郭登峰GUO Deng- 王羚佳 - 舒曉夢 - 楊 瀟 張 偉 張廣峰 -

(1. 西華大學食品與生物工程學院，四川 成都 610039；2. 成都瑞琦科技實業(yè)股份有限公司，四川 成都 610041)

菌落總數(shù)是反映食品被微生物污染狀況和新鮮程度的重要指標[1]。目前菌落總數(shù)快速檢測方法包括顯色培養(yǎng)基法、ATP 生物熒光法、微熱量法、阻抗法、近紅外光譜技術(shù)和快速檢測卡片法等[2-4]?？焖贆z測卡片(下文統(tǒng)一稱為檢測卡)與傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)平板檢測相比，因其省略了培養(yǎng)基制作、消毒環(huán)節(jié)，使得勞動強度大幅減輕；還具有體積小、便于攜帶儲存、檢測周期短、操作簡便等優(yōu)點[5-6]，從而被運用于快速檢測的領(lǐng)域，極大地簡化了對微生物總數(shù)檢測的程序。

從1955年德國學者FJ. Forg發(fā)明了快速檢測大腸菌群的紙片法以來[7]，檢測卡已經(jīng)得到了長足的發(fā)展。目前菌落檢測卡主要分為濾紙、無紡布和冷水溶性凝膠3種類型[8]。其中濾紙和無紡布雖然成本低廉，但是由于孔隙大，保水性差，不利于菌體生長，導致菌落計數(shù)不準確。與前兩者相比，冷水溶性凝膠卻有著穩(wěn)定性好、透明度高、易挑菌、菌落計數(shù)準確等優(yōu)點[9-10][11]9-14。而在國內(nèi)外應(yīng)用最為廣泛的是美國3M公司的PetrifilmTM菌落總數(shù)檢測卡，由于具有較高的可靠性，曾被納入中國國家標準[12]，但是昂貴的價格，也限制了其在中國一般實驗室和企業(yè)的大規(guī)模使用。因此研究具有自主知識產(chǎn)權(quán)的冷水溶性凝膠菌落檢測卡片，對于降低檢測卡的使用成本，促進微生物指標檢測的廣泛開展，提升食品安全具有重要意義。

本研究主要通過對常見的冷水溶性凝膠劑[卡拉膠、黃原膠、瓜爾膠、刺槐豆角、聚丙烯酸鈉、羧甲基纖維素(CMC)]進行篩選組合、探索凝膠劑配方及其與培養(yǎng)基混合比例、優(yōu)化顯色劑的添加量等來提升水冷凝膠測試卡的使用性能，為新型菌落總數(shù)檢測卡的研發(fā)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)：AR級，上海馨晟試化工科技有限公司；

胰蛋白胨、酵母提取物：AR級，西班牙OXOID公司；

氯化鈉、瓜爾膠、卡拉膠、黃原膠、CMC、聚丙烯酸鈉：AR級，成都科龍化工試劑廠；

乙醇：AR級，國藥集團化學試劑有限公司；

全自動高溫蒸汽滅菌鍋：G154DWS型，致微(廈門)儀器有限公司；

電熱恒溫隔水式培養(yǎng)箱：SGSP-02型，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；

混合型球磨儀：MM400型，德國RETSCH(萊馳)公司；

萬分之一電子天平：TB-214型，美國DENVER INSTRUMENT(丹佛儀器)公司；

紫外可見分光光度計：UV2400型，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；

pH儀：MP511型，上海三信公司；

質(zhì)構(gòu)儀：TA·XT2i型，英國SMS公司。

1.2 試驗菌種

大腸桿菌(LE392)、岅崎腸桿菌(ATCC51329)、福氏志賀菌(CMCC51252)、金黃色葡萄球菌(ASI1861)、沙門菌(ASI1859)、銅綠假單胞菌(CICC10204)、糞鏈球菌(CMCC32220)：西華大大學食品安全實驗室保存。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化與菌懸液的制備 將各菌種分別于LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)2 h活化，并涂布于LB平板上并于37 ℃倒置培養(yǎng)12 h，挑取單菌落轉(zhuǎn)入LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，將各菌種菌液等比例混合后稀釋103倍，待用。

