劉 飛U Fei 鄭曉吉, -, 李寶坤 - 史學(xué)偉 - 董 娟 李開雄 - 諸葛斌-

(1. 石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832003；2. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

脂肪酶是一類非常重要的水解酶，在食品工業(yè)上應(yīng)用非常廣泛，能將甘油三酯水解成甘油二酯、甘油一酯、脂肪酸和丙三醇，通過催化非水介質(zhì)中的酯化反應(yīng)、相互酯化反應(yīng)和轉(zhuǎn)酯作用，增加食品的風(fēng)味與香味[1]。目前工業(yè)脂肪酶主要從微生物中獲取[2]，這種方法的原料資源豐富，生產(chǎn)不受自然環(huán)境影響，可大量生產(chǎn)且周期短，生產(chǎn)成本低，經(jīng)濟又實用[3]。在自然界中約有65個屬的微生物產(chǎn)脂肪酶，其中有28個屬來源于細(xì)菌，4個屬來源于放線菌，10個屬來源酵母菌，其它23個屬來源于真菌[4]?，F(xiàn)已工業(yè)化應(yīng)用的脂肪酶產(chǎn)生菌主要有芽孢桿菌(Bacillus)、大腸桿菌工程菌[5]、無色桿菌(AchromoBacter)、假單細(xì)胞菌(Pseudomonas)和伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)[6]。微生物脂肪酶發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)初，中國在此方面的研究起步較晚，最早投入生產(chǎn)的產(chǎn)脂肪酶菌株是1967年由中科院微生物所篩選到的解假絲酵母AS2.1203，最早的科研報道為施巧琴[7]、黃建中[8]、吳松剛[9]等對堿性脂肪酶的篩選及應(yīng)用研究?，F(xiàn)今對產(chǎn)脂肪酶微生物的研究越來越多，吳厚軍等[10]對華根酶(Rhizopus5chinensis)定向改造使其在巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)中表達突變酶D190V，使該酶的熱穩(wěn)定性得以提高；Fang等[11]研究了細(xì)毛嗜熱霉脂肪酶(TLL)基因在P.pastorisGS115菌株中的表達。目前，對新疆哈薩克族奶酪樣品中產(chǎn)脂肪酶酵母菌篩選并應(yīng)用于奶制品風(fēng)味改善方面研究較少。

新疆哈薩克族奶酪營養(yǎng)豐富，均為靠經(jīng)驗手工制作，奶酪中奶臭味等特殊風(fēng)味不能被廣泛的消費者所接受，奶酪制品風(fēng)味物質(zhì)形成機制不明晰、風(fēng)味品質(zhì)不穩(wěn)定等已成為產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的瓶頸。脂肪酶在奶酪中能降解脂肪為游離脂肪酸，并將其分解成乙酯、丙酮等呈味物質(zhì)[12]，能提高奶酪熟化過程中的風(fēng)味、增加香氣。因此本研究以新疆不同地域的哈薩克族奶酪為研究對象，分離篩選出產(chǎn)脂肪酶酵母菌，并對其產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，旨在為傳統(tǒng)自然發(fā)酵奶酪實施微生物控制、風(fēng)味強化和品質(zhì)提升提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 樣品的采集

奶酪樣品主要采集于北疆哈薩克族聚居地區(qū)：和布克賽爾(S)、伊寧(Y)、昭蘇(Z)、木壘(L)、吉木乃(N)、巴里坤(B)、阿勒泰(A)、可可托海(K)、那拉提(T)。每地采集5塊奶酪，用保鮮袋封裝后貼上標(biāo)簽放入-4 ℃的車載冰箱內(nèi)保藏，18 h內(nèi)運回實驗室，在4 ℃下冷藏。

1.1.2 主要試劑與設(shè)備

高速離心機：TGRL-16M型，上海上天精密儀器有限公司；

搖床：ZD-3型，天津順吉科技有限公司；

恒溫培養(yǎng)箱：LRH-250F型，上海善志儀器設(shè)備有限公司；

光學(xué)顯微鏡：XSP-10C型，陜西天平儀器設(shè)備有限公司；

電磁攪拌器：85-2A型，金培市城東新璃儀器廠；

pH計：PHS-3E型，上?？茣钥茖W(xué)儀器有限公司；

紫外分光光度計：UV1800型，上海奧析科學(xué)儀器有限公司；

PCR擴增儀：TC-512型，英國Techne公司；

立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋：LD2X-30KA型，上海申安醫(yī)療器械廠；

