石 峰SHI Feng 陳 雨 張亞琴 - 馬留輝 - 竇明明 - 楊正明 - 陳興福 -

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130；2. 農(nóng)業(yè)部西南作物生理生態(tài)與耕作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130)

藥材澤瀉為澤瀉科植物澤瀉[Alismaorientalis(Sam.) Juzep.]的塊莖[1]，又名水瀉、芒芋、澤芝、及瀉、如意菜等[2]，在中國福建、四川等地大規(guī)模種植，素有“建澤瀉”“川澤瀉”之稱，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。2002年3月中國衛(wèi)生部明確，澤瀉可用作保健食品原料?，F(xiàn)代研究[3]表明，澤瀉化學(xué)成分主要以萜類為主，含有三萜、二萜、倍半萜、多糖等成分，其中三萜類化合物具有抗血栓、降血脂、降血糖、降低血黏度、抗動(dòng)脈粥樣硬化、延緩衰老、利尿、解痙、保肝、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等功效。

目前關(guān)于植物總?cè)频难芯枯^多，主要有熱回流法、超聲輔助提取和超臨界二氧化碳萃取[4-6]等。其中熱回流提取雖然提取率較高，但時(shí)間長、能耗高；超臨界二氧化碳萃取操作復(fù)雜，且安全性低；而超聲提取既節(jié)能效率又高，是很多活性物質(zhì)提取的新技術(shù)[7]。鄧迎娜等[5]采用超聲提取澤瀉總?cè)?，且?yōu)于傳統(tǒng)乙醇回流提取，最大提取率不足2%。本研究在此基礎(chǔ)上增加溫浸輔助提取，采用超聲、溫浸輔助提取澤瀉中總?cè)疲趩我蛩卦囼?yàn)基礎(chǔ)上，以澤瀉總?cè)铺崛÷蕿樵u價(jià)指標(biāo)，利用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，為深入開發(fā)和有效利用澤瀉中總?cè)祁惢钚猿煞痔峁┫鄳?yīng)的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

超聲波清洗儀：SB 25-12 DTDN型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：101-3 AB型，天津市泰斯特儀器有限公司；

電子恒溫水浴鍋：DZKW-4型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；

酶標(biāo)儀：Multiskan FC型，上海輔澤商貿(mào)有限公司；

精密電子天平：JD 300-3千分之一型，沈陽龍騰電子有限公司；

高速萬能粉碎機(jī)：QE-100克型，浙江屹立工貿(mào)有限公司。

1.2 材料與試劑

澤瀉：采自四川省眉山市彭山區(qū)謝家鎮(zhèn)紅石村，經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)陳興福教授鑒定為澤瀉科植物澤瀉[Alismaorientalis(Sam.) Juzep.]的塊莖，經(jīng)干燥、粉碎并過60目篩，備用；

23-乙酰澤瀉醇B對照品：批號(hào)PS15031701，純度≥98%，成都普思生物科技股份有限公司；

無水乙醇、香草醛、冰乙酸、高氯酸等：分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 澤瀉總?cè)频奶崛?準(zhǔn)確稱取澤瀉干燥塊莖粉末1.0 g，按照試驗(yàn)方案加入一定量的一定體積分?jǐn)?shù)乙醇，在一定溫度下浸提一定時(shí)間，并超聲提取一定時(shí)間，過濾，取濾液稀釋一定濃度于試管中，作為待測液。

1.3.2 澤瀉總?cè)坪颗c提取率的測定

(1) 對照品溶液的制備：精密稱取23-乙酰澤瀉醇B對照品1.26 mg，于25 mL容量瓶中，加乙醇適量溶解，搖勻，定容，得到濃度為0.050 4 mg/mL的23-乙酰澤瀉醇B對照品溶液，待用。

(2) 樣品溶液的制備：精密量取1.3.1項(xiàng)下待測液0.2 mL，用相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇稀釋至1 mL，搖勻，即得樣品溶液。