1.3.2 測試卡凝膠培養(yǎng)基粉的制備 LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g充分混合)與凝膠粉按一定比例充分混合后，經(jīng)超微粉碎1 min，并用紫外線進行殺菌待用。

1.3.3 測試片法 將制備好的測試卡凝膠培養(yǎng)基粉黏附在上下層透明塑料卡上。吸取1 mL 新鮮制備的菌液，翻開測試片上層，均勻滴于測試片中央，小心蓋上上層膜，輕輕壓平使樣液充滿測試片，靜置5 min，待凝膠固化后于37 ℃培養(yǎng)24 h，計數(shù)紅色菌落[13-14]。

1.3.4 凝膠的吸水率、保水率測定 稱取1.00 g膠粉置于燒杯中，加入500.00 g蒸餾水混勻，放置5 min使其充分溶脹成膠，用100目篩過濾，精密稱定濾液重量。吸水率按式(1)計算：

(1)

式中：

A——吸水率，%；

M1——加入蒸餾水質(zhì)量，g；

M2——濾出蒸餾水質(zhì)量，g；

M0——稱取的凝膠粉水質(zhì)量，g。

稱取1.00 g膠粉置于潔凈燒杯中，加入500.00 g蒸餾水混勻，放置5 min使其充分溶脹成膠，棄去多余水分，再精密稱取凝膠重量，將其置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，分別放置8，24 h 后精密稱定重量。按式(2)計算保水率。

(2)

式中：

C——保水率，%；

M1——放置不同時間后的凝膠質(zhì)量，g；

M0——溶脹成凝膠后的質(zhì)量，g。

1.3.5 水擴散速度與成膠性評價 在透明塑料卡上繪制一個直徑10 cm的圓，將成膠劑黏附在透明塑料卡上，向圓心滴入1 mL的蒸餾水并開始計時，水擴散至圓形邊緣時停止計時，滴入水后靜置5 min，觀察是否凝固形成凝膠。

1.3.6 凝膠物性分析 凝膠劑制成厚度為15 mm的凝膠，按照ISO 9665方法測試膠體物性。即在質(zhì)構(gòu)儀上選用P/0.5R柱狀探頭，以壓縮模式檢測，測前速度1.0 mm/s，測試速度1.0 mm/s，測后速度1.0 mm/s，刺入深度10 mm，數(shù)據(jù)采集速率400 pps；觸發(fā)力 2 g。以刺入過程中測得的最大力量為凝膠強度，以達到最大力量時的刺入距離表征凝膠彈性。在穿刺中力量和距離越大，表明凝膠越有韌性和彈性。

1.3.7 凝膠劑組成優(yōu)化 將根據(jù)吸水率、保水率及成膠情況優(yōu)選出的凝膠進行兩兩組合，評價其水擴散速度和成膠性。選擇擴散速度和成膠性好的凝膠組合，并進一步進行物性比較，以篩選出最優(yōu)的凝膠劑組成。

1.3.8 凝膠與培養(yǎng)基的比例優(yōu)化 將優(yōu)化過的混合凝膠粉與培養(yǎng)基分別按1∶1，1∶2，2∶1的質(zhì)量比混勻，加入蒸餾水制凝膠，在37 ℃下培養(yǎng)0，12，24 h后，參考吳許文[11]33的方法測定其pH，在37 ℃下培養(yǎng)24 h后測定凝膠物性，并參考吳許文[11]35的方法在500 nm下測其透光度。 選擇可在37 ℃ 恒溫條件下pH穩(wěn)定、凝膠強度合適、透光率好、可穩(wěn)定凝固、成膠無氣泡無褶皺黏附，菌落生長正常、分布均勻、清晰可辨的培養(yǎng)基凝膠組合。

