姜 薇JIANG Wei 金聲瑯 - 殷涌光 -

(1. 黃山學(xué)院旅游學(xué)院，安徽 黃山 245041； 2. 吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130022)

目前，抗氧化劑及其化學(xué)性質(zhì)引起了很多科學(xué)家研究的熱潮。由于體內(nèi)外的氧化壓力使人體產(chǎn)生一系列問(wèn)題，引發(fā)很多的致命性疾病，如癌癥、動(dòng)脈硬化、心血管疾病、糖尿病、神經(jīng)紊亂等[1]。蛋白質(zhì)經(jīng)酶降解后釋放出的生物活性肽能有效清除體內(nèi)過(guò)剩的自由基、螯合金屬離子、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生等避免機(jī)體被氧化產(chǎn)生損傷[2]。消費(fèi)者以及生產(chǎn)廠商更傾向于“天然”食品的抗氧化劑對(duì)人體的低損害性，因此從安全無(wú)污染的食品中提取天然抗氧化活性多肽已成為研究熱點(diǎn)。

中國(guó)是世界上的鹿產(chǎn)業(yè)大國(guó)，鹿茸是絕大多數(shù)雄性鹿科動(dòng)物生長(zhǎng)的一種尚未骨化的幼角，也是一種珍貴的具有滋補(bǔ)作用的中藥，主要被加工成鹿茸精作為藥用，且年產(chǎn)量可達(dá)20萬(wàn)瓶之多[3]。但是對(duì)于生產(chǎn)鹿茸精過(guò)程中的副產(chǎn)物——鹿茸渣卻沒(méi)有充分利用。目前，僅有關(guān)于鹿茸渣酸解制備氨基酸、酶法提取硫酸軟骨素、熬制鹿茸渣膠的研究[4]，都存在加工工藝復(fù)雜，提取及利用率低的缺點(diǎn)。

高壓脈沖電場(chǎng)技術(shù)(high intensity pulsed electric fields, PEF)是食品非熱加工技術(shù)之一,被廣泛地應(yīng)用于食品的殺菌處理[5]、酒的催陳[6]、物料的提取[7]等。在較高電場(chǎng)強(qiáng)度下，大部分的酶均會(huì)有不同程度損壞而失活[8]，但是少數(shù)的幾種酶在適宜的電場(chǎng)強(qiáng)度下活性會(huì)增加[9]，并且能夠顯著提高酶解反應(yīng)產(chǎn)物得率，還未見(jiàn)高壓脈沖電場(chǎng)促進(jìn)菠蘿蛋白酶解反應(yīng)的相關(guān)報(bào)道。

本研究以鹿茸渣蛋白水解度及抗氧化活性為試驗(yàn)指標(biāo)，選用菠蘿蛋白酶為水解用酶，通過(guò)單因素試驗(yàn)研究底物濃度、酶濃度、電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖數(shù)等對(duì)降解鹿茸渣蛋白的影響，并采用響應(yīng)面分析優(yōu)化酶解工藝條件，以提高鹿茸渣制備抗氧化肽的酶解效率及縮短反應(yīng)時(shí)間。最后用D201-C大孔樹(shù)脂對(duì)水解液進(jìn)行除鹽和粗分，獲得具有高抗氧化活性的鹿茸抗氧化肽組分，從而為利用鹿茸渣生產(chǎn)抗氧化活性多肽提供一定的理論參考和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

鹿茸渣：中韓動(dòng)物研究院；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、水楊酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等：分析純，北京化工廠；

DA201-C大孔樹(shù)脂：廊坊淼陽(yáng)化工有限公司；

菠蘿蛋白酶：300 U/mg，上海寶曼生物有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高速離心機(jī)：KEN-002-TY4624型，美國(guó)Kendro公司；

紫外可見(jiàn)分光光度儀：TU-1810型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

高壓脈沖電場(chǎng)設(shè)備：實(shí)驗(yàn)室自制(電場(chǎng)操作系統(tǒng)設(shè)計(jì)詳見(jiàn)文獻(xiàn)[10])；

