謝 虹XIE Hong 羅志聰 - 李熙燦 -

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

紅茶是一種全發(fā)酵型茶類，因其香氣甜純、滋味濃厚而廣泛受到世界消費(fèi)者的喜愛(ài)。茶黃素(圖1)是紅茶在發(fā)酵過(guò)程中，由簡(jiǎn)單兒茶素類聚合而成的黃烷醇類化合物[1]，是衡量紅茶品質(zhì)的重要因素。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，茶黃素有顯著的抗腫瘤[2]、抗炎[3]、抗氧化作用[4-5]，是紅茶發(fā)揮保健作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。陳虎等[6]認(rèn)為茶黃素能調(diào)節(jié)體內(nèi)生物酶系的活性、防止低密度脂蛋白的氧化，修復(fù)生物系統(tǒng)的氧化損傷。最新的研究[7-8]還表明，茶黃素能通過(guò)hedgehog或Shh等信號(hào)通路限制肝的瘤變。但這些研究側(cè)重闡明其抗氧化的生物機(jī)制，沒(méi)有涉及化學(xué)機(jī)制。

本研究采用化學(xué)模式，研究茶黃素清除各種自由基的清除活性。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步討論其機(jī)制，以闡釋茶黃素體內(nèi)抗氧化的化學(xué)本質(zhì)。

圖1 茶黃素的結(jié)構(gòu)式Figure 1 Structure of theaflavin

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

茶黃素(CAS：4670-5-7)：HPLC≥98%，四川省維克奇生物科技有限公司；

新銅試劑、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基、Trolox：HPLC≥98%，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；

(NH4)2ABTS [2,2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽]：美國(guó)Amresco公司；

K2S2O8、CuSO4、CH3COONH4、95%乙醇：AR級(jí)，廣州化學(xué)試劑廠。

1.1.2 儀器設(shè)備

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV2100型，上海尤尼柯儀器有限公司；

電子天平：BS110S型，北京賽多利斯天平有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DPPH·清除能力的測(cè)定 依據(jù)文獻(xiàn)[9]并做適量修改。稱取1 mg DPPH，加入95%乙醇20 mL，超聲使之完全溶解。取溶解后的DPPH·溶液1 mL與95%乙醇500 μL混合，利用紫外分光光度計(jì)在519 nm下測(cè)吸光度(A0)值。取該DPPH·溶液1 mL分別與20，40，60，80，100 μL的茶黃素溶液(0.1 mg/mL)混合，再向其中分別加入480，460，440，420，400 μL的95%乙醇使之總體積為1.5 mL，靜置30 min 后，在519 nm下測(cè)吸光度值。平行測(cè)定3次。以Trolox(0.1 mg/mL)為陽(yáng)性對(duì)照。樣品清除DPPH·的能力按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

R——自由基清除率，%；

A0——未加樣品液時(shí)所測(cè)吸光度值；

A——加入樣品液時(shí)所測(cè)吸光度值。

1.2.2 ABTS+·清除能力的測(cè)定 依據(jù)文獻(xiàn)[10]并做適量修改。取7.4 mmol/L (NH4)2ABTS溶液和2.6 mmol/L K2S2O8溶液各1 mL混合，在室溫避光下放置12 h，使之反應(yīng)完全。用95%乙醇稀釋此ABTS+·工作液，利用紫外分光光度計(jì)在734 nm下測(cè)A0值，調(diào)整A0至(0.7±0.02)。取該ABTS+·工作液800 μL，加茶黃素(0.025 mg/mL)xμL(x=15，30，45，60，75)，再加95%乙醇(200-x) μL，振搖10 s 以充分混合，然后在734 nm下測(cè)定吸光度值，平行檢測(cè)3次。以Trolox (0.025 mg/mL)標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性對(duì)照。樣品清除ABTS+·的能力按式(1)計(jì)算。