(3) 測定波長的確定：分別取對照品溶液和樣品溶液，按照1.3.2(4)項(xiàng)下顯色方法顯色，于400～600 nm波長之間掃描，結(jié)果表明，兩者均在555 nm波長處有最大吸收，故選擇555 nm為檢測波長。

(4) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密吸取對照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL于10 mL的試管中，在60 ℃水中把溶劑揮干，揮干后于試管中加入0.2 mL 的5%香草醛-冰乙酸溶液，0.8 mL高氯酸，60 ℃水浴15 min，冷卻5 min，加冰醋酸5.0 mL，搖勻，測定波長為555 nm[8]。橫坐標(biāo)為23-乙酰澤瀉醇B含量，縱坐標(biāo)為吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=8.496X+0.000 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4，表明吸光度與質(zhì)量線性關(guān)系良好。

(5) 樣品含量測定：取1.3.2(2)項(xiàng)下樣品溶液0.2 mL，按照1.3.2(4)項(xiàng)下方法顯色，在555 nm波長處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算，得樣品總?cè)坪?，按?1)計(jì)算提取率。

(1)

式中：

c——總?cè)铺崛÷剩?；

m1——總?cè)坪?，g；

m2——澤瀉原料重，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

(1) 乙醇體積分?jǐn)?shù)對澤瀉總?cè)铺崛÷实挠绊懀簻?zhǔn)確稱取澤瀉干燥塊莖粉末1.0 g于50 mL離心管中，分別加入40%，50%，60%，70%，80%，90%乙醇16 mL，置50 ℃恒溫水浴鍋浸提45 min，超聲30 min，測定總?cè)坪浚?次平行試驗(yàn)取平均值，計(jì)算總?cè)铺崛÷省?/p>

(2) 料液比對澤瀉總?cè)铺崛÷实挠绊懀簻?zhǔn)確稱取澤瀉干燥塊莖粉末1.0 g于50 mL離心管中，分別加入80%乙醇8，10，12，14，16 mL，置50 ℃恒溫水浴鍋中浸提45 min，超聲30 min，測定總?cè)坪浚?次平行試驗(yàn)取平均值，計(jì)算總?cè)铺崛÷省?/p>

(3) 超聲時(shí)間對澤瀉總?cè)铺崛÷实挠绊懀簻?zhǔn)確稱取澤瀉干燥塊莖粉末1.0 g于50 mL離心管中，加入80%乙醇12 mL，置50 ℃恒溫水浴鍋浸提45 min，超聲10，20，30，40，50 min，測定總?cè)坪浚?次平行試驗(yàn)取平均值，計(jì)算總?cè)铺崛÷省?/p>

(4) 浸提時(shí)間對澤瀉總?cè)铺崛÷实挠绊懀簻?zhǔn)確稱取澤瀉干燥塊莖粉末1.0 g于50 mL離心管中，加入80%乙醇12 mL，置50 ℃恒溫水浴鍋浸提15，25，35，45，55 min，超聲30 min，測定總?cè)坪浚?次平行試驗(yàn)取平均值，計(jì)算總?cè)铺崛÷省?/p>

(5) 浸提溫度對澤瀉總?cè)铺崛÷实挠绊懀簻?zhǔn)確稱取澤瀉干燥塊莖粉末1.0 g于50 mL離心管，加入80%乙醇12 mL，分別在30，40，50，60，70 ℃恒溫水浴鍋中，浸提45 min，超聲30 min，測定總?cè)坪浚?次平行試驗(yàn)取平均值，計(jì)算總?cè)铺崛÷省?/p>

