吳紅梅， 郭 宇*， 曹建芳， 吳中立

(1. 遼寧工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院, 遼寧 錦州 121001； 2. 遼寧工業(yè)大學(xué) 機(jī)械工程與自動(dòng)化學(xué)院， 遼寧 錦州 121001)

1 引 言

鋅離子(Zn2+)是生命體系內(nèi)含量位居第二的金屬離子，在激素分泌、神經(jīng)傳導(dǎo)、細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)、基因表達(dá)、酶活性、核酸和蛋白質(zhì)的合成等生命過程中發(fā)揮著重要的作用[1-4]，因此Zn2+代謝失常會(huì)影響人體的生長(zhǎng)發(fā)育和多種疾病的發(fā)生[5-6]，如癲癇癥、腦缺血、白內(nèi)障、夜盲癥、老年癡呆癥等。另外，伴隨著金屬鋅在機(jī)械制造、合金制造、電池電極和電鍍防腐等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，大量的鋅以Zn2+形式進(jìn)入環(huán)境，成為污染離子[7-8]。因此，快速、高效預(yù)警Zn2+的研究對(duì)醫(yī)學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)、農(nóng)學(xué)和環(huán)境學(xué)領(lǐng)域具有重要的研究意義。

目前，對(duì)金屬離子的檢測(cè)方法有原子吸收光譜法、質(zhì)譜法、比色法、電化學(xué)法、色譜法和熒光探針法等[9-12]，其中熒光探針法由于高靈敏度、高選擇性、簡(jiǎn)便快捷、開-關(guān)可調(diào)和原位檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于分子和離子的檢測(cè)。近年來，報(bào)道了許多Zn2+熒光探針，如喹啉類、苯并咪唑類、羅丹明類、蒽類等[13-17]。然而，盡管有些Zn2+熒光探針性能優(yōu)良，但合成步驟復(fù)雜、水溶性較差、具有一定的毒性，限制了它的實(shí)際應(yīng)用。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 主要試劑與儀器

試劑：丹磺酰氯、2-羥基-1-萘醛、對(duì)氨基苯甲酸、氯化亞砜、三乙胺、水合肼、冰醋酸、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、甲醇、乙醚、丙酮、無水硫酸鈉、乙腈、乙酸乙酯、乙醇、去離子水。

儀器：HPLC-Q-Tof MS 型質(zhì)譜儀、Varian INOVA-400MHz核磁共振儀、Elementar varioEL Ⅲ元素分析儀、HP8453紫外-可見光譜儀、JASCO FP-6500熒光光譜儀、HPLC-Q-Tof MS 型質(zhì)譜儀。

2.2 Zn2+熒光探針HM的合成

鋅離子熒光探針HM的合成路線見圖1。以對(duì)氨基苯甲酸為原料依次進(jìn)行酯化、酰化、肼解，最后與2-羥基-1-萘醛進(jìn)行席夫堿反應(yīng)得到。中間產(chǎn)物A1、A2和A3的合成方法見前期工作[21]。

圖1 熒光探針HM的合成示意圖

Zn2+熒光探針HM的合成：在甲醇溶液中，將中間產(chǎn)物A3與2-羥基-1-萘醛在冰醋酸催化下反應(yīng)24 h，冷卻、除去溶劑后得到的產(chǎn)品為黃色粉末，產(chǎn)率為82%。產(chǎn)品的ESI-MS質(zhì)譜如圖2所示。從圖中可以觀察到2個(gè)主峰，分別為m/z=537.2歸屬于 (HM-H)-，m/z=573.0歸屬于(HM+Cl)-；元素分析計(jì)算值：C，66.90%；H，4.87%；N，10.40%；實(shí)驗(yàn)值：C，66.92%；H，4.86%；N，10.36%。1H NMR譜(d6-DMSO)如圖3所示，從指認(rèn)結(jié)果得出譜圖信息與探針HM的結(jié)構(gòu)相符。

圖2 熒光探針HM的ESI-MS譜圖

圖3 熒光探針HM的1H NMR譜圖(d6-DMSO)