1.2.3 Cu2+還原能力的測(cè)定 依據(jù)文獻(xiàn)[11]并做適量修改。取0.01 mol/L CuSO4溶液和7.5 mmol/L新銅試劑各125 μL混勻，依次加入茶黃素(0.1 mg/mL)xμL(x=15，30，45，60，75，90)、CH3COONH4緩沖液(700-x) μL，混合，靜置30 min，于450 nm處測(cè)吸光度值，平行檢測(cè)3次。以Trolox (0.1 mg/mL)標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性對(duì)照。樣品Cu2+還原能力按式(2)計(jì)算：

(2)

式中：

S——Cu2+的相對(duì)還原率，%；

A0——未加樣品液時(shí)所測(cè)吸光度值；

Amax——一次測(cè)量?jī)?nèi)最大的吸光度值；

A——加入樣品液時(shí)所測(cè)吸光度值。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 每個(gè)樣品重復(fù)3次試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。P<0.05 表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 DPPH自由基清除活性及機(jī)制

DPPH自由基是一種以N為中心的穩(wěn)定自由基，由于其分子中存在多個(gè)吸電子的—NO2和苯環(huán)的大π鍵，所以氮自由基能穩(wěn)定存在[12]。DPPH自由基的乙醇溶液為深紫色，其在517 nm處有強(qiáng)吸收。若與樣品混合，反應(yīng)液的顏色變淡，同時(shí)在517 nm下吸光度值減少，據(jù)此可以判斷樣品清除DPPH自由基的能力[13]。從圖2中可以看出，在0～6 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)，茶黃素清除DPPH·的能力逐漸增加，并且表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。其IC50=(7.7±0.1) μmol/L，小于Trolox的(見(jiàn)表1)，說(shuō)明茶黃素清除DPPH·的能力強(qiáng)于Trolox。此前的文獻(xiàn)[14]認(rèn)為，氫原子轉(zhuǎn)移(hydrogen atom transfer，HAT)是DPPH·清除涉及到的一種重要機(jī)制，活潑的DPPH·接受了一個(gè)氫原子后形成了穩(wěn)定的DPPH—H分子。因此，DPPH·清除模型可以用來(lái)衡量抗氧化劑的HAT能力[15]。

依據(jù)文獻(xiàn)[16]，茶黃素分子與DPPH·發(fā)生的反應(yīng)，可表示為圖3。在反應(yīng)中，茶黃素上的鄰二酚羥基(O—H鍵)發(fā)生均裂，失去H·后形成茶黃素自由基(I)，H·與DPPH· 結(jié)合生成穩(wěn)定的DPPH—H分子。茶黃素自由基(I)，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的鄰苯醌式產(chǎn)物(II)。不難看出，正是鄰苯醌式產(chǎn)物的穩(wěn)定性，導(dǎo)致了茶黃素分子的強(qiáng)抗氧化活性。因此，茶黃素發(fā)揮其體外抗氧化作用可能與其具有的HAT能力有關(guān)。值得一提的是，茶黃素的鄰苯醌式產(chǎn)物多存在于環(huán)狀化合物，鏈狀化合物由于不具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)，無(wú)法轉(zhuǎn)變?yōu)轷浇Y(jié)構(gòu)，所以大多不表現(xiàn)出抗氧化活性(如十六酸)[17]。

表1 茶黃素和Trolox在各種抗氧化分析法中的IC50值?Table 1 The IC50 values of theaflavin and Trolox in several antioxidant assays

?IC50值是指當(dāng)自由基的清除率為50%時(shí)樣品的濃度；同行不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖2 茶黃素和Trolox的DPPH自由基清除率曲線Figure 2 The dose response curves of theaflavin and Trolox in DPPH·-scavenging assay

圖3 茶黃素與DPPH·可能發(fā)生的反應(yīng)式Figure 3 The proposed reaction of theaflavin with DPPH·