噴霧干燥機(jī)：SP-1500型，上海順義實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

上海雷磁電導(dǎo)率儀：DDS-307型，上海右一儀器有限公司；

水浴恒溫振蕩器：SHA-C型，金壇市恒豐儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)方法

(1) 水解度(DH)的測(cè)定：根據(jù)文獻(xiàn)[11]。

(2) DPPH·清除率的測(cè)定：根據(jù)文獻(xiàn)[12]。

(3) ·OH清除率的測(cè)定：根據(jù)文獻(xiàn)[13]。

1.2.2 PEF下酶解反應(yīng)的單因素試驗(yàn)

(1) 固定電場(chǎng)強(qiáng)度5 kV/cm，脈沖數(shù)6，酶添加量6 U/mg，用磷酸緩沖溶液調(diào)鹿茸渣水溶液pH至7.0，分別考察不同底物濃度(5%，10%，15%，20%，25%)對(duì)鹿茸蛋白水解度和水解液抗氧化活性的影響。

(2) 固定電場(chǎng)強(qiáng)度5 kV/cm，脈沖數(shù)6，底物濃度15%，用磷酸緩沖溶液調(diào)pH至7.0，分別考察不同酶添加量(1，3，5，7，9 U/mg)對(duì)鹿茸蛋白的水解度和水解液抗氧化活性的影響。

(3) 固定脈沖數(shù)6，底物濃度15%，酶添加量7 U/mg，用磷酸緩沖溶液調(diào)pH至7.0，分別考察不同電場(chǎng)強(qiáng)度(0，5，10，15，20，25 kV/cm)對(duì)鹿茸蛋白水解度和水解液抗氧化活性的影響。

(4) 固定電場(chǎng)強(qiáng)度15 kV/cm，底物濃度15%，酶添加量7 U/mg，用磷酸緩沖溶液調(diào)pH至7.0，分別考察不同的脈沖數(shù)(4，6，8，10，12)對(duì)鹿茸蛋白水解度和水解液抗氧化活性的影響。

1.2.3 PEF下酶解反應(yīng)多因素試驗(yàn) 根據(jù)中心設(shè)計(jì)試驗(yàn)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定底物濃度15%，pH 7.0，考察菠蘿蛋白酶濃度、電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖數(shù)對(duì)酶解液抗氧化活性的影響，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定最佳制備工藝。

1.2.4 大孔吸附樹(shù)脂脫鹽及分離 利用大孔吸附樹(shù)脂去除酶解反應(yīng)過(guò)程中添加的無(wú)機(jī)鹽，并對(duì)鹿茸抗氧化肽進(jìn)行純化。將一定體積處理好的濕樹(shù)脂慢慢裝入Φ1.5 cm×50 cm 的玻璃柱中，用去離子水洗至洗脫液在220 nm處的吸光值平穩(wěn)，用1 BV/h的流速上樣，上樣體積50 mL。然后用去離子水和不同濃度(25%，50%，75%，100%)乙醇作為洗脫劑，對(duì)吸附后樹(shù)脂進(jìn)行洗脫。收集洗脫液，用紫外分光光度計(jì)在220 nm處測(cè)吸光值，用電導(dǎo)率檢測(cè)洗脫液中的離子強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 底物濃度對(duì)酶解反應(yīng)的影響 由圖1可以看出，隨著底物的增加，鹿茸蛋白的水解度先增加后減少，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?5%時(shí)，鹿茸蛋白的水解度[(14.23±0.11)%]及清除DPPH·的能力[(72.42±0.09)%]均達(dá)到最大值，當(dāng)?shù)孜餄舛冗^(guò)高時(shí)，由于底物濃度超過(guò)了蛋白酶能降解的底物量，所以水解度反而降低。這是因?yàn)槊附馕稽c(diǎn)是一定的，酶相對(duì)于底物的酶切位點(diǎn)不足，且過(guò)高的底物濃度降低了水解產(chǎn)物的分子運(yùn)動(dòng)速率，從而降低酶與酶切位點(diǎn)的接觸幾率[15]。這一結(jié)果和姜惠敏等[16]制備羊胎盤抗氧化肽的變化趨勢(shì)相似。

2.1.2 酶添加量對(duì)酶解反應(yīng)的影響 由圖2可以看出，酶添加量從1 U/mg增加到7 U/mg時(shí)，鹿茸蛋白水解度和水解液的DPPH·清除率呈直線上升趨勢(shì)，在7 U/mg時(shí)達(dá)到最大值，隨后水解度和水解液的DPPH·清除率反而下降，與唐夢(mèng)茹等[17]的研究結(jié)果相似。這是因?yàn)樵诿赶鄬?duì)于底物達(dá)到飽和之前，隨著酶添加量的增加，可以使酶與底物的接觸機(jī)率增高，底物被水解的程度也隨之增加，但當(dāng)?shù)孜锵鄬?duì)酶濃度達(dá)到飽和時(shí)，酶的進(jìn)一步添加反而導(dǎo)致酶分子之間起到競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，增加試驗(yàn)的操作成本[18]。故酶的最優(yōu)添加量為7 U/mg。