對硝基苯酚丁酸酯：分析純，無錫中坤生化科技有限公司；

羅丹明B：分析純，湖北廣奧生物科技有限公司；

橄欖油乳化液：化學(xué)純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：酵母浸粉6 g，KH2PO41 g，Na2HPO42 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 1 g，橄欖油10 mL/L，pH 6.0，水1 000 mL；

發(fā)酵(YPD)培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，KH2PO46 g，K2HPO42 g，MgSO4·7H2O 1 g、橄欖油乳化液120 mL/L，水1 000 mL；

LB斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化鈉10 g，瓊脂粉20 g，水1 000 mL；

分離培養(yǎng)基：按文獻[13]制備；

羅丹明B培養(yǎng)基：按文獻[14]制備。

1.2 方法

1.2.1 菌種的富集 將塊狀的奶酪樣品用研缽搗、碾粉碎，使碎小顆粒直徑<0.5 mm。稱取5 g樣品，溶入盛有50 mL無菌水的錐形瓶內(nèi)，搖勻后置于35 ℃、180 r/min的搖床上振蕩6 h，待瓶內(nèi)的溶液靜置分層，取5 mL上清液加入到盛有50 mL液體富集培養(yǎng)基的錐形瓶中，再置于35 ℃、175 r/min 的搖床內(nèi)振蕩培養(yǎng)24 h，進行富集培養(yǎng)。

1.2.2 初篩 配制分離培養(yǎng)基，在121 ℃下滅菌20 min，用移液槍移取1 mL富集后的菌液加到裝有9 mL無菌水的試管中，稀釋為10-1。再取6支裝有9 mL無菌水的試管，分別稀釋至10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，移取200 μL不同濃度的菌液加入到分離培養(yǎng)基平板中。涂布均勻后放入35 ℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h。將生長狀況良好的菌株純化后，采用牛津杯法接種到羅丹明B培養(yǎng)基中，35 ℃下培養(yǎng)48 h，在紫外燈照射下觀察水解圈，將水解圈直徑較大且有橙色熒光圈的菌落挑出來，-20 ℃下冷藏保存于LB斜面培養(yǎng)基中，待復(fù)篩測酶活時使用。

1.2.3 復(fù)篩 將初篩中水解圈直徑較大單菌落轉(zhuǎn)接到20 mL 液體富集培養(yǎng)基中，在30 ℃、160 r/min搖床中培養(yǎng)1 d，用移液槍吸取活化后的菌液(106CFU/mL)2 mL轉(zhuǎn)接到20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃的搖床中培養(yǎng)48 h，取5 mL 培養(yǎng)液于離心管中，于5 000 r/min離心10 min，取上層清液用于對硝基苯酚法測定酶活，按酶活力大小篩選出產(chǎn)脂肪酶能力較強的菌株。

1.2.4 菌種鑒定

(1) PCR擴增及測序：參考文獻[15]的方法提取菌株總DNA。PCR擴增26S rDNA D1/D2區(qū)基因：采用酵母菌通用引物NL1(5′-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3′)和NL4(5′-TCC TCC GTC TAT TGA TAT GC-3′)[16]對26S rDNA D1/D2區(qū)基因片段進行PCR擴增。

擴增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，1 min循環(huán)36次，72 ℃延伸10 min。將擴增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.2%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴增效果和片段大小，電壓為100 V，使用Marker 1進行標(biāo)注。PCR產(chǎn)物用EZ-10 column純化后送往上海生工生物科技有限公司進行測序。

(2) 菌懸液的制備：將篩選出的產(chǎn)脂肪酶菌株接種到裝有50 mL液體分離培養(yǎng)基的錐形瓶中，在搖床上培養(yǎng)12 h，以4 000 r/min離心30 s。將上層清液棄去，用無菌生理鹽水洗滌沉淀菌體2～3次，震蕩30 min。用平板活菌計數(shù)法將菌懸液濃度調(diào)整為106CFU/mL。

(3) 酶活力測定：酶活力的大小或酶的反應(yīng)速度，通常用酶在反應(yīng)過程中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示。由于不同鏈長的對硝基苯酚酯類水解時，吸光值在410 nm處會發(fā)生變化，所以使用分光光度計測定酶反應(yīng)過程中反應(yīng)物或產(chǎn)物吸光值的變化，進而對脂肪酶活力的大小進行定量。根據(jù)文獻[12]的方法進行脂肪酶活力的測定，以吸光度值為橫坐標(biāo)(X)、p-NP總量為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算出相關(guān)線性方程：Y=0.410 9X+0.001 2(R2=0.999 7)。酶活按式(1)計算：