1.3.9 TTC加入量的優(yōu)化 根據(jù)相關(guān)文獻[15-17]，TTC在培養(yǎng)基中濃度超過0.100 mg/mL時抑菌較明顯，低于0.020 mg/mL 時顯色作用不明顯。因此選擇TTC實際濃度0.020，0.025，0.030，0.035，0.040 mg/mL進行TTC加入量優(yōu)化。試驗中，先配制濃度為0.040，0.050，0.060，0.070，0.080 mg/mL 的TTC溶液，滅菌后分別與稀釋105倍的菌液按1∶1體積比混合后，接種于測試卡上并于37 ℃培養(yǎng)24 h 后計數(shù)觀察。選擇顯色明顯、易于計數(shù)且對微生物無抑制作用的TTC濃度。

1.3.10 測試卡片法與傾注培養(yǎng)法對比 將混合菌液依次稀釋103，104，105，106倍，分別采用測試卡片法與傾注培養(yǎng)法(按GB/T 4789.2—2016執(zhí)行)進行檢測，比較二者菌落總數(shù)的檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 冷水溶凝膠的基本性能

凝膠吸水率與保水率的優(yōu)良將直接影響到測試卡的測試效果。吸水率優(yōu)良的凝膠可以使水快速地在測試卡上擴散，不僅縮短操作時間，還能保證菌落擴散均勻[18]。保水率優(yōu)良的凝膠將有效地保持測試卡上的水分不流失蒸發(fā)，從而為測試卡上的微生物提供一個穩(wěn)定合適的生長環(huán)境。

從凝膠劑吸水率和保水率試驗結(jié)果可知(表1)，各凝膠吸水率大小順序為：聚丙烯酸鈉>黃原膠>CMC>瓜爾膠>卡拉膠。其中聚丙烯酸鈉的吸水率太大，并且吸濕性極強，暴露在空氣中時很容易結(jié)塊黏連，不適合單獨用于測試卡的制作[19]。對各凝膠培養(yǎng)8 h后，凝膠保水率差別較??；24 h后，保水率發(fā)生顯著變化，各凝膠之間的差別也較明顯，各凝膠保水率大小順序為：聚丙烯酸鈉>瓜爾膠>CMC>黃原膠>卡拉膠。

表1 凝膠劑的吸水率與保水率?Table 1 Water absorption and water retention of gels (n=3) %

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

由表2可知，卡拉膠、聚丙烯酸鈉、瓜爾膠均可以快速吸水，使水在膠粉內(nèi)快速擴散；其中以卡拉膠擴散速度最快，瓜爾膠次之，聚丙烯酸鈉最慢。但在黃原膠與CMC中水擴散極為緩慢。CMC、聚丙烯酸鈉、黃原膠可完全凝固成膠，但黃原膠凝固后氣泡較多；卡拉膠、瓜爾膠未能完全凝固，成流動狀態(tài)。此外各凝膠劑中黃原膠成本最高、卡拉膠和瓜爾膠次之、CMC與聚丙烯酸鈉最低。

表2 凝膠劑的水擴散速度和成膠情況Table 2 Gel water diffusion speed and gel conditions

凝膠劑基本性能試驗的結(jié)果表明，選用以上任何單一凝膠劑均不能滿足菌落總數(shù)測試卡用冷水溶性凝膠的要求。綜合考慮各凝膠劑的吸水率、保水率、水擴散速度、成膠狀況和成本，需將凝膠進行組合優(yōu)化。

2.2 凝膠組合優(yōu)化

從表3可知，由于水不易在黃原膠膠粉內(nèi)擴散，故需在黃原膠中加入卡拉膠以增加其水擴散性，但加入卡拉膠后不能形成可凝固的凝膠；將聚丙烯酸鈉分別與CMC、瓜爾膠進行混合，但混合后擴散速率較慢且極易吸潮聚團，不能成膠；只有卡拉膠與CMC、瓜爾膠混合時具有較好的水擴散速度和成膠性。

比較卡拉膠與CMC、瓜爾膠組合的凝膠物性發(fā)現(xiàn)(表4)，卡拉膠與CMC組合的凝膠物性顯著好于卡拉膠與瓜爾膠組合，且卡拉膠與CMC組合的成本更為經(jīng)濟，綜合考慮選取卡拉膠與CMC按2∶1的質(zhì)量比混合為宜。

