張梓毓ZHANG Zi-yu 徐德平 -

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

五味子為木蘭科多年生落葉木質(zhì)藤本植物，《中華人民共和國藥典》收錄有2種五味子藥材，分別為北五味子 (SchisandrachinensisBaill) 和華中五味子 (SchisandrasphenantheraRehd.et Wils) 的成熟干燥果實(shí)(南五味子)[1]。五味子中含有多種成分，具有鎮(zhèn)靜安神、收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心等功效。近年來，中國對五味子的研究[2-3]顯示木質(zhì)素類物質(zhì)為五味子中具有鎮(zhèn)靜安神的功效成分，并闡明其結(jié)構(gòu)。以往研究的重點(diǎn)在于五味子中的木質(zhì)素類、萜類等較為復(fù)雜的有機(jī)物上[4-6]，忽略了一些結(jié)構(gòu)簡單卻同樣具有較好助眠功效的物質(zhì)。現(xiàn)有的相關(guān)研究對五味子中氨基酸的報(bào)道僅停留在分離和結(jié)構(gòu)鑒定上，并沒對其中氨基酸的功能性作用進(jìn)行研究，本試驗(yàn)擬對五味子不同提取物的助眠作用進(jìn)行研究，通過分析腦部組織的神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化得到除木質(zhì)素類物質(zhì)外的具有助眠作用的氨基酸，為五味子進(jìn)一步開發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

北五味子：安徽亳州藥材市場；

DA標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司；

無水乙醇、高氯酸：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

甲醇、磷酸二氫鉀：色譜級，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

硅膠板：GF254，山東煙臺芝罘化工廠；

大孔吸附樹脂：AB-8 型，天津南開大學(xué)化學(xué)工廠；

Octadecylsilyl(ODS)填料：北京綠百草科技發(fā)展有限公司；

Middle Chromatogram Isolated Gel(MCI GEL) 填料：三菱化學(xué)控股集團(tuán)。

1.2 試驗(yàn)儀器

龍視安攝像頭：LS-Q130W-1型，廣東東莞市盛鼎電子科技有限公司；

磨粉機(jī)：CLF-205型，浙江省溫州市創(chuàng)立藥材器械廠；

萃取罐：RAT-100型，無錫申科儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：R-1002型，上海申順生物科技有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-4型，江蘇省金壇市榮華儀器廠；

恒流泵：SYB106-100型，天津市科器高新技術(shù)公司；

暗箱式紫外透射儀：ZF-90型，上海顧村電光儀器廠；

可見分光光度計(jì)：WFJ 2000型，優(yōu)尼柯上海儀器有限公司；

核磁共振儀：Avance 500 MHz型，美國Bruker 公司；

高效液相色譜儀(紫外+熒光檢測器)(反相)：1525型，美國沃特世公司。

1.3 試驗(yàn)動物

SPF級昆明小鼠：18～22 g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 五味子提取物的制備 將10 kg北五味子粉碎后，按料液比1∶10 (g/mL)加入體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇，于50 ℃攪拌提取3 h，過濾取上清液，重復(fù)2次。將3次所得上清液減壓濃縮去乙醇后即得五味子醇提物，于-18 ℃保存?zhèn)溆肹7]。

1.4.2 五味子活性成分的粗分 將已得到的五味子醇提物用AB-8型大孔樹脂柱(12 cm×150 cm)進(jìn)行分離[8]，用體積分?jǐn)?shù)為30%，50%，70%，95%的乙醇洗脫，分別得到30%乙醇洗脫物(1)、50%乙醇洗脫物(2)、70%乙醇洗脫物(3)和95%乙醇洗脫物(4)4個部分，濃縮并冷凍保存?zhèn)溆?。大孔樹脂粗分離后經(jīng)試驗(yàn)確定有助眠活性部分用MCI柱(5 cm×100 cm)進(jìn)一步分離，用去離子水和體積分?jǐn)?shù)為30%，50%的乙醇洗脫，分別得到水洗脫物(5)、MCI柱30%乙醇洗脫物(6)和MCI柱50%乙醇洗脫物(7)3個部分，濃縮并冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 五味子助眠作用 取小鼠80只，體重18～22 g，隨機(jī)分成8組，每組10只，灌胃給藥。灌胃劑量分別為：五味子大孔樹脂30%乙醇洗脫物(A組)1 g/kg·BW；50%乙醇洗脫物(B組)1 g/kg·BW；70%乙醇洗脫物(C組)1 g/kg·BW；95%乙醇洗脫物(D組)1 g/kg·BW；五味子MCI柱水洗脫物(A1組)1 g/kg·BW；五味子MCI柱30%乙醇洗脫物(A2組)1 g/kg·BW；五味子MCI柱50%乙醇洗脫物(A3組)1 g/kg·BW；空白對照組(CK)給等量生理鹽水。每天1次，連續(xù)給藥1周。1周后用監(jiān)控?cái)z像觀察并記錄灌胃30 min 后各組小鼠的睡眠率、灌胃結(jié)束后12 h內(nèi)各組小鼠的睡眠時(shí)間。