2.3 光譜測(cè)試

2.3.1 配制溶液

將熒光探針HM配制成1.0×10-3mol/L的DMF溶液，金屬離子配制成2.0×10-2mol/L的水溶液，用于光譜測(cè)試的溶液根據(jù)需求由上述高濃度溶液稀釋得到，探針HM的稀釋溶劑為DMF/H2O(9∶1，v/v)的混合溶劑、金屬離子的稀釋溶劑為水溶液。

2.3.2 光譜測(cè)試

紫外光譜測(cè)試：移取2 mL探針HM溶液(20 μmol/L)加入到比色皿中，然后向其中加入特定濃度Zn(NO3)2水溶液，直至平衡，測(cè)定300～500 nm范圍內(nèi)的紫外-可見吸收光譜。

熒光光譜測(cè)試：移取2 mL探針HM溶液(50 μmol/L)加入到比色皿中，用Zn(NO3)2水溶液滴定，直至平衡，用波長(zhǎng)396 nm的光激發(fā)，測(cè)定400～750 nm范圍內(nèi)的熒光光譜。

3 結(jié)果與討論

3.1 HM-Zn2+的電噴霧質(zhì)譜分析

圖4 HM-Zn2+的ESI-MS質(zhì)譜

將上述2個(gè)峰值用Isopro3.0 program軟件進(jìn)行模擬，可以看出實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論值相吻合，說明熒光探針HM與Zn2+以1∶1的模式配位，并且形成的配合物HM-Zn能夠在溶液中穩(wěn)定存在。

3.2 紫外光譜

圖5 向探針HM(20 μmol/L)中加入Zn2+的紫外滴定曲線

圖5為向探針HM(20 μmol/L)的DMF/H2O(9∶1,v/v)溶液中加入Zn(NO3)2后的紫外滴定光譜圖。從圖中可以看出，探針HM在386 nm處出現(xiàn)2-羥基-1-萘醛的特征吸收峰，當(dāng)加入Zn2+后386 nm處的吸收峰逐漸減弱，這主要是由于2-羥基-1-萘醛產(chǎn)生π-π*躍遷的結(jié)果。而且由于探針HM與Zn2+結(jié)合后形成新的配合物，產(chǎn)生的由金屬鋅到HM的電荷躍遷，在420 nm處出現(xiàn)了新的吸收峰，并且強(qiáng)度逐漸增大，直至達(dá)到平衡，等吸收點(diǎn)為396 nm。

為進(jìn)一步驗(yàn)證HM與Zn2+的配位比例做了Job’s plot實(shí)驗(yàn)，保持HM和Zn2+總濃度為20 μmol/L，在420 nm處測(cè)定不同[HM]/[Zn2+]比值的吸收強(qiáng)度，如圖6所示。從圖中可以看出[HM]/[HM+Zn2+]值為0.5時(shí)吸收強(qiáng)度最大，說明HM與Zn2+的配位比例為1∶1，與電噴霧質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)果一致(圖4)。利用紫外吸收峰396 nm處吸光度值進(jìn)行Benesi-Hildebrand數(shù)據(jù)擬合，計(jì)算平衡常數(shù)，如圖7所示，具體過程如下：

(1)

其中，A0是探針HM的吸光度值，A是在探針HM中加入一定量的Zn2+后的吸光度值，Al是在探針HM中加入過量Zn2+的吸光度值，n為加入Zn2+的倍數(shù)，K為平衡常數(shù)。線性擬合的相關(guān)度R為0.998，平衡常數(shù)K=4.05×106L·mol-1。

圖6 探針HM與Zn2+配位的Job’s plot 曲線

圖7 探針HM與Zn2+配位的平衡常數(shù)線性擬合曲線

3.3 熒光光譜分析

探針HM對(duì)Zn2+識(shí)別的熒光滴定曲線如圖8所示，以396 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)熒光探針HM (50 μmol/L) 在發(fā)射峰為510 nm處有弱熒光，當(dāng)向探針HM中引入Zn2+后在波長(zhǎng)510 nm 處熒光強(qiáng)度逐漸增大，并且強(qiáng)度增大2.5倍，熒光量子產(chǎn)率為0.02(參比物為Ru(2,2-bpy)2(ClO4)2)。探針HM對(duì)Zn2+的識(shí)別過程主要是由于PET(光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移機(jī)理)和CHEF(螯合熒光增強(qiáng)機(jī)理)共同作用的結(jié)果，當(dāng)熒光探針HM的識(shí)別基團(tuán)2-羥基-1-萘醛上的O、?；鵒和席夫堿的N原子與Zn2+配位后不僅增大了熒光探針HM自身的平面剛性，同時(shí)導(dǎo)致識(shí)別基團(tuán)供電子能力下降，進(jìn)而抑制了識(shí)別基團(tuán)2-羥基-1-萘醛向熒光基團(tuán)丹磺酰胺的光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移，被激發(fā)的電子直接躍遷返回基態(tài)，從而在510 nm處熒光強(qiáng)度顯著增大。

