肖利龍XIAO Li-long 花 錦

(1. 太原學(xué)院，山西 太原 030032；2. 山西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，山西 太原 030032)

黃曲霉毒素(aflatoxin，AFT)是一類具有類似化學(xué)結(jié)構(gòu)，由黃曲霉 (aspergillus flavus) 寄生曲霉 (A.parasiticus) 產(chǎn)生的強(qiáng)毒性和強(qiáng)致癌性的次生代謝產(chǎn)物組成[1]，主要成分有B1、B2、G1和G2。環(huán)境潮濕的地區(qū)存放食品和飼料中容易滋生黃曲霉毒素，其中黃曲霉毒素B1，被世界衛(wèi)生組織劃定為1類致癌物，其毒性是砒霜的68倍，對(duì)肝臟組織的破壞性極強(qiáng)，經(jīng)常會(huì)在花生、玉米及其制品中檢出[2]。黃曲霉毒素對(duì)人及動(dòng)物肝臟組織有很嚴(yán)重的破壞作用會(huì)導(dǎo)致肝癌或死亡。黃曲霉毒素B1經(jīng)常被報(bào)道污染食品，其他3類物質(zhì)少見報(bào)道[3]。因此，許多國家規(guī)定了黃曲霉毒素在食品中的限量值。中國GB 2761—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》明確規(guī)定花生中黃曲霉毒素B1不得高于20 μg/kg。

目前研究各類食品檢測(cè)方法的不確定度評(píng)定報(bào)道很多[4-6]，黃曲霉毒素B1的不確定度評(píng)估也有相關(guān)研究[7-8]，但在花生醬中的黃曲霉毒素B1的檢測(cè)方法不確定度評(píng)估尚未見，在日常檢測(cè)過程中，發(fā)現(xiàn)花生醬中黃曲霉毒素B1檢出不合格率較高。

為了評(píng)估方法的不確定度，保證檢驗(yàn)結(jié)果評(píng)定的準(zhǔn)確性、可靠性，提供真實(shí)、有效的依據(jù)。根據(jù)GB 5009.22—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定》的試驗(yàn)方法，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定花生醬中黃曲霉毒素B1結(jié)果的測(cè)量不確定進(jìn)行評(píng)定。評(píng)定從兩個(gè)方面進(jìn)行：方法重復(fù)性的不確定度和方法數(shù)學(xué)模型中涉及的各個(gè)分量的不確定度。以期為測(cè)量結(jié)果提供科學(xué)、準(zhǔn)確的理論依據(jù)，同時(shí)為其他農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素B1不確定度的評(píng)定提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

花生醬：山西省食品藥品監(jiān)督管理局監(jiān)督抽檢樣品；

黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 mg/L，中國計(jì)量科學(xué)研究院；

乙腈、甲醇：色譜純，美國Fisher公司；

氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、鹽酸、吐溫-20：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

高效液相色譜儀：Waters2695型，配有FLD檢測(cè)器，美國Waters公司；

電子分析天平：ME204E型，瑞士Mettler公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確移取黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL 于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成100 μg/L黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。吸取1 mL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容制成標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。再分別移取1，2，5，8，10 mL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)中間溶液于10 mL容量瓶中，用水定容制成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品制備 準(zhǔn)確稱取10 g花生醬樣品于250 mL三角瓶中，加甲醇-水(體積比70∶30)100 mL，均質(zhì)提取5 min，提取液取15 mL再加入15 mL水稀釋，待凈化。

取1.2.2中獲得的待凈化液10 mL過免疫親和柱，再用20 mL水進(jìn)行淋洗，最后用1 mL甲醇洗脫，洗脫液經(jīng)0.45 μm 有機(jī)系濾膜過濾上機(jī)。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Agela C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：甲醇∶水=50∶50(體積比)；流速：1 mL/min；激發(fā)波長：365 nm；檢測(cè)波長：436 nm；進(jìn)樣體積：20 μL。