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用浸提時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提溫度和料液比為試驗(yàn)因素，建立四因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以總?cè)铺崛÷蕿轫憫?yīng)值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel和Design-Expert 8.0.7.1 軟件程序，利用響應(yīng)面分析法對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總?cè)铺崛÷实挠绊?由圖1可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)80%以內(nèi)，澤瀉總?cè)频奶崛÷手饾u增加；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，總?cè)铺崛÷视蟹逯?。乙醇體積分?jǐn)?shù)超過80%，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增加，總?cè)铺崛÷史炊档?，可能是三萜類化合物是弱極性物質(zhì)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的繼續(xù)增加，溶劑極性越弱，導(dǎo)致三萜類化合物的溶解度降低，總?cè)铺崛÷氏陆礫5]。因此，確定最佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

2.1.2 料液比對總?cè)铺崛÷实挠绊?由圖2可知，隨著溶劑用量的增加，總?cè)频奶崛÷室仓饾u增加。當(dāng)料液比達(dá)到1∶12 (g/mL)以后，提取率呈現(xiàn)微弱的下降趨勢，可能是總?cè)坪吭?∶12 (g/mL)左右達(dá)到峰值，隨著溶劑量的繼續(xù)增大，反而起到稀釋的效果。為節(jié)約成本，綜合考慮選擇1∶12 (g/mL)為適宜的料液比。

圖2 料液比對澤瀉總?cè)铺崛÷实挠绊慒igure 2 Effect of solid-liquid ratio on yield of the total triterpenoid

2.1.3 超聲時(shí)間對總?cè)铺崛÷实挠绊?由圖3可知，總?cè)频奶崛÷孰S著超聲時(shí)間的延長而增大，30 min后提取率反而緩慢下降，可能是三萜類化合物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性對超聲比較敏感，長時(shí)間在較強(qiáng)的機(jī)械剪切、振動(dòng)作用下，其結(jié)構(gòu)可能會(huì)發(fā)生改變[9]，從而降低提取率。因此，綜合考慮能源消耗和生產(chǎn)效率，選擇超聲提取時(shí)間為30 min。

圖3 超聲時(shí)間對澤瀉總?cè)铺崛÷实挠绊慒igure 3 Effect of ultrasonic time on yield of the total triterpenoid

2.1.4 浸提時(shí)間對總?cè)铺崛÷实挠绊?由圖4可知，樣品在溶劑中浸提，隨著時(shí)間的延長，提取率呈上升趨勢。當(dāng)時(shí)間為45 min時(shí)，提取率出現(xiàn)峰值，隨著浸提時(shí)間的延長，提取率反而下降，可能是在一定溫度下，三萜類化合物長時(shí)間在提取劑中其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性減弱。因此，選擇45 min 為較適宜的浸提時(shí)間。

2.1.5 浸提溫度對總?cè)铺崛÷实挠绊?由圖5可知，浸提溫度在60 ℃以內(nèi)時(shí)，提取率隨之增加。在60 ℃時(shí)，提取率出現(xiàn)峰值，溫度繼續(xù)升高，提取率反而下降?？赡苁侨祁惢衔飳囟缺容^敏感，當(dāng)溫度升高到一定程度以后，長時(shí)間受熱導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)變化或降解，導(dǎo)致提取率下降[10-11]。因此，選取60 ℃為最佳浸提溫度。

圖4 浸提時(shí)間對澤瀉總?cè)铺崛÷实挠绊慒igure 4 Effect of extraction time on yield of the total triterpenoid

圖5 浸提溫度對澤瀉總?cè)铺崛÷实挠绊慒igure 5 Effect of extraction temperature on yield of the total triterpenoid

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，應(yīng)用四因素三水平的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以4個(gè)因素作為自變量，總?cè)铺崛÷蕿橐蜃兞浚瑑?yōu)選澤瀉總?cè)频奶崛l件。試驗(yàn)因素水平見表1。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

2.3 響應(yīng)面工藝優(yōu)化分析

將所得數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.7.1 軟件來統(tǒng)計(jì)分析，得到總?cè)铺崛÷逝c提取條件的回歸方程為：

