劉志強，王博龍

（宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西，宜春 336000）

表皮生長因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）是原癌基因c-erbB1編碼表達的一種酪氨酸激受體[1]，廣泛分布在人類各種腫瘤細(xì)胞中，其過度表達或自我激活能促進腫瘤增殖、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移[2-3]。研究證明[4-5]，EGFR功能的異常，能導(dǎo)致卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌、鼻咽癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。隨著腫瘤分子生物學(xué)和靶向藥物研究的深入，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）類藥物已成為腫瘤治療的研究熱點[6]。2003年，美國 FDA批準(zhǔn)第一代EGFR-TKI吉非替尼上市，推薦它為晚期非小細(xì)胞肺癌治療的一線標(biāo)準(zhǔn)藥物之一[7-8]。此外，厄洛替尼、埃克替尼、拉帕提尼以及單抗類EGFR-TKI藥物也取得了令人滿意的臨床抗腫瘤療效[9]。

盡管EGFR-TKI的出現(xiàn)使過去許多不能治療的惡性腫瘤得到了有效控制，但現(xiàn)存藥物仍存在毒副作用以及耐藥性等問題，因此開發(fā)新一代高效低毒的EGFR-TKI勢在必行。中醫(yī)藥抗腫瘤具有效果好、安全、副作用小等優(yōu)點，從傳統(tǒng)中藥提取抗腫瘤有效成分已經(jīng)得到國際認(rèn)可[10]。已知首次被報道的中藥小分子EGFR-TKI是槲皮素和金雀異黃酮（染料木黃酮），兩者除具有抑制 EGFR作用外，還能通過其他多種機制抑制腫瘤細(xì)胞增殖[11]。此后，任偉光等[12]發(fā)現(xiàn)艾葉乙酸乙酯提取物中芹菜素、棕矢車菊素、木犀草素、槲皮素等成分具有抑制EGFR激酶的活性。本研究基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）挖掘中藥小分子EGFR-TKI，運用反向分子對接技術(shù)對中藥小分子進行靶點預(yù)測性驗證，并系統(tǒng)闡述中藥小分子EGFR-TKI的研究現(xiàn)狀，為進一步研究中藥小分子EGFR-TKI提供線索與參考。

1 材料與方法

1.1 服務(wù)器與軟件

（1）中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺TCMSP（http: // ibts. hkbu. edu. hk/ LSP/ tcmsp.php）。TCMSP是由西北農(nóng)林科技大學(xué)開發(fā)的中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺，其通過文獻挖掘和數(shù)據(jù)庫整合，得到500味常用中藥、30069個中藥化合物的藥物代謝動力學(xué)、藥物化學(xué)和藥物-靶標(biāo)蛋白網(wǎng)絡(luò)-疾病網(wǎng)絡(luò)的基本信息[13]。（2）反向分子對接服務(wù)器 DRAR-CPI（https: // cpi. bio-x. cn/ drar/）。DRAR-CPI是上海交通大學(xué)Bio-X研究所楊輪博士等[14]采用的 DOCK中的算法，通過重疊球體定義受體分子潛在結(jié)合位點，將藥物分子與多個蛋白結(jié)合位點進行反向?qū)臃?wù)器，主要用于藥物?靶蛋白相互作用的模擬研究。服務(wù)器采用Z變換將對接分?jǐn)?shù)Docking scores變換為綜合分?jǐn)?shù)Z'-score，以提高模擬表示準(zhǔn)確性，規(guī)定Z'-score＜-0.5時化合物與靶點有潛在結(jié)合的可能性。

1.2 研究方法

挖掘TCMSP中以EGFR為靶點的中藥小分子化合物，將標(biāo)注為“Validated”的已驗證中藥小分子統(tǒng)一保存為 mol2格式。查閱相關(guān)文獻與數(shù)據(jù)庫核對化合物 CAS號碼與結(jié)構(gòu)等基本信息，確保分子準(zhǔn)確無誤。在DRAR-CPI服務(wù)器進行反向分子對接，研究篩選化合物能否與EGFR結(jié)合成功，以及兩者結(jié)合強度如何，并與吉非替尼進行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 中藥小分子EGFR-TKI的挖掘

