姚玉靜YAO Yu-jing 楊 昭 黃佳佳 - 韓晉輝 - 梁志理 - 崔 春

(1. 廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院食品學(xué)院，廣東 廣州 510520；2. 廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院實驗實訓(xùn)中心，廣東 廣州 510520；3. 華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院, 廣東 廣州 510641)

牡蠣、雞肉和南極磷蝦富含蛋白質(zhì)，為重要的蛋白質(zhì)資源，其酶解產(chǎn)物具有較高的營養(yǎng)價值和商業(yè)價值。為探究酶解過程中鮮味肽產(chǎn)生的機理及鮮味成分構(gòu)成，需要對鮮味肽進行快速分離和結(jié)構(gòu)鑒定。酶解產(chǎn)物組分復(fù)雜，分離純化其中的鮮味肽成為質(zhì)譜鑒定最為重要的樣品處理工作。目前分離鮮味肽的方法主要有大孔樹脂、超濾、納濾、有機試劑萃取、凝膠色譜和離子交換色譜等[1-3]。侯清娥[4]將牡蠣酶解產(chǎn)物先通過超濾處理，再采用Sephadex G-25葡聚糖凝膠分離鮮味肽。鄧莉等[5]采用葡聚糖凝膠過濾柱法對雞肉酶解產(chǎn)物中不同分子量的多肽進行了分離。有機試劑萃取法可以避免其他方法操作繁瑣、耗時長、耗費大和分離肽種類少等缺點，為快速大規(guī)模分離小分子肽的最佳方法。乙醇為常用的萃取溶劑。目前國內(nèi)外采用乙醇萃取小分子肽的研究較少。Lebogang 等[6]研究60%，70%和80%乙醇分級大豆蛋白酶解產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)醇溶部分含有超過85%的低相對分子質(zhì)量肽(<2 ku)。利嘉祥等[7]研究發(fā)現(xiàn)乙醇快速富集亞麻籽油中的4種環(huán)肽，可替代柱層析法。張佳男[8]采用乙醇梯度分離花生中呈味肽，并對呈味特性進行了研究。目前未有文獻報道采用乙醇萃取牡蠣、雞肉和南極磷蝦酶解產(chǎn)物中的鮮味肽的研究。

本研究以牡蠣、雞肉和南極磷蝦為原料，采用胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成復(fù)合蛋白酶酶解原料，通過乙醇萃取酶解產(chǎn)物中的鮮味肽，探究乙醇萃取鮮味肽過程中感官評分、肽分子量分布和氨基酸組成的變化，以期尋找一種快速分離3種酶解產(chǎn)物中鮮味肽的方法，為牡蠣、雞肉和南極磷蝦酶解產(chǎn)物中鮮味肽的結(jié)構(gòu)鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮近江牡蠣：購于廣州黃沙水產(chǎn)市場，開殼取肉，攪碎均勻后分裝于封口袋中，-18 ℃凍藏備用；

新鮮清遠雞肉：購于廣州龍洞上社市場，取雞胸肉攪碎均勻后分裝于封口袋中，-18 ℃凍藏備用；

南極磷蝦：青島東風(fēng)遠洋漁業(yè)有限公司，攪碎均勻后分裝于封口袋中，-18 ℃凍藏備用；

胰蛋白酶：酶活 4 000 U/g，重慶市全新祥盛生物制藥有限公司；

風(fēng)味蛋白酶：酶活 500 LAPU/g，諾維信中國公司；

維生素B12(MW 1 855 u)、抑肽酶(MW 6 512 u)、細胞色素C(MW 12 384 u)、卵清蛋白(MW 43 000 u)、氨基酸標準品(2.5 μmol /mL)： 美國Sigma公司；