(1)

式中：

M—— 酶活，U/mL；

n—— 酶液的稀釋倍數(shù)；

a、b—— p-NP 標(biāo)準(zhǔn)曲線公式中的系數(shù)；

A——反應(yīng)后OD410 nm下吸光度值；

A0——初始OD410 nm下吸光度值。

1.2.5 溫度對菌株產(chǎn)酶的影響 在pH 7.0、接種量2%條件下，分別設(shè)置不同溫度26，28，30，32，34，36 ℃，吸取1 mL離心后的菌懸液接種到裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的150 mL錐形瓶中，在175 r/min搖床上培養(yǎng)12 h后，測定菌株產(chǎn)脂肪酶活力。

1.2.6 pH對菌株產(chǎn)酶的影響 在30 ℃、接種量2%條件下，分別調(diào)節(jié)pH值為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5。吸取1 mL 菌懸液(106CFU/mL)接種到裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的150 mL 錐形瓶中，在175 r/min的搖床上培養(yǎng)12 h后，測定不同pH值下菌株產(chǎn)脂肪酶活力。

1.2.7 接種量對菌株產(chǎn)酶的影響 接種量的大小直接影響菌株的發(fā)酵速率。在30 ℃、pH 7.0條件下，分別吸取1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，3.5%，4.0%菌懸液接種到裝有50 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的150 mL錐形瓶中，在175 r/min的搖床上培養(yǎng)12 h后，測定不同接種量下菌株產(chǎn)脂肪酶活力。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)酶酵母菌菌株鑒定

2.1.1 產(chǎn)酶酵母菌菌株的篩選 在酵母菌進行富集培養(yǎng)、初篩、純化復(fù)篩后，得到4株產(chǎn)脂肪酶能力較強的酵母菌見表1，編號分別為Y-2、Z-5、S-6、N-5，產(chǎn)脂肪酶能力見圖1，菌株Z-5的水解光圈最大，其酶活力也最大。并對這4株酶活最高的菌株進行了生理生化分析、分子鑒定及后續(xù)的產(chǎn)酶條件優(yōu)化。

圖1 產(chǎn)酶酵母菌菌株的篩選結(jié)果Figure 1 Enzymatic abilities results of the yeast isolates

表1 菌株篩選結(jié)果Table 1 Strain screening results

2.1.2 26S rDNA測序及產(chǎn)酶特性 對這4株酵母菌株的26S rDNA基因序列進行測定后在Blast中對比，結(jié)果見表2，使用MEGA 5軟件中的Neighour-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[17-18]，見圖2。發(fā)現(xiàn)Y-2、Z-5這2株菌種都屬于Kl.marxianus，N-5屬于Kl.lactis，S-6則屬于P.kudriavzevii。

2.1.3 酶活測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制見圖3。通過測定酵母菌在培養(yǎng)基內(nèi)發(fā)酵液中的胞外酶，來確定酶活力的大小。分別將4株酵母菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在pH 7.0、接種量2.0%、裝液量50 mL/150 mL、培養(yǎng)溫度30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速175 r/min、培養(yǎng)時間12 h，將410 nm處的吸光值代入式(1)，得出各菌株的產(chǎn)脂肪酶的活力：Y-2酶活16.60 U/mL，S-6酶活19.28 U/mL，N-5酶活20.32 U/mL，Z-5酶活23.00 U/mL。

2.2 溫度對菌株產(chǎn)酶的影響

在不同溫度下Z-5菌株產(chǎn)脂肪酶活力的變化見圖4。當(dāng)溫度為27～30 ℃時，菌株的生長代謝反應(yīng)速率持續(xù)加快，不斷消耗培養(yǎng)基內(nèi)的養(yǎng)分進行產(chǎn)酶，菌株的產(chǎn)脂肪酶能力隨著溫度升高逐漸增大。在溫度達到30 ℃時，菌株的產(chǎn)酶能力達到最大，累積產(chǎn)酶量最多，此時的脂肪酶也達到最適存活溫度，所以酶活力達到最高峰值，為23.65 U/mL；當(dāng)溫度大于30 ℃時，由于溫度過高會使酶變性失活，且培養(yǎng)基內(nèi)養(yǎng)分被消耗過多，菌株產(chǎn)酶能力逐漸下降，導(dǎo)致總體酶活力開始下降。酶活力隨著溫度的升高而不斷降低，當(dāng)溫度達到36 ℃ 時酶活力下降到最低。由此可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃，Z-5菌株的產(chǎn)酶能力最佳，且產(chǎn)出的酶能夠保持最高的活力。