TCMSP數(shù)據(jù)庫包含的 EGFR-TKI且標(biāo)注為“Validated”的已驗證中藥小分子共有7個，其基本信息見表1。

表1 中藥小分子基本信息Table 1 Information of small molecules from Chinese medicine

2.2 靶點預(yù)測

首先以已上市的EGFR-TKI吉非替尼為標(biāo)準(zhǔn)進行在DRAR-CPI服務(wù)器反向分子對接，觀察吉非替尼與EGFR的結(jié)合分?jǐn)?shù)，結(jié)果如圖1、表2所示，兩者結(jié)合強度良好（為-1.12227）。然后以挖掘得到的 7個中藥小分子 EGFR-TKI為研究對象，在DRAR-CPI進行反向分子對接，試驗結(jié)果顯示木犀草素、槲皮素、金雀異黃酮、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、漆黃素5種中藥小分子EGFR-TKI在DRAR-CPI服務(wù)器可以與EGFR靶蛋白結(jié)合，且符合服務(wù)器規(guī)定的＜-0.5要求，而煙堿、N-反式-對香豆酰酪胺 2種中藥小分子與EGFR靶蛋白結(jié)合，Z'-score≥-0.5，不符合服務(wù)器規(guī)定要求。7種中藥小分子按Z'-score排名見表2。7種中藥小分子與EGFR靶蛋白三維模擬結(jié)合見圖2～8。雖然吉非替尼結(jié)合分?jǐn)?shù)沒有前5種中藥小分子高，但由于反向分子對接仍處于初級階段，加上藥物在體內(nèi)的實際代謝過程十分復(fù)雜，故5種中藥小分子與EGFR結(jié)合強度以及抗腫瘤效果，仍需大量實驗進一步驗證。

圖1 吉非替尼與EGFRFig.1 Gefitinib and EGFR

圖2 木犀草素與EGFRFig.2 Luteolin and EGFR

圖3 漆黃素與EGFRFig.3 Fisetin and EGFR

表2 反向分子對接結(jié)果Table 2 The results of reverse molecular docking

圖4 金雀異黃酮與EGFRFig.4 Genistein and EGFR

圖5 表沒食子兒茶素沒食子酸酯與EGFRFig.5 Epigallocatechin-3-gallate and EGFR

圖6 槲皮素與EGFRFig.6 Quercetin and EGFR

圖7 N-反式-對香豆酰酪胺與EGFRFig.7 n-Coumaroyltyramine and EGFR

圖8 煙堿與EGFRFig.8 Nicotine and EGFR

2.3 結(jié)果分析

已知類藥性（Drug-likeness，DL）是指分子包含的化學(xué)結(jié)構(gòu)與大多數(shù)藥物有相似的物理特征。據(jù)報道[13]，一般DL＞0.18時具有良好的成藥性，而口服利用度（Oral bioavailability，OB）＞30%的分子具有較好的成藥可能。另外，根據(jù)Lipinski成藥性原則可知化合物的分子量（Molecular Weight，MW）小于500Da，脂水分配系數(shù)對數(shù)AlogP在-2到5之間，最有可能成為口服藥物。表3為反向分子對接結(jié)果 Z'-score＜-0.5的 5種中藥小分子EGFR-TKI藥物代謝動力學(xué)相關(guān)參數(shù)，由表可知除金雀異黃酮OB稍低外，均符合以上成藥性規(guī)則，說明5種中藥小分子均有較好的開發(fā)利用前景。

