼發(fā)T790M突變型非小細(xì)胞肺癌的可能。
槲皮素因具有止咳、抗炎、抗氧化、治療腫瘤的作用[18-19]日益受到人們的重視。吳波等[20]發(fā)現(xiàn)槲皮素和大黃素對(duì)VEGFR、FGFR、EGFR等蛋白活性有顯著的抑制作用;向廷秀等[21]發(fā)現(xiàn)槲皮素能下調(diào)HSP70和EGFR的表達(dá),抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng),呈時(shí)間劑量依賴性;李士坤等[22]的研究表明槲皮素可下調(diào)作為腫瘤細(xì)胞惡性程度生物學(xué)指標(biāo)的PCNA,EGFR,VEGF,c-myc的表達(dá),對(duì)人食管癌Eca-109細(xì)胞具有誘導(dǎo)分化效應(yīng)。以上研究均證實(shí)槲皮素具有良好的EGFR抑制作用。目前,關(guān)于金雀異黃酮抗腫瘤藥理研究也有了一定進(jìn)展。袁江蘭[23]等AUTODOCK 3.05分子對(duì)接軟件探究了金雀異黃酮與EGFR的相互作用機(jī)制,結(jié)果表明兩者結(jié)合自由能為-31.2 kJ/mol可發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用,而試驗(yàn)[24]也證實(shí)了金雀異黃酮可通過抑制EGFR的磷酸化,進(jìn)而阻止肝癌細(xì)胞的增殖。
大量研究[25]表明表沒食子兒茶素沒食子酸酯作用的抗腫瘤靶點(diǎn)很多,例如各種受體、酶和細(xì)胞因子等,其中EGFR、VEGFR是其最重要的抗腫瘤靶點(diǎn)之一。陳麗莉等[26]發(fā)現(xiàn)表沒食子兒茶素沒食子酸酯可通過影響膜受體EGFR、67LR引起下游一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)抑制腫瘤細(xì)胞增殖。漆黃素又名非瑟酮,可通過誘導(dǎo)凋亡、影響信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)、抑制增殖、抑制遷移和侵襲等方面發(fā)揮抗腫瘤作用。研究表明漆黃素抑制腫瘤細(xì)胞的COX-2、Wnt、EGFR通路,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制結(jié)腸癌的生長(zhǎng)[27]。以上文獻(xiàn)說明表沒食子兒茶素沒食子酸酯和漆黃素作為中藥小分子 EGFR-TKI抗腫瘤作用顯著。
以上報(bào)道與本研究結(jié)果相互補(bǔ)充,表明木犀草素、槲皮素、金雀異黃酮、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、漆黃素等中藥小分子EGFR-TKI能直接或間接抑制EGFR的表達(dá),從多個(gè)靶點(diǎn)、多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散,具有良好的抗腫瘤效果。同時(shí)也表明利用中藥小分子開發(fā)新一代多靶點(diǎn)EGFR-TKI具有廣闊的前景。
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