圖1 底物濃度對(duì)鹿茸蛋白水解度和DPPH·清除率的影響

Figure 1 The influence of substrate concentration on degree of hydrolysis and scavenging rates of DPPH·

圖2 酶添加量對(duì)鹿茸蛋白水解度和DPPH·清除率的影響

Figure 2 The influence of enzyme concentration on degree of hydrolysis and scavenging rates of DPPH·

2.1.3 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)酶解反應(yīng)的影響 由圖3可以看出，電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)鹿茸蛋白的水解度和水解液抗氧化活性的影響很明顯。電場(chǎng)強(qiáng)度為15 kV/cm時(shí)鹿茸蛋白的水解度和水解液抗氧化活性最高，與菠蘿蛋白酶在此電場(chǎng)條件下的活力最高相一致(圖4)。這是因?yàn)樵谶m宜的電場(chǎng)強(qiáng)度下，酶的結(jié)構(gòu)被改變，活性中心暴露出來(lái)提高了蛋白酶的活性[19]；同時(shí)物料的細(xì)胞膜也可被電場(chǎng)擊穿而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物滲出，提高酶與底物的接觸機(jī)會(huì)。

2.1.4 脈沖數(shù)對(duì)酶解反應(yīng)的影響 從圖5可以看出，隨脈沖數(shù)從2增加到12，鹿茸蛋白的水解度和水解液抗氧化活性先增加后減少，當(dāng)脈沖數(shù)為8時(shí)達(dá)到最大值。在相同的流量下，反應(yīng)時(shí)間與脈沖數(shù)有關(guān)，因此當(dāng)脈沖數(shù)增加時(shí)，反應(yīng)時(shí)間增加，酶的活性變得不穩(wěn)定，所以過(guò)高的脈沖數(shù)反而不利于酶的溶解反應(yīng)[20]。這一結(jié)果可以從圖6中脈沖數(shù)對(duì)菠蘿蛋白酶活力的影響得到驗(yàn)證。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

圖3 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)鹿茸蛋白水解度和DPPH·清除率的影響

Figure 3 The influence of electric field strength on degree of hydrolysis and scavenging rates of DPPH·

圖4 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)菠蘿蛋白酶活性的影響Figure 4 The influence of electric field strength on enzyme activity

圖5 脈沖數(shù)對(duì)鹿茸蛋白水解度和DPPH·清除率的影響

Figure 5 The influence of pulses number on degree of hydrolysis and scavenging rates of DPPH·

圖6 脈沖數(shù)對(duì)菠蘿蛋白酶活性的影響Figure 6 The influence of pulses number strength on enzyme activity

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平編碼Table 1 Factors and levels of RSM optimization experiments

表2 響應(yīng)面法優(yōu)化方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and experimental results of RSM

2.2.2 模型建立與數(shù)據(jù)分析 用Design Expert 7.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到鹿茸蛋白水解液對(duì)DPPH·清除率與電場(chǎng)強(qiáng)度、酶添加量、脈沖數(shù)之間的二次回歸方程為：

(1)

去除不顯著項(xiàng)后的公式為：

(2)

從方程中可以看出電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖數(shù)對(duì)水解液清除DPPH·的能力起到正影響，酶添加量對(duì)其抗氧化活性起到負(fù)面影響，但是電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖數(shù)均可以對(duì)酶添加量產(chǎn)生負(fù)面影響。各項(xiàng)的二次方均為負(fù)面影響，即因素值的大量提高都不利于抗氧化活性肽的產(chǎn)生，只能小幅度的調(diào)節(jié)三者的比例，才能酶解出高抗氧化活性的多肽溶液。

從表3中可以看出，回歸模型的P<0.000 1，表明試驗(yàn)設(shè)計(jì)得出的二次方程模型達(dá)到了極顯著水平，該模型可以用來(lái)分析和預(yù)測(cè)鹿茸蛋白酶解制備抗氧化多肽的效果。同時(shí)模型失擬項(xiàng)(0.172 8)不顯著，說(shuō)明試驗(yàn)誤差較小，回歸方程與實(shí)際值相似度較高。對(duì)水解液清除DPPH·的能力影響最顯著的是電場(chǎng)強(qiáng)度(P<0.000 1)，其次為酶添加量(P<0.05)，最后為脈沖數(shù)。各因素的二次方值對(duì)水解液的抗氧化活性的影響均較顯著(P<0.01)，電場(chǎng)強(qiáng)度與脈沖數(shù)的交互作用較顯著(P<0.01)，其次為酶添加量與電場(chǎng)強(qiáng)度(P<0.05)，最后為酶添加量與脈沖數(shù)沒(méi)有交互作用。說(shuō)明在設(shè)定的脈沖數(shù)范圍內(nèi)，酶的活性受電場(chǎng)強(qiáng)度的影響較明顯，從而導(dǎo)致水解液抗氧化活性能力的提高。