1.3 被測(cè)量的數(shù)學(xué)模型

(1)

式中：

X——試樣中AFB1的含量，μg/kg；

ρ——進(jìn)樣溶液中AFB1按照外標(biāo)法在標(biāo)準(zhǔn)曲線中對(duì)應(yīng)的濃度，ng/mL；

V1——試樣提取液體積(植物油脂、固體、半固體按加入的提取液體積；醬油、醋按定容總體積)，mL；

V3——樣品經(jīng)免疫親和柱凈化洗脫后的最終定容體積，mL；

V2——用于免疫親和柱的分取樣品體積，mL；

1 000——換算系數(shù)；

m——試樣的稱樣量，g。

2 分析和量化不確定度分量

高效液相色譜法測(cè)定花生醬中AFB1需經(jīng)過提取、凈化、等步驟，每個(gè)步驟都可能引入不確定度(圖1)。要對(duì)每個(gè)步驟都確定其不確定度的量是相對(duì)困難的，最常見的方法是選擇檢測(cè)方法評(píng)價(jià)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)各分量進(jìn)行統(tǒng)一評(píng)定。

圖1 花生醬中AFB1測(cè)定不確定度來源因果圖Figure 1 Uncertainty source of determination for AFB1 in peanut butter

不確定有多種不同來源，其中有部分隨機(jī)性誤差可以通過重復(fù)測(cè)量排除，用統(tǒng)計(jì)方式評(píng)定，是為A類評(píng)定；但是也有許多其他不確定度的來源，例如儀器本身的不確定度，不能用重復(fù)測(cè)量和統(tǒng)計(jì)方式評(píng)定，要用B類評(píng)定方法，本方法中除標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度為B類評(píng)定，其余分量的不確定度均采用A類評(píng)定。

2.1 質(zhì)量的不確定度

由檢定證書查得，該電子天平在0≤m≤100 g范圍示值誤差為±0.000 1 g，實(shí)際稱取樣品10.068 5 g，按照均勻分布，稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2 體積的不確定度

本方法體積的不確定度主要來源于校準(zhǔn)和溫度。

2.2.1 校準(zhǔn) 本方法實(shí)際定容體積為1.0 mL，定容體積的準(zhǔn)確與否直接影響著最終的結(jié)果。用移液槍獲得該體積，按照J(rèn)JG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》，A級(jí)1 mL的移液槍最大允許差為0.01 mL，按三角分布處理，由此引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2 溫度 實(shí)驗(yàn)室的溫度在(20±2) ℃變化，水的膨脹系數(shù)是2.1×10-4，按照均勻分布，溫度差異引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3 體積不確定度的合成

(2)

計(jì)算得到：urel(V)=0.000 59%。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液引入的不確定度

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度 本檢測(cè)方法所購買的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來自德國Dr.Ehrenstorfer公司，純度為(99.0±1.0)%，從標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書上查得其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：urel(P)=0.025%。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程引入的不確定度 使用經(jīng)過計(jì)量校準(zhǔn)的分量為0.1 mg的天平上稱取標(biāo)準(zhǔn)品，使用A級(jí)100 mL 的容量瓶進(jìn)行配制，在稀釋過程中，100 mL的容量瓶、1 mL量程的移液槍分別使用2次。

根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》，查得所使用的A級(jí)100 mL容量瓶和1 mL量程移液槍的最大允許差分別為±0.10 mL和±0.008 mL，因此由容量瓶和移液槍引入的不確定度分別為：

稀釋操作時(shí)，在相同的溫度下使用移液槍和容量瓶，因此可忽略溫度對(duì)不確定度的影響。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度 配制質(zhì)量濃度為1，2，5，8，10 ng/mL的5個(gè)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過高效液相色譜儀計(jì)算得出該標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.103 8x+0.012 5，計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的不確定度僅與儀器的響應(yīng)值高度有關(guān)。黃曲霉毒素校準(zhǔn)溶液測(cè)定結(jié)果見表1。