食用鹽、味精、蔗糖、檸檬酸：食品級；

其他試劑均為分析純；

pH計：S220型，梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；

凱氏定氮儀：K9840型，濟南海能儀器股份有限公司；

水浴振蕩培養(yǎng)箱：DKZ-3B型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

分析天平：TLE104E型，梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；

臺式高速冷凍離心機：3K15型，德國Sigma公司；

高效液相色譜儀：LC-20A型，日本島津制作所；

全自動氨基酸分析儀：L8900型，日本日立公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶解產(chǎn)物制備 根據(jù)文獻[9]，凍藏原料置于室溫溶解后，根據(jù)原料的質(zhì)量按照1∶1的比例加入相應(yīng)重量的蒸餾水，攪拌均勻，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0(酶解過程中每隔2 h調(diào)pH 1次)，添加牡蠣重量0.4%的胰蛋白酶和0.2%的風(fēng)味蛋白酶，在55 ℃的水浴酶解24 h。酶解結(jié)束后沸水浴20 min滅酶，8 000 r/min離心20 min，取上清液即為酶解產(chǎn)物，于-18 ℃ 凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 乙醇萃取酶解產(chǎn)物鮮味肽 根據(jù)文獻[6]，修改如下：取50 mL酶解產(chǎn)物，在50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至固形物含量為40%，加入95%乙醇調(diào)節(jié)乙醇濃度至 90%，室溫狀態(tài)下攪拌萃取30 min，然后離心(4 ℃，6 000 r/min，30 min)收集上清液。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇，濃縮物用10 mL蒸餾水復(fù)溶，溶液冷凍干燥后即為90%乙醇萃取物，-18 ℃凍藏備用。

1.2.3 水解度測定 氨基酸態(tài)氮含量根據(jù)甲醛滴定法測定[10]?？偟扛鶕?jù)GB 5009.5-2010測定。水解度(DH)按式(1)計算：

(1)

式中：

W1——酶解液氨基酸態(tài)氮含量，g；

W0——原料中氨基酸態(tài)氮含量，g；

W——原料總氮含量，g。

1.2.4 感官評定 根據(jù)文獻[11]，選取7名感官評定員在感官評價室進行感官評定。感官評定員在評定之前經(jīng)過基本滋味培訓(xùn)，進行培訓(xùn)的標準品分別是鮮味(0.20%味精)，甜味(1.00%蔗糖)，咸味(0.35%食用鹽)，酸味(0.04%檸檬酸)，苦味(0.02 g/L鹽酸奎寧)。使用5點線性坐標，將標準品梯度稀釋，最高濃度為10分，最低濃度為2分，每稀釋一個梯度，感官分值降低2分。樣品配制為固形物濃度為10%的溶液，采用滋味特征描述與感官定量分析對樣品進行感官評定。評定步驟：評定員從低濃度至高濃度逐一品評某一滋味各稀釋梯度標準液并記錄滋味強度，標準液在口中停留 15～20 s，之后吐掉，蒸餾水漱口，取5 mL測試樣液放于口中，樣液在口中停留 15～20 s，之后吐掉，根據(jù)樣品與各稀釋梯度標準液滋味強度的相近性進行打分。同時用文字記錄樣品滋味特征。

1.2.5 肽分子量分布測定 根據(jù)文獻[9]，將樣品稀釋至蛋白濃度為1 mg/mL，通過0.22 μm濾膜過濾，使用高效液相色譜測定樣液中肽分子量分布情況，洗脫液為0.04 mol/L磷酸緩沖液，流速為 1 mL/min，檢測波長為220 nm，凝膠柱為TSk gel G2000 SWxL(300 mm×7.8 mm，5 μm)。標準肽樣品分別為：卵清蛋白(MW 43 000 u)，細胞色素C(MW 12 384 u)，抑肽酶(MW 6 512 u)，維生素B12(MW 1 855 u)。根據(jù)標準肽樣品的洗脫時間得到標準曲線方程：

y=-0.338 3x+7.345 1(R2=0.991 7)，

(2)

式中：

y——分子量的對數(shù)，u；

x——保留時間，min。

1.2.6 氨基酸組成分析 根據(jù)GB/T 5009.124-2003，采用全自動氨基酸分析儀測定。肽的氨基酸含量按式(3)計算：

T=T1-T2，

(3)

式中：

T——肽的氨基酸含量，mg/100 mL；

T1——總氨基酸含量，mg/100 mL；

T2——游離氨基酸含量，mg/100 mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解產(chǎn)物水解度分析

為獲得富含小分子肽和游離氨基酸的酶解產(chǎn)物，充分水解原料中的大分子蛋白質(zhì)，采用水解產(chǎn)物風(fēng)味較好的風(fēng)味蛋白酶和水解效率較高的胰蛋白酶組成復(fù)合蛋白酶酶解原料。從圖1可以看出，復(fù)合蛋白酶酶解牡蠣、雞肉和南極磷蝦均可達到較高的水解度。