圖2 基于26S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 Phylogenetic tree based on 26S rDNA sequence

表2 26S rDNA測序結(jié)果Table 2 26S sequencing of rDNA

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 3 Standard curve line

圖4 溫度對產(chǎn)酶的影響Figure 4 Effect of temperature on enzyme production

2.3 pH對菌株產(chǎn)酶的影響

pH的改變能影響酶活性中心上必須基團的解離程度，同時也可以影響底物和輔酶的解離程度，從而影響酶分子對底物分子的結(jié)合和催化。pH過高或過低都會是酶變性失活，只有在最適的pH下，酶、底物和輔酶的解離狀態(tài)，才最適宜它們相互結(jié)合，并發(fā)生催化作用，從而使酶的反應(yīng)速度達到最大值。不同pH值下Z-5菌株產(chǎn)脂肪酶活力的變化情況見圖5，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為5.5～7.5時，菌株的酶活力與pH呈正相關(guān)，產(chǎn)脂肪酶的活力隨pH的上升而增加。在pH為7.5時，產(chǎn)酶能力最強，酶活力最高(23.76 U/mL)；pH為7.5～8.0時呈緩慢下降趨勢，超過8.0之后迅速下降。因此，Z-5菌株的產(chǎn)酶最佳pH值為7.5。

2.4 接種量對菌株產(chǎn)酶的影響

接種量對Z-5菌株產(chǎn)脂肪酶活力的影響見圖6。接種量主要影響酶的催化速率，在1.0%～2.5%時，隨著接種量的梯度式增加，菌株數(shù)量不斷增多，能夠充分利用培養(yǎng)基內(nèi)充足的養(yǎng)分，使菌株的生長代謝加快，是產(chǎn)酶效率的加速上升期，此時酶活力值迅速增加。當(dāng)接種量為2.5%時，培養(yǎng)基內(nèi)的養(yǎng)分與菌株數(shù)量達到均衡飽和狀態(tài)，產(chǎn)酶效率最快，產(chǎn)酶量最多，酶活最大，為25.99 U/mL；當(dāng)接種量超過2.5%時，再增加接種量時菌株的產(chǎn)酶活力并無增加，反而呈平緩下降的趨勢，是因為此時培養(yǎng)基內(nèi)的養(yǎng)分供給不足，影響產(chǎn)酶速率。因此，得出Z-5菌株產(chǎn)脂肪酶的最佳接種量為2.5%。

圖5 pH對產(chǎn)酶的影響Figure 5 Effect of pH on enzyme production

圖6 接種量對產(chǎn)酶的影響Figure 6 Effect of inoculation amount on enzyme production

3 結(jié)論

從新疆地區(qū)采集的哈薩克族特色奶酪中得到100多株菌種，經(jīng)篩選后得到4株產(chǎn)脂肪酶酵母菌(Y-2、S-6、Z-5、N-5)。對這4株酵母菌進行26S rDNA測序，發(fā)現(xiàn)Y-2、Z-5、N-5都屬于K.marxianus，其中N-5為K.lactis，S-6則屬于P.kudriavzevii。對4株菌進行產(chǎn)脂肪酶酶活測定，發(fā)現(xiàn)Z-5菌株酶活力最強，為23.00 U/mL，以Z-5菌株為樣本，對其產(chǎn)酶條件進行單因素優(yōu)化試驗，當(dāng)溫度達到30 ℃、pH 值7.5、接種量2.5% 時，為最優(yōu)產(chǎn)酶條件，其酶活性最高為25.99 U/mL，與胡珺[19]、黎小軍[20]等優(yōu)化的產(chǎn)脂肪酶菌種結(jié)果相近，優(yōu)化較成功。K.marxianusZ-5可以初步作為風(fēng)味酵母菌，進一步研究其酶學(xué)性質(zhì)以及模擬奶酪發(fā)酵，探究其對奶酪風(fēng)味的改善，可為改善新疆哈薩克族奶酪風(fēng)味提供理論依據(jù)。

[1] 曹茜, 馮鳳琴. 微生物脂肪酶的研究進展及其在食品中的應(yīng)用[J]. 中國食品學(xué)報, 2013, 13(10): 137-141.