圖8 向探針HM中加入Zn2+的熒光滴定曲線，λex=396 nm。

借助量子化學(xué)軟件gaussian09，采用DFT方法，B3LYP泛函，6-31G(d,p)基組，研究了Zn2+熒光探針HM的發(fā)光機(jī)制，結(jié)果如圖9所示。在沒有加入Zn2+之前，配位基團(tuán)部分的HOMO 能級(jí)(-5.606 eV)恰好介于丹磺酰胺的HOMO能級(jí)(-5.608 eV)和LUMO(-1.559 eV)能級(jí)之間，使分子產(chǎn)生PET，熒光強(qiáng)度很弱；加入Zn2+后，配位基團(tuán)部分的HOMO能級(jí)(-6.538 eV)降低，PET過程受阻，使丹磺酰胺LUMO能級(jí)的電子順利回到HOMO能級(jí)產(chǎn)生熒光，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Zn2+的識(shí)別。

在10 μmol/L探針HM的溶液中逐漸加入Zn2+，在最優(yōu)化條件下，檢測(cè)Zn2+的線性區(qū)間在0～20 μmol/L區(qū)間，如圖10所示，線性回歸方程為y=193.8530+67.5749x，線性相關(guān)系數(shù)為R=0.998，最低檢測(cè)限達(dá)到1.0×10-5mol/L。

圖9 Zn2+熒光探針HM的PET過程

圖10 Zn2+加入量與發(fā)射峰強(qiáng)度的線性擬合圖

3.4 選擇性測(cè)試

熒光探針對(duì)金屬離子的識(shí)別，其選擇性尤為重要。圖11為熒光探針HM對(duì)Zn2+選擇性測(cè)試結(jié)果。從圖中可以看出，在發(fā)射波長(zhǎng)510 nm處探針HM僅對(duì)Zn2+具有特殊響應(yīng)，而加入Li+、 Na+、K+、Ca2+、Cr3+、Mn2+、Ag+、Co2+、Hg2+、Ni2+、Pb2+和Cu2+等金屬離子時(shí)熒光強(qiáng)度并沒有增大，表明探針HM對(duì)Zn2+具有良好的選擇性。原因可歸結(jié)為在空間上探針HM對(duì)Zn2+具有合適的配位構(gòu)型，并且對(duì)Zn2+螯合的平衡常數(shù)較大，在激發(fā)波長(zhǎng)為396 nm時(shí)HM-Zn配合物具有較強(qiáng)的熒光發(fā)射，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Zn2+的高選擇性識(shí)別。

圖11 探針HM對(duì)Zn2+的選擇性測(cè)試, λex=396 nm。

Fig.11 Fluorescence responses of HM upon addition of different metal ions(Li+， Na+， K+， Zn2+， Ca2+， Cr3+， Mn2+， Ag+， Co2+， Hg2+， Ni2+， Pb2+， Cu2+) in an aqueous solution of DMF/H2O(9∶1,v/v),λex=396 nm.

3.5 pH依賴測(cè)試

圖12 探針HM對(duì)Zn2+的識(shí)別的pH依賴測(cè)試

4 結(jié) 論

本文設(shè)計(jì)合成了一種新型酰腙類單三齒Zn2+熒光探針HM，該探針合成方法簡(jiǎn)單、 產(chǎn)率較高，能夠與Zn2+形成1∶1的穩(wěn)定配合物，平衡常數(shù)為4.05×106L·mol-1；在眾多金屬離子中，HM僅與Zn2+結(jié)合后在發(fā)射波長(zhǎng)510 nm處熒光強(qiáng)度增強(qiáng)2.5倍。探針HM能夠高選擇性、高靈敏度地識(shí)別Zn2+，最低檢測(cè)限達(dá)1.0×10-5mol/L。

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