黃曲霉毒素B1校準(zhǔn)曲線引入的不確定度：

表1 黃曲霉毒素校準(zhǔn)溶液測(cè)定結(jié)果?Table 1 Result of determination for AFB1 calibration solution

?p=5，N=6，c均=5 ng/mL，c0=0，b=0.103 8。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度不確定度的合成

urel(cs)=

(3)

經(jīng)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度合成不確定度urel(cs)=0.033%。

2.4 進(jìn)樣體積引入的不確定度

數(shù)學(xué)模型中雖然并沒有涉及進(jìn)樣量，但在計(jì)算結(jié)果中使用了進(jìn)樣量。進(jìn)樣量的變動(dòng)可以包含在重復(fù)性考慮中。在實(shí)際的檢測(cè)過程中采用同一進(jìn)樣器采樣定量環(huán)等體積進(jìn)樣，進(jìn)入儀器的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品時(shí)溫度是固定的，因此溫度帶入的不確定度影響可以忽略，進(jìn)樣體積引入的不確定度也可以忽略。

2.5 樣品前處理過程引入的不確定度

對(duì)本方法進(jìn)行正確度試驗(yàn)，選擇1個(gè)空白樣品進(jìn)行6次加標(biāo)回收試驗(yàn)，回收率測(cè)定結(jié)果分別為88.1%，89.2%，87.8%，94.3%，92.7%，89.9%，得到平均回收率frec為90.3%，則由樣品前處理過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(4)

(5)

計(jì)算得出Sfrec=0.038 6，urel(frec)=1.05%。

2.6 測(cè)量重復(fù)性的不確定度

在上述試驗(yàn)條件下，對(duì)某陽性樣品進(jìn)行了6次重復(fù)測(cè)定，測(cè)得黃曲霉毒素含量分別是24.35，25.46，25.63，25.78，24.37，25.12 μg/kg，平均值為25.12 μg/kg，則由樣品重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確度為：

(6)

(7)

2.7 合成不確定度

方法重復(fù)性引入的不確定度、數(shù)學(xué)模型中各分量引入的合成不確定度：

Urel(X)=

(8)

通過計(jì)算得出：Urel(X)=1.051%。

2.8 擴(kuò)展不確定度

按照包含因子k=2(置信水平 95%)，計(jì)算得出花生醬中黃曲霉毒素B1液相色譜檢測(cè)法的相對(duì)擴(kuò)展不確定度：Urel=k×Urel(X)=2×1.051%=2.102%。

擴(kuò)展不確定度：U=25.12×2.102%=0.528 μg/kg。

3 測(cè)量結(jié)果及其不確定度的報(bào)告

用高效液相色譜法測(cè)定花生醬中黃曲霉毒素B1含量，測(cè)定結(jié)果可表示為：X=(25.12±0.528) μg/kg，k=2。

4 結(jié)論

方法的重復(fù)性或再現(xiàn)性只能評(píng)價(jià)n次試驗(yàn)結(jié)果，不確定

度包含著與測(cè)試相關(guān)的各個(gè)因素(方法、設(shè)備、環(huán)境等等)的廣泛信息，說明檢測(cè)質(zhì)量和檢測(cè)過程，再現(xiàn)性屬于不確定度評(píng)估的一部分。本文對(duì)花生醬中黃曲霉B1的檢測(cè)過程進(jìn)行了不確定度分析，發(fā)現(xiàn)影響檢測(cè)結(jié)果的不確定因素(天平稱量、前處理的過程、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過程及濃度、樣品溶液定容體積、重復(fù)性)。對(duì)于這些不確定度的影響，可以通過調(diào)整儀器的性能、增加標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度點(diǎn)、優(yōu)化前處理凈化過程等方法，降低以上不確定度分量在實(shí)際檢測(cè)樣品中的不確定度占比，提高測(cè)量結(jié)果的可信度。

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