[2] ZHANG Tong, WU Zhen-fang, CHEN Hui, et al. Progress in strategies for sequence diversity library creation for directed evolution[J]. African Journal of Biotechnology, 2011, 9(54): 9 277-9 285.

[3] 張晶晶, 劉金峰, 牟伯中, 等. 產(chǎn)脂肪酶菌株篩選及檸檬酸桿菌產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J]. 微生物學(xué)雜志, 2015, 35(2): 85-89.

[4] 趙春雷, 閆麗娟, 謝振榮, 等. 一株耐熱脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 生物技術(shù)通報, 2010(2): 184-188.

[5] MO Qiu-run, LIU Ai-li, GUO Hai-lun, et al. A novel thermostable and organic solvent-tolerant lipase from Xanthomonas oryzae pv. oryzae YB103: screening, purification and characterization[J]. Extremophiles, 2016, 20(2): 157-165.

[6] GUPTA N, SAHAI V, GUPTA R. Alkaline lipase from a novel strain Burkholderia multivorans: Statistical medium optimization and production in a bioreactor[J]. Process Biochemistry, 2007, 42(4): 518-526．

[7] 施巧琴, 陳若瑩, 許晴怡, 等. 醋酸鈣不動桿菌產(chǎn)生的耐熱堿性脂肪酶的研究[J]. 微生物學(xué)報, 1992, 32(6): 425-431.

[8] 黃建忠, 施巧琴, 鄭毅, 等. 中溫堿性脂肪酶的研究Ⅰ：高產(chǎn)菌擴展青霉PE868的選育[J]. 工業(yè)微生物, 1995, 25(3): 1-5.

[9] 吳松剛, 謝新東, 黃建忠, 等. 類產(chǎn)堿假單胞菌耐熱堿性脂肪酶的研究[J]. 微生物學(xué)報, 1997, 37(1): 32-39.

[10] 吳厚軍, 喻曉蔚, 沙沖, 等. D190V點突變提高華根霉Rhizopus chinensis CCTCCM201021脂肪酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性[J]. 微生物學(xué)通報, 2013, 40(11): 1 955-1 961.

[11] FANG Zhong-gang, XU Li, PAN Du-jie, et al. Enhanced production of Thermomyces lanuginosus lipase in Pichia pastoris via genetic and fermentation strate-gies[J]. Journal of Industrial MicroBiology & Biotechnology, 2014, 41(10): 1 541-1 551.

[12] 孫宏丹, 孟秀香, 賈莉, 等. 微生物脂肪酶及其相關(guān)研究進展[J]. 大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2001, 23(4): 292-295.

[13] 董娟. 冰川低溫酯酶產(chǎn)生菌的選育、基因克隆表達及在奶味香基制備中的應(yīng)用[D]. 無錫: 江南大學(xué), 2016: 10-15.

[14] KIM E K, JANG W H, KO J H, et al. Lipase and its modulator fromPseudomonassp. strain KFCC10818：proline-to-glutamine substitution at position 112 induces formation of enzymatically active lipase in the absence ofthe modulator[J]. Journal of Bacteriology, 2001, 183(20): 5 937-5 941.

[15] OGINO H, HIROSHIMA S, HIROSE S, et al. Cloning, expression and char-acterization of a lipase gene(lip3)fromPseudomonasaeruginosaLST-03[J]. Mol Gen Genomics, 2004, 271: 189-196.

[16] LARBIDAOUADI K, BENATTOUCHE Z, ABBOUNI B. Sc-reening selection identification production and optimization of bacterial lipase isolated from industrial rejection of gas station[J]. Research Journal of Biotechnology, 2015, 10(4): 21-25.

[17] 蘇二正, 吳向萍, 高蓓, 等. 短小芽孢桿菌脂肪酶基因的克隆、表達及酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 生物技術(shù)報, 2014(4): 132-138.

[18] ZENG Cheng, ZHAO Rong-bin, WEN Xue-fang, et al. Screening and identification of a Bacillus amyloliquefaciens strain for aqueous enzymatic extraction of medium-chain triglycerides[J]. Food Control, 2017, 78: 24-32.

[19] 胡珺, 杜新凱, 王常高. 產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J]. 中國釀造, 2016, 35(11): 39-43.

[20] 黎小軍, 謝蓮萍, 劉建宏. 產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選、鑒定與產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J]. 江西師范大學(xué)學(xué)報, 2014, 38(1): 14-17.