R=3.06-0.097×A-0.040×B+0.083×C-0.015×D-0.11×AB+0.12×AC+0.096×AD+0.027×BC+3.972E-003×BD+0.14×CD-0.080×A2-0.28×B2-0.10×C2-0.39×D2。

(2)

由表3可知，選用模型P<0.000 1，F(xiàn)=38.62，說明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該二次回歸方程模型極顯著。失擬項(xiàng)不顯著(P=0.451 9>0.05)，模型R2為0.974 8，adj-R2為0.949 5，表明回歸方程擬合度良好，可以用來優(yōu)化和預(yù)測總?cè)谱罴烟崛」に嚄l件。根據(jù)回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)可知，一次項(xiàng)A、B、C均對總?cè)铺崛÷实挠绊戇_(dá)到顯著效應(yīng)，交互項(xiàng)AB、AC、AD、CD對提取率的交互影響顯著，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對提取率的影響達(dá)到顯著效應(yīng)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and coded levels in the central composite design

由圖6(a)可知，在浸提溫度和料液比一定條件下，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，響應(yīng)值呈緩慢下降趨勢，隨著浸提時(shí)間的增加，響應(yīng)值先升高后下降，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)約至70%、浸提時(shí)間約至45 min，響應(yīng)值存在極大值。由圖6(b)可知，在浸提時(shí)間、料液比一定條件下，乙醇體積分?jǐn)?shù)響應(yīng)曲面較陡峭，說明2個(gè)提取條件對總?cè)频奶崛÷视休^顯著的交互影響，當(dāng)乙醇濃度約為70%、浸提溫度約至60 ℃，響應(yīng)值達(dá)最大。由圖6(c)可知，在浸提時(shí)間和浸提溫度一定條件下，隨著料液比的增加，響應(yīng)值先升高后降低，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)約為70%、料液比約至1∶14 (g/mL)，響應(yīng)值最大。由圖6(d)可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提時(shí)間一定條件下，料液比響應(yīng)曲面較陡峭，說明料液比與浸提溫度對提取率具有較顯著交互影響，當(dāng)料液比約至1∶14 (g/mL)、浸提溫度約至60 ℃，響應(yīng)值最大。綜上可得，該模型有穩(wěn)定點(diǎn)，且穩(wěn)定點(diǎn)是最大值。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

表3 回歸分析?Table 3 The results of regression analysis

? **表示差異極顯著，P<0.01；*表示差異顯著，P<0.05。

圖6 各因素兩兩交互作用對總?cè)铺崛÷视绊懙捻憫?yīng)面圖Figure 6 Various factors on the impact of interaction on the yield of total triterpenoid

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)上述分析研究，得到最佳提取條件：浸提溫度57.10 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70.00%，浸提時(shí)間46.06 min，料液比1∶13.61 (g/mL)，超聲時(shí)間30 min，該條件下總?cè)铺崛÷蕿?.09%。

為了驗(yàn)證響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果的可靠性，以及可操作性，將提取條件修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，浸提時(shí)間46 min，浸提溫度57 ℃，料液比1∶14 (g/mL)，超聲時(shí)間30 min。按上述條件進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得澤瀉總?cè)破骄崛÷蕿?.98%，與理論預(yù)測值基本一致，相對偏差為3.62%。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)最終確定澤瀉總?cè)谱罴烟崛」に嚍椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)70%、浸提時(shí)間46 min，浸提溫度57 ℃、料液比1∶14 (g/mL)，超聲時(shí)間30 min，在此條件下總?cè)频寐蕿?.98%。

本研究與傳統(tǒng)的乙醇回流提取、超臨界二氧化碳萃取相比，超聲提取能顯著提高總?cè)铺崛÷?，?jīng)濟(jì)有效，同時(shí)增加了溫度浸提對提取率的影響，更加全面地闡述了試驗(yàn)因素對提取率的影響。不足之處是在超聲提取時(shí)采取人工控溫，可能存在誤差，若測定時(shí)采用高效液相色譜法，結(jié)果可能更精確。

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