1.4.4 小鼠大腦皮層中多巴胺(DA)含量的測定

(1) 腦組織樣品勻漿制備：取冷凍保存的大腦皮層組織稱重，按1∶3 (g/mL)的比例加入0.01 mol/L 高氯酸溶液，置于冰上勻漿，4 ℃、13 000 r/min 離心10 min后取上清液，0.22 μm針頭過濾器過濾后即可進(jìn)樣[9]。

(2) 色譜條件：色譜柱：Quattro 3 C18柱(150 mm×2.1 mm，3 μm) ；流動相：甲醇和0.1 mol/L磷酸二氫鉀(體積比15∶85)； 流速：0.2 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL[10]。

(3) 數(shù)據(jù)處理和分析：記錄每組HPLC圖譜上的峰面積；并用SPSS 20. 0軟件對試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量數(shù)據(jù)使用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD) 表示。組間差異比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 五味子活性單體化合物的分離

大孔樹脂柱和MCI柱分離后經(jīng)試驗(yàn)確定具有活性成分的主要部分用ODS柱(4 cm×100 cm)分離，得到其中的單體。

2 分析與討論

2.1 五味子大孔樹脂不同洗脫部分助眠作用

五味子大孔樹脂不同洗脫部分對小鼠睡眠率和睡眠時(shí)間的影響見表1，大孔樹脂不同洗脫部分對小鼠大腦皮層中多巴胺含量的影響見圖1。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖1 不同組別小鼠大腦中多巴胺(DA)的積分峰面積Figure 1 The peak areas of dopamine in different groups of mouse brains

由圖1可知，五味子大孔樹脂30%乙醇洗脫物的試驗(yàn)組小鼠腦中多巴胺(DA)含量最高，與空白組有顯著性差異(P<0.05)，95%乙醇洗脫物的試驗(yàn)組小鼠腦中多巴胺(DA)的含量與空白組也具有顯著性差異(P<0.05)。五味子大孔樹脂30%乙醇洗脫物和95%乙醇洗脫物的試驗(yàn)組小鼠腦中多巴胺(DA)含量均高于大孔樹脂50%乙醇洗脫物和70%乙醇洗脫物的。

由表1可知，五味子大孔樹脂30%乙醇洗脫物的試驗(yàn)組小鼠睡眠時(shí)間和睡眠率均為最佳；95%乙醇洗脫物的試驗(yàn)組小鼠睡眠率和50%乙醇洗脫物的相同，但睡眠時(shí)間差異顯著(P<0.05)；95%乙醇洗脫物的試驗(yàn)組小鼠睡眠率高于70%乙醇洗脫物的，但睡眠時(shí)間無顯著性差異(P>0.05)。

綜合表1和圖1可知，五味子大孔樹脂30%乙醇洗脫物和95%乙醇洗脫物均有較好的助眠作用，30%乙醇洗脫物的助眠效果要稍好于95%乙醇洗脫物的。

2.2 MCI不同分離部分的助眠作用

MCI不同分離部分對小鼠睡眠率和睡眠時(shí)間的影響見表2。

表1 不同洗脫部分對小鼠睡眠率和時(shí)間的影響?Table 1 Effect of different elution parts on the sleep rate and time of mice

? *表示與空白對照組比較差異顯著，P<0.05。

表2 MCI不同分離部分對小鼠睡眠率和睡眠時(shí)間的影響?Table 2 Effect of different MCI resin separation section on the sleep rate and time of mice

? *表示與空白對照組比較差異顯著，P<0.05。

由表2可得出，五味子MCI水洗脫物組小鼠的睡眠率最高為90%，同時(shí)睡眠時(shí)間最長，與其他2組和空白組均有顯著性差異(P<0.05)。由此可知，五味子大孔樹脂30%乙醇洗脫物中具有助眠作用的功效成分，且主要集中在MCI水洗脫物中。