2.2 ABTS自由基清除活性及機(jī)制

ABTS法是一種經(jīng)典的檢測(cè)物質(zhì)抗氧化能力的方法[18]，適用于天然的或合成的抗氧化劑[19]。(NH4)2ABTS與K2S2O8反應(yīng)可以生成穩(wěn)定的ABTS+·自由基，此自由基呈深綠色，在734 nm處有最大吸收。如果ABTS+·被樣品清除，其734 nm的吸光度值會(huì)降低，顏色變淺。據(jù)此，可以來(lái)判斷樣品清除ABTS+·的能力[20]。從圖4中可以看出，在0～2 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，茶黃素清除ABTS+·的能力與其濃度形成良好的量效關(guān)系。其IC50值為(2.3±0.1) μmol/L，小于Trolox的(見(jiàn)表1)，說(shuō)明茶黃素清除ABTS+·的能力強(qiáng)于Trolox。通常認(rèn)為ABTS+·被清除的機(jī)制是電子轉(zhuǎn)移(ET)的過(guò)程(ABTS+· +e→ ABTS)[21]。據(jù)此推測(cè)，茶黃素有較強(qiáng)的ABTS+·清除能力，其清除過(guò)程至少包括ET機(jī)制。

2.3 Cu2+還原能力及機(jī)制

抗氧化劑對(duì)金屬離子的還原能力，也可用于衡量其活性強(qiáng)弱[22]。從圖5中可以看出，在0～90 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，茶黃素對(duì)銅離子的相對(duì)還原率與濃度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。其IC50=(9.2±0.2) μmol/L，小于Trolox的(見(jiàn)表1)，表明茶黃素還原Cu2+的能力強(qiáng)于Trolox。文獻(xiàn)[20]表明，Cu2+被還原成Cu+是電子轉(zhuǎn)移的過(guò)程。這進(jìn)一步印證了茶黃素具有ET能力的推測(cè)。

圖4 茶黃素和Trolox的ABTS+·清除率曲線

Figure 4 The dose response curves of theaflavin and Trolox in ABTS+·-scavenging assay

圖5 茶黃素和Trolox 的相對(duì)Cu2+還原能力濃度曲線

Figure 5 The dose response curves of theaflavin and Trolox in Cu2+-reducing assay

3 結(jié)論

作為一種存在于紅茶中的天然抗氧化劑，茶黃素在DPPH自由基清除、ABTS清除、Cu2+還原力3個(gè)方面，其活性均明顯強(qiáng)于Trolox。它的抗氧化作用可能涉及氫原子轉(zhuǎn)移(HAT)和電子轉(zhuǎn)移(ET)。并且通過(guò)HAT機(jī)制，茶黃素可轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的鄰苯醌式產(chǎn)物。此研究闡明了茶黃素抗氧化的化學(xué)機(jī)制，有助于理解抗氧化活性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系，為茶黃素類衍生物的開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。但該試驗(yàn)對(duì)于茶黃素所涉及的化學(xué)機(jī)制研究尚不全面，仍有待進(jìn)一步分析完善。

[1] KUSANO R, MATSUO Y, SAITO Y, et al. Oxidation mechanism of black tea pigment theaflavin by peroxidase[J]. Tetrahedron Letters, 2015, 56: 5 099-5 102.

[2] GAO Ying, RANKIN G O, TU You-ying, et al. Inhibitory effects of the four main theaflavin derivatives found in black tea on ovarian cancer cells[J]. Anticancer Research, 2016, 36(2): 643-651.

[3] CAI Fei, LI Cai-rong, WU Ji-liang, et al. Theaflavin ameliorates cerebral ischemia-reperfusion injury in rats through its anti-inflammatory effect and modulation of STAT-1[J]. Mediators of Inflammation, 2006, 5: 30 490.

[4] MANGERICH A, KNUTSON C G, PARRY N M, et al. Infection-induced colitis in mice causes dynamic and tissue-specific changes in stress response and DNA damage leading to colon cancer[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United states of America, 2012, 109(27): E1 820-E1 829.

[5] 沈麗萍. 茶黃素研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2010, 26(1): 134-139.

[6] 陳虎, 胡英, 周睿, 等. 茶黃素的抗氧化機(jī)理的研究進(jìn)展[J]. 茶葉科學(xué), 2005, 25(4): 237-241.