表3 響應(yīng)面模型方差分析?Table 3 ANOVA for the response surface quadratic model

? P>F的值小于0.05，影響顯著(*)；P>F的值小于0.01，極其顯著(**)。

從圖7和8可知，電場(chǎng)強(qiáng)度與酶添加量之間具有顯著的交互作用，其次是場(chǎng)強(qiáng)和脈沖數(shù)，這與表3結(jié)果一致。采用分析軟件分析得到鹿茸蛋白酶解制備抗氧化肽的最佳工藝條件：電場(chǎng)強(qiáng)度17.3 kV/cm，脈沖數(shù)7.18、酶添加量7.04 U/mg，根據(jù)高壓脈沖電場(chǎng)實(shí)際操作條件，脈沖數(shù)調(diào)整為7。此時(shí)鹿茸酶解液的DPPH·清除率可達(dá)74.49%。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ团c實(shí)際值的相似性，將試驗(yàn)條件調(diào)整為最佳參數(shù)值，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測(cè)定酶解液清除DPPH·的活性為(74.76±2.03)%，理論預(yù)測(cè)值與實(shí)際值非常接近，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了回歸模型的合適性。

2.3 鹿茸抗氧化肽的大孔吸附樹(shù)脂脫鹽及純化

DA201-C大孔樹(shù)脂對(duì)鹿角茸多肽的除鹽和粗分洗脫曲線見(jiàn)圖9。DA201-C大孔樹(shù)脂的疏水性能很強(qiáng)，有機(jī)物質(zhì)通過(guò)疏水基團(tuán)可以吸附到大孔樹(shù)脂的表面上。鹿茸蛋白經(jīng)菠蘿蛋白酶水解后，隨著蛋白質(zhì)中肽鍵的斷裂，蛋白分子的構(gòu)象發(fā)生了改變，蛋白質(zhì)分子內(nèi)的疏水氨基酸被暴露出來(lái)，從而使蛋白質(zhì)混合物的疏水性增加，而吸附到樹(shù)脂上。相反，無(wú)機(jī)鹽不能吸附到大孔樹(shù)脂上，可以被去離子水洗脫下來(lái)，從而與多肽分開(kāi)，而達(dá)到除鹽的效果[21-22]。根據(jù)乙醇溶液能改變多肽溶液的非極性側(cè)鏈的排水傾向，從而可以將多肽從樹(shù)脂上置換到洗脫液中，而被洗脫下來(lái)，疏水性越高的多肽，洗脫的乙醇濃度越高[23]。

2.4 純化多肽抗氧化能力

圖7 電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖數(shù)交互作用等高線圖和響應(yīng)面圖Figure 7 Response surface and contour plots for the interaction effects of electric filed intensity and pulse number

圖8 電場(chǎng)強(qiáng)度和酶添加量交互作用等高線圖和響應(yīng)面圖Figure 8 Response surface and contour plots for the interaction effects of electric filed intensity and bromelain concentration

圖9 鹿茸多肽除鹽和粗分的洗脫曲線Figure 9 The desorption curves of desalination and separation of antler peptides

圖10 粗多肽及各洗脫部分的抗氧化活性Figure 10 Antioxidant activities of crude peptide and each fraction

3 結(jié)論

[1] MILIAUSKAS G, VAN-BEEK T A, VENSKUTONIS P R, et al. Antioxidant activity ofpotentilla fruticosa[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture, 2004, 84(15): 1 997-2 009.

[2] JUNG M Y, KIM S K, KIM S Y. Riboflavin-sensitizedphotooxidation of ascorbic acid kinetics and amino acid effects[J]. Food Chemistry, 1995, 53: 397-403.

[3] JIANG Wei, YIN Yong-guang, ZHOU Ya-jun, et al. Fast hydrolysis of antler residue (Comucervipantotrichum) by pulsed electric field assisted pepsin[J]. Journal of Pure and Applied Microbiology, 2013, 7: 621-629．

[4] 莊蘭英, 騰歐. 生產(chǎn)鹿茸精副產(chǎn)品——鹿茸渣膠成分分析與利用[J]. 特產(chǎn)科學(xué)實(shí)驗(yàn), 1983(2): 50-51.