圖1 酶解產(chǎn)物水解度Figure 1 Hydrolysis degree of enzymatic hydrolysate

2.2 乙醇萃取3種酶解產(chǎn)物鮮味肽的感官評定

酸、甜、苦、咸和鮮為人類的5種基本味覺，產(chǎn)生的機理是溶解于水或唾液中的呈味成分刺激味蕾，信號傳導(dǎo)至大腦皮層產(chǎn)生興奮或味覺[12]。人的感官評定是目前鑒定呈味肽最常用、有效和直觀的方法。因此通過感官分析，可為篩選鮮味肽提供重要的依據(jù)。

從圖2可以看出，牡蠣酶解產(chǎn)物滋味復(fù)雜，具有鮮味、甜味、咸味、酸味和苦味，鮮味評分值為4.8。經(jīng)過90%乙醇萃取后，上清液具有鮮、咸和酸味，評分值分別為7.9，2.7，3.8。90%乙醇萃取牡蠣酶解產(chǎn)物鮮味評分較萃取前酶解產(chǎn)物有較大的提高。雞肉酶解產(chǎn)物滋味豐富，具有鮮味、甜味、咸味和酸味，沒有苦味，鮮味評分值為8.3。經(jīng)過90%乙醇萃取后，上清液具有鮮、咸、甜和酸味，評分值分別為8.5，1.6，1.9，3.5。90%乙醇萃取雞肉酶解產(chǎn)物鮮味評分與萃取前酶解產(chǎn)物差別較小。南極磷蝦酶解產(chǎn)物具有鮮、咸和甜味，沒有苦味，鮮味評分值為6.5。經(jīng)過90%乙醇萃取后，上清液具有鮮、咸、甜和酸味，評分值分別為8.0，1.9，2.3，2.6。90%乙醇萃取南極磷蝦酶解產(chǎn)物鮮味評分較萃取前有所提高。

圖2 90%乙醇萃取3種酶解產(chǎn)物鮮味肽過程中組分 的滋味特性雷達圖

Figure 2 Radar map of the components in the process of extracting three hydrolysates umami peptide with 90% ethanol

由以上研究可看出，經(jīng)過90%乙醇萃取3種酶解產(chǎn)物的上清液均具有較強的鮮味，并且90%乙醇萃取牡蠣和南極磷蝦酶解產(chǎn)物上清液鮮味評分均較萃取前有所提高。據(jù)此分析，90%乙醇萃取物中含有大量鮮味成分。

2.3 乙醇萃取3種酶解產(chǎn)物鮮味肽的肽分子量分布

分子量分布是肽類產(chǎn)物的重要特征性指標，直接反映產(chǎn)物中不同大小分子量肽類的構(gòu)成[13]。肽類的滋味與其相對分子量密切相關(guān)，分子量>5 ku的肽無滋味，<5 ku 的可能會顯現(xiàn)出酸、甜、苦、咸和鮮味[14]。Ogasawara等[15]發(fā)現(xiàn)大豆水解液中分子質(zhì)量為1～5 ku的肽具有鮮味。Rhyu等[16]對韓國豆醬水提物進行分級研究，發(fā)現(xiàn)鮮味最強的組分是肽分子量為0.5～1.0 ku的短肽，對豆醬的風(fēng)味起主要作用。因此，研究萃取產(chǎn)物肽分子量分布，對篩選鮮味肽具有重要的價值。

由圖3可知，牡蠣酶解產(chǎn)物中肽分子量分布范圍>10，5～10，3～5，1～3，<1 ku的比例分別為2.05%，14.30%，38.97%，13.78%，30.90%，5 ku以下的肽比例達83.64%；經(jīng)過90%乙醇萃取后，上清液中肽分子量分布范圍>10，5～10，3～5，1～3，<1 ku的比例分別為0.21%，6.79%，19.48%，36.98%，36.55%，5 ku以下的肽比例達93%。雞肉酶解產(chǎn)物中肽分子量分布范圍>10，5～10，3～5，1～3，<1 ku 的比例分別為3.93%，20.79%，25.60%，25.53%，24.16%，5 ku以下的肽比例達75.28%；經(jīng)過90%乙醇萃取后，上清液中肽分子量分布范圍>10，5～10，3～5，1～3，<1 ku 的比例分別為0.85%，12.33%，28.90%，27.39%，30.53%，5 ku以下的肽比例達86.82%。南極磷蝦酶解產(chǎn)物中肽分子量分布范圍>10，5～10，3～5，1～3，<1 ku的比例分別為3.10%，20.07%，26.33%，20.81%，29.68%，5 ku以下的肽比例達76.83%；經(jīng)過90%乙醇萃取后，上清液中肽分子量分布范圍>10，5～10，3～5，1～3，<1 ku的比例分別為0.38%，11.76%，31.44%，22.30%，34.11%，5 ku以下的肽比例達87.86%。