表3 不同凝膠組合的水擴散速度和成膠情況Table 3 Gel combination water diffusion speed and gel combination conditions

表4 不同凝膠組合的物性比較?Table 4 Gel composition properties comparison (n=3)

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 培養(yǎng)基與凝膠的比例優(yōu)化

培養(yǎng)基與凝膠的混合比例將直接影響到菌落檢測的效果。適合的比例才能使其在加水后迅速溶解形成凝膠培養(yǎng)基，滿足微生物正常生長代謝的需求，并起到承載微生物的作用?；旌夏z粉與培養(yǎng)基分別按1∶2，1∶1，2∶1的質(zhì)量比混勻制成培養(yǎng)基凝膠。由表5可知，在37 ℃下不同時間點的pH基本保持穩(wěn)定并成中性，表明培養(yǎng)溫度、混合比例和培養(yǎng)時間的改變對pH影響不大。

而在37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，按照上述混合比例制作的培養(yǎng)基凝膠的物性、透光度、成膠效果和菌落生長狀況均有較大的差異(表6)，其中隨著混合膠粉比例的增加，培養(yǎng)基凝膠物性指標和透光度都相應(yīng)地提高，以質(zhì)量比2∶1制備的培養(yǎng)基凝膠在物性指標和透光度上顯著優(yōu)于其他2組。此外雖然制作的培養(yǎng)基凝膠均能在5 min內(nèi)凝固成膠，但在37 ℃ 下培養(yǎng)24 h后，以1∶1，1∶2質(zhì)量比制備的培養(yǎng)基凝膠出現(xiàn)了部分融化，嚴重影響菌落生長。而以2∶1質(zhì)量比制備的培養(yǎng)基凝膠仍然保持凝固狀態(tài)，整體透明度好且菌落生長正常、分布均勻易于計數(shù)。因此，以混合凝膠粉與培養(yǎng)基按質(zhì)量比2∶1混合為最優(yōu)。

表5 37 ℃恒溫培養(yǎng)期間凝膠的pHTable 5 pH of gel during cultivation (n=3)

表6 不同比例凝膠的物理特性及菌落生長情況?Table 6 Physical properties of different proportions of gels and colony growth (n=3)

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 TTC的含量優(yōu)化

TTC對菌落的顯色相對于其他顯色劑更為靈敏準確，而且在常溫下它與菌落形成的顏色在空氣中十分穩(wěn)定，可以保存較長時間，方便計數(shù)。但其濃度對微生物生長卻有顯著影響，需要對其使用濃度進行優(yōu)化[20]。

如表7所示，當TTC濃度在0.025 mg/mL以下時，菌落生長分布均勻且與對照組無顯著差異；但TTC濃度超過0.030 mg/mL 時，菌落數(shù)量顯著低于對照組，表明微生物的生長受到抑制。而當TTC濃度為0.025 mg/mL時對菌落的染色比0.020 mg/mL更加清晰可辯，暴露在空氣中也更加穩(wěn)定。因此，以TTC在培養(yǎng)基中實際濃度0.025 mg/mL為最優(yōu)加入量。

表7 TTC濃度對菌落總數(shù)的影響?Table 7 Total number of colonies at different concentrations of TTC (n=3)

? 同行不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.5 與平板法的檢測比較

采用最優(yōu)條件的測試卡片法與傾注培養(yǎng)法進行對比，發(fā)現(xiàn)二者在菌落生長的形態(tài)上無明顯差異。由表8可知，2種方法在各稀釋濃度上的菌落計數(shù)結(jié)果并無顯著差異。

表8 2種不同方法的菌落數(shù)Table 8 Number of colonies in two different ways (n=3) CFU/mL

3 結(jié)論

采用卡拉膠和CMC在2∶1的質(zhì)量比下制成混合凝膠劑，再與培養(yǎng)基粉以2∶1的質(zhì)量比混合制成的凝膠培養(yǎng)基用于制備菌落總數(shù)測試卡片具有較好的效果，在TTC濃度為0.025 mg/mL時，菌落顯色效果最佳且不會對細菌生長產(chǎn)生抑制作用。在該條件下采用測試卡片法與傾注培養(yǎng)法對微生物菌落總數(shù)的檢測結(jié)果無顯著差異。

[1] 姚景慧, 崔生輝, 付萍, 等. 菌落總數(shù)檢測紙片的比較試驗[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志, 2000(3): 76-77.