表3 藥物代謝動力學(xué)參數(shù)表Table 3 Pharmacokinetic parameters

3 討論

本研究對TCMSP中30069個中藥化合物進行發(fā)掘整理，發(fā)現(xiàn)其中木犀草素、槲皮素、金雀異黃酮、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、漆黃素、煙堿、N-反式-對香豆酰酪胺等7種小分子具有抑制EGFR的作用。進一步用DRAR-CPI服務(wù)器對其進行預(yù)測驗證，發(fā)現(xiàn)木犀草素、槲皮素、金雀異黃酮、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、漆黃素5種中藥小分子與EGFR結(jié)合強度較好。木犀草素為黃酮類化學(xué)物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗菌消炎、保護心臟等多種藥理作用[14-15]。隋佳琪[16]用 Western blot法檢測木犀草素對表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）誘導(dǎo)的EGFR蛋白磷酸化水平，結(jié)果表明EGF能明顯促進 EGFR蛋白磷酸化水平，而木犀草素能夠顯著地抑制 EGF誘導(dǎo)的EGFR磷酸化。洪專[17]通過體內(nèi)、外研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素不僅能夠下調(diào)L858R/T790M突變型EGFR磷酸化水平，還能夠抑制HSP90蛋白伴侶的活性，從多個靶點促進EGFR繼發(fā)突變型肺癌細(xì)胞的凋亡，表明木犀草素具有治療EGFR繼發(fā)T790M突變型非小細(xì)胞肺癌的可能。

槲皮素因具有止咳、抗炎、抗氧化、治療腫瘤的作用[18-19]日益受到人們的重視。吳波等[20]發(fā)現(xiàn)槲皮素和大黃素對VEGFR、FGFR、EGFR等蛋白活性有顯著的抑制作用；向廷秀等[21]發(fā)現(xiàn)槲皮素能下調(diào)HSP70和EGFR的表達，抑制胃癌細(xì)胞的生長，呈時間劑量依賴性；李士坤等[22]的研究表明槲皮素可下調(diào)作為腫瘤細(xì)胞惡性程度生物學(xué)指標(biāo)的PCNA，EGFR，VEGF，c-myc的表達，對人食管癌Eca-109細(xì)胞具有誘導(dǎo)分化效應(yīng)。以上研究均證實槲皮素具有良好的EGFR抑制作用。目前，關(guān)于金雀異黃酮抗腫瘤藥理研究也有了一定進展。袁江蘭[23]等AUTODOCK 3.05分子對接軟件探究了金雀異黃酮與EGFR的相互作用機制，結(jié)果表明兩者結(jié)合自由能為-31.2 kJ/mol可發(fā)生強烈的相互作用，而試驗[24]也證實了金雀異黃酮可通過抑制EGFR的磷酸化，進而阻止肝癌細(xì)胞的增殖。

大量研究[25]表明表沒食子兒茶素沒食子酸酯作用的抗腫瘤靶點很多，例如各種受體、酶和細(xì)胞因子等，其中EGFR、VEGFR是其最重要的抗腫瘤靶點之一。陳麗莉等[26]發(fā)現(xiàn)表沒食子兒茶素沒食子酸酯可通過影響膜受體EGFR、67LR引起下游一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)抑制腫瘤細(xì)胞增殖。漆黃素又名非瑟酮，可通過誘導(dǎo)凋亡、影響信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)、抑制增殖、抑制遷移和侵襲等方面發(fā)揮抗腫瘤作用。研究表明漆黃素抑制腫瘤細(xì)胞的COX-2、Wnt、EGFR通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制結(jié)腸癌的生長[27]。以上文獻說明表沒食子兒茶素沒食子酸酯和漆黃素作為中藥小分子 EGFR-TKI抗腫瘤作用顯著。

以上報道與本研究結(jié)果相互補充，表明木犀草素、槲皮素、金雀異黃酮、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、漆黃素等中藥小分子EGFR-TKI能直接或間接抑制EGFR的表達，從多個靶點、多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞的生長和擴散，具有良好的抗腫瘤效果。同時也表明利用中藥小分子開發(fā)新一代多靶點EGFR-TKI具有廣闊的前景。

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