ML. 牡蠣酶解產(chǎn)物 90% ML. 90%乙醇萃取牡蠣酶解產(chǎn)物 JR. 雞肉酶解產(chǎn)物 90% JR. 90%乙醇萃取雞肉酶解產(chǎn)物 NJLX. 南極磷蝦酶解產(chǎn)物 90% NJLX. 90%乙醇萃取南極磷蝦酶解產(chǎn)物

圖3 90%乙醇萃取3種酶解產(chǎn)物鮮味肽過程中組分的肽分子量分布

Figure 3 Peptide molecular weight distribution of the components in the process of extracting three hydrolysates umami peptide with 90% ethanol

以上結(jié)果分析可發(fā)現(xiàn)，酶解產(chǎn)物經(jīng)過90%乙醇萃取后，上清液中的小分子肽增多，大分子量肽明顯減少。特別是酶解產(chǎn)物中分子量>10 ku和5～10 ku的肽，經(jīng)過90%乙醇萃取明顯減少。

2.4 乙醇萃取3種酶解產(chǎn)物鮮味肽的氨基酸組成分析

現(xiàn)有大量鮮味肽被鑒定，從肽結(jié)構(gòu)上分析可得出其中含量較高比例的鮮味和甜味氨基酸。崔春等[17]從谷朊粉發(fā)酵液中鑒定出一個鮮味肽：Asp-Cys-Gly(由天冬氨酸、半胱氨酸和甘氨酸構(gòu)成)。Yamasaki等[18]從木瓜蛋白酶處理的牛肉中分離了具有鮮味的牛肉辛肽：Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala(由賴氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酸、絲氨酸、亮氨酸和丙氨酸構(gòu)成)。Noguchi等[19]從魚肉蛋白酶解液中鑒定出一個鮮味極強的鮮味肽：Glu-Glu-Glu，閾值為0.003 mol/L，并發(fā)現(xiàn)獲得的30多條鮮味肽主要由谷氨酸殘基組成。Rhyu等[16]認為具有酸性殘基(谷氨酸，天冬氨酸)的小分子肽對鮮味滋味起到很大作用。Gómez-Ruiz等[20]同樣發(fā)現(xiàn)谷氨酸殘基數(shù)較多的多肽對奶酪鮮味呈味特性有關(guān)鍵作用。因此，研究萃取產(chǎn)物氨基酸組成并進行分析，對篩選鮮味肽具有重要的指導(dǎo)意義。

從表1和圖4可以看出，牡蠣酶解產(chǎn)物中含有豐富的游離氨基酸，17種氨基酸含量達到134 mg/100 mL。小分子肽中17種氨基酸含量為60.90 mg/100 mL，其中鮮味氨基酸谷氨酸和天冬氨酸比例分別為 21.35%，19.05%，甜味氨基酸蘇氨酸和甘氨酸比例分別為 11.82%，10.84%，其余滋味氨基酸比例較低。經(jīng)過90%乙醇萃取，上清液中游離氨基酸總量為17.27 mg/100 mL，高于肽的氨基酸總量(6.07 mg/100 mL)。小分子肽中17種氨基酸比例均勻，沒有甘氨酸，鮮味和甜味氨基酸比例為49.09%，苦味氨基酸比例為36.24%，芳香族氨基酸比例為14.66%。其中甜味氨基酸蘇氨酸和丙氨酸比例分別為 14.50%，11.53%，苦味氨基酸亮氨酸比例為11.53%，其余滋味氨基酸比例較低。推測90%乙醇萃取牡蠣酶解產(chǎn)物上清液小分子肽中含有較高比例的甜味和鮮味氨基酸。

表1 牡蠣酶解產(chǎn)物及其乙醇萃取物的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of the components in the process of extracting oyster hydrolysates umami peptide with 90% ethanol

ML. 牡蠣酶解產(chǎn)物 90% ML. 90%乙醇萃取牡蠣酶解產(chǎn)物 JR. 雞肉酶解產(chǎn)物 90% JR. 90%乙醇萃取雞肉酶解產(chǎn)物 NJLX. 南極磷蝦酶解產(chǎn)物 90% NJLX. 90%乙醇萃取南極磷蝦酶解產(chǎn)物