2.3 單體化合物的分離與鑒定

從五味子MCI水洗脫物中分離得到Ⅰ和Ⅱ2個化合物，從五味子大孔樹脂95%乙醇洗脫物中分離得到一個化合物Ⅲ。

化合物Ⅰ、Ⅱ均為黃色油狀，易溶于水；結(jié)合其理化性質(zhì)和13C-NMR解析，化合物Ⅰ為α-氨基-β-羥基異丁酸，化合物Ⅱ?yàn)棣?乙氧基氨基丙酸?；衔铫鬄榘咨珶o定形粉末，易溶于甲醇、乙醇等溶劑；結(jié)合其理化性質(zhì)和13C-NMR解析，參照文獻(xiàn)[11]中的報(bào)道：化合物Ⅲ為戈米辛N?；衔铫?、Ⅱ的核磁數(shù)據(jù)見表3，化合物Ⅲ的核磁數(shù)據(jù)見表4?；衔铫?、Ⅱ和Ⅲ的13C-NMR見圖2，結(jié)構(gòu)圖見圖3。

圖2 化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的13C-NMRFigure 2 13C-NMR spectrum of Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ

表3 化合物Ⅰ、Ⅱ的核磁數(shù)據(jù)Table 3 13C-NMR date of compoundⅠandⅡ

(a) 化合物Ⅰ (b) 化合物Ⅱ

(c) 化合物Ⅲ圖3 化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的結(jié)構(gòu)Figure 3 Structure of compound Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ

表4 化合物Ⅲ的核磁數(shù)據(jù)Table 4 13C-NMR date of compound Ⅲ

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，五味子中除了木質(zhì)素類、萜類等較為復(fù)雜的有機(jī)物具有較好的活性外，氨基酸和有機(jī)酸等較為簡單的化合物同樣具有較好的活性，這為五味子功能性成分的開發(fā)進(jìn)一步提供了依據(jù)，開拓了五味子功能性成分開發(fā)的視野。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，α-氨基-β-羥基異丁酸和β-乙氧基氨基丙酸具有助眠效果，但具體是哪一種氨基酸單獨(dú)作用或者是哪幾種氨基酸的協(xié)同作用還需要通過細(xì)胞試驗(yàn)與動物試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典: 一部[M]. 2015年版. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2015: 66-67.

[2] 孫昌波, 王森, 丁向陽, 等. 五味子在食品工業(yè)中的應(yīng)用及其開發(fā)前景[J]. 食品與機(jī)械, 2003(6): 9-10.

[3] 胥春霞, 劉嫚, 陳東林, 等. 北五味子化學(xué)成分的研究[J]. 中成藥, 2017, 39(3): 547-550.

[4] 高春花, 鐘海雁, 孫昌波. 五味子木脂素提取分離純化和含量測定的研究進(jìn)展[J]. 食品與機(jī)械, 2007, 23(1): 151-155.

[5] 孟憲軍, 滕娜, 商紅軍, 等. 五味子乙素-阿霉素脂質(zhì)體的抗腫瘤作用研究[J]. 食品與機(jī)械, 2011, 27(2): 29-31.

[6] 孟憲軍, 李元甦, 李斌, 等. 超聲波輔助提取北五味子藤莖總?cè)频墓に囇芯縖J]. 食品與機(jī)械, 2010, 26(4): 105-108.

[7] 張守勤, 劉長姣, 王長征, 等. 五味子有效成分提取分離方法的研究進(jìn)展[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥, 2007, 18(10): 2 581-2 583.

[8] 李洪洋, 文連奎. 大孔樹脂分離純化五味子醇甲的研究[J]. 食品與機(jī)械, 2011, 27(3): 56-58.

[9] 趙洪慶, 韓遠(yuǎn)山, 柳卓, 等. 焦慮性抑郁模型大鼠腦區(qū)單胺遞質(zhì)含量與神經(jīng)因子表達(dá)的變化[J]. 中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào), 2017, 25(4): 373-379.

[10] WU Dong, XIE He, LU Hai-feng, et al. Sensitive determina-tion of norepinephrine, epinephrine, dopamine and 5-hydroxy-tryptamine by coupling HPLC with [Ag(HIO6)2]5: luminol chemiluminescence detection[J]. Biomedical Chromatography Bmc, 2016, 30(9): 1 458-1 466.

[11] 程振玉, 楊英杰. 北五味子化學(xué)成分系統(tǒng)研究[J]. 吉林化工學(xué)院學(xué)報(bào), 2013, 30(5): 36-39.