[5] ANGERSBACH A, HEINZ V, KNORR D. Effects of pulsed electric fields on cell membranes in real food systems[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2000, 1(2): 135-149.

[6] 劉學(xué)軍, 殷涌光, 范松梅, 等. 高壓脈沖電場(chǎng)催陳葡萄酒香氣成分變化的GC-MS分析[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(12): 654-657.

[7] YIN Yong-guang, HE Gui-dan. A fast high-intensity pulsed electric fields (PEF)-assisted extraction of dissoluble calcium from bone[J]. Separation and Purification Technology, 2008, 61(2): 148-152.

[8] YANG R J, LI S Q, ZHANG Q H. Effects of pulsed electric fields on the activity of enzymes in aqueous solution[J]. Journal of Food Science, 2004, 69(4): 241-248.

[9] OHSHIMA T, TAMURA T, SATO M. Influence of pulsed electric field on various enzyme activities[J]. Journal of Electrostatics, 2007, 65: 156-161.

[10] 趙武奇, 殷涌光, 關(guān)偉, 等. 超高壓脈沖電場(chǎng)殺菌系統(tǒng)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào), 2002, 33(3): 67-69.

[11] SAITO M, KUNISAKI N, URANO N, et al. Collagen as the major edible component of sea cucumber (Stichopusjaponicus) [J]. Journal of Food Science, 2002, 67(4): 1 319-1 322.

[12] MILARDOVIC S, IVEKOVIC D, GRABARIC B S. A novelamperometric method for antioxidant activity determination using DPPH free radical[J]. Bioelectrochemistry, 2006, 68(2): 175-180.

[13] 王運(yùn)改, 林琳, 李明輝, 等. 鮰魚皮明膠抗氧化肽的制備工藝研究[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(19): 254-258.

[14] 何小慶, 曹文紅, 章超樺, 等. 波紋巴非蛤蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧活性及分子量分布研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2014, 30(1): 74-80.

[15] 張楊, 胡磊, 汪少蕓, 等. 響應(yīng)面優(yōu)化酶解法制備蒲公英籽蛋白抗氧化肽工藝[J]. 食品工業(yè)科技, 2016, 37(5): 258-262.

[16] 姜惠敏, 李明, 曹光群, 等. 酶解制備羊胎盤抗氧化肽工藝條件的優(yōu)化[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2017, 36(1): 98-104.

[17] 唐夢(mèng)茹, 陳濤濤, 汪少蕓, 等. 響應(yīng)面優(yōu)化酶解法制備韭菜籽蛋白抗氧化肽工藝[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2016, 16(4): 159-165.

[18] 毛銀, 朱科學(xué), 張士康, 等. 響應(yīng)面優(yōu)化酶法制備茶葉蛋白抗氧化肽的工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2013, 34(7): 169-173.

[19] 韋漢昌, 韋群蘭, 韋善清. 高壓脈沖電場(chǎng)提取豬皮膠原蛋白[J]. 廣西科學(xué), 2011, 18(3): 235-237.

[20] 劉唯佳. 鹿茸中水溶性蛋白質(zhì)的提取及鹿茸綜合利用的研究[D]. 長(zhǎng)春: 吉林大學(xué), 2013: 47.

[21] 任清, 張曉平, 趙世峰, 等. 利用大孔吸附樹(shù)脂DA201-CⅡ?qū)ρ帑湹鞍姿庖好擕}的研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(10): 118-122.

[22] 孫旭, 肖志剛, 馬秀婷, 等. 大孔吸附樹(shù)脂對(duì)玉米蛋白水解液脫鹽效果的研究[J]. 食品與機(jī)械, 2012, 28(6): 43-46.

[23] ZHANG Feng-xiang, WANG Zhang, XU Shi-ying. Macropor-ous resin purification of grass carp fish (Ctenopharyngodonidella) scale peptides with in vitro angiotensin-I converting enzyme (ACE) inhibitory ability[J]. Food Chemistry, 2009, 117(3): 387-392.

[24] 張周莉, 李誠(chéng), 劉愛(ài)平, 等. 響應(yīng)面優(yōu)化酶解法制備豬肩胛骨抗氧化肽工藝[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2017, 31(12): 2 358-2 366.

[25] 柯勤勤, 羅洋洋, 何林凌, 等. 草魚魚鱗抗氧化肽的酶法制備及其抗氧化穩(wěn)定性研究[J]. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 35(3): 433-451.