圖4 90%乙醇萃取3種酶解產(chǎn)物鮮味肽過程中組分的肽滋味氨基酸比例

Figure 4 The ratio of peptide with flavour amino acid of the components in the process of extracting three hydrolysates umami peptide with 90% ethanol

由表2和圖4可知，雞肉酶解產(chǎn)物中游離氨基酸的含量與小分子肽中氨基酸含量比較接近，17種氨基酸含量分別為241.45，195.85 mg/100 mL。小分子肽中鮮味氨基酸谷氨酸和天冬氨酸比例分別為 21.44%，16.44%，其余滋味氨基酸比例較低。經(jīng)過90%乙醇萃取，上清液中游離氨基酸總量為41.70 mg/100 mL，高于肽的氨基酸總量(11.60 mg/100 mL)。這17種氨基酸小分子肽中均存在，鮮味和甜味氨基酸比例較高，鮮味和甜味氨基酸比例為86.03%，苦味氨基酸比例為12.07%，芳香族氨基酸比例為1.90%。其中鮮味氨基酸谷氨酸和天冬氨酸比例分別為 26.72%，17.07%，甜味氨基酸脯氨酸和甘氨酸比例均為13.79%，其余滋味氨基酸比例較低。推測90%乙醇萃取雞肉酶解產(chǎn)物上清液小分子肽中含有極高比例的甜味和鮮味氨基酸。

從表3和圖4可以看出，南極磷蝦酶解產(chǎn)物中含有豐富的游離氨基酸，17種氨基酸含量達到201.60 mg/100 mL。小分子肽中17種氨基酸含量為72.90 mg/100 mL，其中鮮味氨基酸谷氨酸和天冬氨酸比例分別為 27.43%，24.14%，甜味氨基酸甘氨酸比例為9.88%，其余滋味氨基酸比例較低。經(jīng)過90%乙醇萃取，上清液中游離氨基酸總量為26.37 mg/100 mL，與肽的氨基酸總量(20.03 mg/100 mL)較為接近。小分子肽中17種氨基酸均存在，鮮味和甜味氨基酸比例為66.40%，苦味氨基酸比例為28.46%，芳香族氨基酸比例為5.14%。其中鮮味氨基酸谷氨酸和天冬氨酸比例分別為21.47%，10.43%，其余滋味氨基酸比例較低。推測90%乙醇萃取南極磷蝦酶解產(chǎn)物上清液小分子肽中含有較高比例的甜味和鮮味氨基酸。

表2 雞肉酶解產(chǎn)物及其乙醇萃取物的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of the components in the process of extracting chicken hydrolysates umami peptide with 90% ethanol

表3 南極磷蝦酶解產(chǎn)物及其乙醇萃取物的氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of the components in the process of extracting antarctic krill hydrolysates umami peptide with 90% ethanol

結(jié)合感官評定、肽分子量分布和氨基酸組成分析結(jié)果，可認為90%乙醇萃取3種酶解產(chǎn)物的小分子肽中含有較高比例的鮮味肽。

3 結(jié)論

采用復(fù)合蛋白酶酶解牡蠣、雞肉和南極磷蝦，獲得高水解度的酶解產(chǎn)物。通過90%乙醇分別萃取3種酶解產(chǎn)物，萃取上清液可獲得豐富的鮮味肽。90%乙醇萃取3種酶解產(chǎn)物的上清液感官評定均具有較強的鮮味，且90%乙醇萃取牡蠣和南極磷蝦酶解產(chǎn)物上清液鮮味評分均較萃取前有所提高。90%乙醇萃取牡蠣、雞肉和南極磷蝦酶解產(chǎn)物上清液中分子量<5 ku的肽比例分別為93.00%，86.82%，87.86%。3種酶解產(chǎn)物中分子量>10 ku和5～10 ku的肽，經(jīng)過90%乙醇萃取后明顯減少。90%乙醇萃取3種酶解產(chǎn)物的上清液小分子肽中含有較高比例的甜味和鮮味氨基酸。本研究表明利用90%乙醇可快速萃取牡蠣、雞肉和南極磷蝦酶解產(chǎn)物中的鮮味肽，為快速萃取酶解產(chǎn)物中的鮮味肽提供了新的方法。

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