[2] 程金權(quán), 胡繼貴. 食品中菌落總數(shù)快速檢測研究進展[J]. 食品與發(fā)酵科技, 2014, 50(6): 1-5.

[3] 熊海燕. 菌落總數(shù)檢測技術(shù)研究進展[J]. 糧食與油脂, 2010(4): 42-44.

[4] HAWRONSKYJ Jane-marie, HOLAH John. ATP: a universal hygiene monitor[J]. Trends in Food Science & Technology, 1997, 8(3): 79-84.

[5] 孫永. 食品衛(wèi)生微生物快速測試卡的研制[D]. 武漢： 中國科學院武漢病毒研究所, 2007： 15-21.

[6] SCHOELLER N P, INGHAM S C. Comparison of the Baird-Parker agar and 3M TM Petrifilm TM rapid S. aureus count plate methods for detection and enumeration of Staphylococcus aureus[J]. Food Microbiology, 2001, 18(6): 581-587.

[7] 孫永. 微生物快速測定卡凝膠劑性能初步研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2007, 17(3): 419-421.

[8] 王靜. 以冷水溶性凝膠為載體的細菌快速檢測紙片的凝膠劑優(yōu)化[J]. 衛(wèi)生研究, 2012, 41(2): 300-302.

[9] WILLIAMS M G, HESSELROTH K E, RAJAGOPAL R. Device for propagation and storage of microorganisms: US, 6649406[P]. 2003-11-18.

[10] 王少鵬, 劉艷麗, 馮沖, 等. 食品添加劑聚丙烯酸鈉的合成工藝研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學, 2011, 39(12): 7 095-7 096.

[11] 吳許文. 食品衛(wèi)生微生物培養(yǎng)基冷水可凝膠HKG的研究和應(yīng)用[D]. 武漢: 中國科學院武漢病毒研究所, 2009.

[12] 中華人民共和國衛(wèi)生部, 中國國家標準化委員會. GB/T 4789.2—2008食品衛(wèi)生微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定[S]. 北京: 中國標準出版社, 2009: 11-21.

[13] 陳曉瓏, 董煜, 陳燦映, 等. 大腸菌群測試片中冷水可凝凝固劑初步研究[J]. 河南工業(yè)大學學報: 自然科學版, 2013, 34(1): 77-81.

[14] 吳許文, 吳清平, 張淑紅, 等. 細菌測試片的冷水可凝凝固劑初步研究和應(yīng)用[J]. 微生物學通報, 2009, 36(11): 1 783-1 788.

[15] 王曉文, 張俊偉. TTC應(yīng)用于食品菌落總數(shù)測定的研究[J]. 遼寧大學學報: 自然科學版, 2011, 38(1): 86-89.

[16] 曹楊. 紙片法測定細菌總數(shù)——TTC顯色濃度試驗[J]. 江蘇食品與發(fā)酵, 2008(4): 39-40.

[17] 劉睿哲. 食品菌落總數(shù)測定中TTC做顯色劑的探索[J]. 產(chǎn)業(yè)與科技論壇, 2011, 10(20): 64-65.

[18] 賈振宇, 崔英德, 黎新明, 等. 聚丙烯酸鈉高吸水性樹脂的改性研究進展[J]. 化工進展, 2004, 23(5): 468-471.

[19] 王靜, 陳萍, 任常菲. 以冷水溶性凝膠為載體的細菌快速檢測紙片的凝膠劑優(yōu)化[J]. 衛(wèi)生研究, 2012, 41(2): 300-302.

[20] 廖茂彬, 陳向標, 賴明河. 食品中菌落總數(shù)的國標法測定注意事項及微生物快速測試卡法檢測[J]. 中國食品與營養(yǎng), 2013, 19(7): 16-18.