[7] SUR S, PAL D, MANDAL S, et al. Tea polyphenols epigallocatechin gallete and theaflavin restrict mouse liver carcinogenesis through modulation of self-renewal Wnt and hedgehog pathways[J]. Journal of Nutritional Biochemistry, 2016, 27: 32-42.

[8] LI Xi-can, WEI Gang, WANG Xiao-zhen, et al. Targeting of the shh pathway by atractylenolides promotes chondrogenic differentiation of mesenchymal stem Cells[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 2012, 35: 1 328-1 335.

[9] WANG Ting-ting, ZENG Gong-chang, LI Xi-can, et al. In vitro studies on the antioxidant and protective effect of 2-substituted-8-hydroxyquinoline derivatives against H2O2-Induced oxidative stress in BMSCs[J]. Chemical Biological Drug Design, 2010, 75(2): 214-222.

[10] LI Xi-can, CHEN Dong-feng, MAI Ying, et al. Concordance between antioxidant activities in vitro and chemical components of Radix Astragali (Huangqi)[J]. Natural Product Research, 2012, 26: 1 050-1 053.

[11] LI Xi-can, LIU Jing-jing, LIN Jian, et al. Protective effects of dihydromyricetin against ·OH-induced mesenchymal stem cells damage and mechanistic chemistry[J]. Molecules, 2016, 21: 604.

[12] LI Xi-can, JIANG Qian, WANG Ting-ting, et al. Comparison of the antioxidant effects of quercitrin and isoquercitrin: Understand-ing the role of the 6″-OH group[J]. Molecules, 2016, 21: 1 246.

[13] LI Xi-can, HAN Lu, LI Yung-rong, et al. Protective effect of sinapine against hydroxyl radical-induced damage to mesenchymal stem cells and possible mechanisms[J]. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 2016, 64: 319-325.

[14] LI Xi-can, HAN Wei-juan, MAI Wen-qiong, et al. Antioxidant Activity and Mechanism of Tetrahydroamentoflavone in vitro[J]. Natural Product Communications, 2013, 8: 787-789.

[15] WANG Guang-rong, LI Xi-can, ZENG He-ping. Synthesis, antioxidation activity of (E)-9-p-Tolyl-3-[2-(8-hydroxy-quinol-2-yl)vinyl]-carbazole and (E)-9-(p-Anisyl)-3-[2-(8-hydroxy-quinol-2-yl)vinyl]-carbazole and their induction proliferation of mesenchymal stem cells[J]. Acta Chimica Sinica, 2009, 67(9): 974-982.

[16] CHEN Dong-feng, LI Xi-can, XU Zhi-wei, et al. Hexadecanoic acid from buzhong yiqi decoction induces proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Journal of Medicinal Food, 2010, 13: 967-970.

[17] LI Xi-can, HU Qiu-ping, JIANG Shu-xia, et al.FlosChrysanthemiIndiciprotects against hydroxyl-induced damages to DNA and MSCs via antioxidant mechanism: A chemistry study[J]. Journal of Saudi Chemical Society, 2015, 19: 454-460.

[18] TAN Dun-xian, HARDELAND R, MANCHESTER L, et al. Mechanistic and comparative studies of melatonin and classic antioxidants in terms of their interactions with the ABTS cation radical[J]. Journal of Pineal Research, 2003, 34: 249-259.

[19] LIN Jian, LI Xi-can, CHEN Li, et al. Protective effect against hydroxyl radical-induced DNA damage and antioxidant mechanism of [6]-gingerol: A chemical study[J]. Bulletin of the Korean Chemical Society, 2014, 6: 1 633-1 638.

[20] LI Xi-can, MAI Wen-qiong, CHEN Dong-feng, et al. Chemical study on protective effect against hydroxyl-induced DNA damage and antioxidant mechanism of myricitrin[J]. Journal of the Chinese Chemical Society, 2014, 61: 383-390.

[21] LIU Jing-jing, LI Xi-can, LIN Jian, et al. Sarcandra glabra (Caoshanhu) protects mesenchymal stem cells from oxidative stress: A bioevaluation and mechanistic chemistry[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine, 2016, 16: 423.

[22] VALENT I, TOPOLSKD, VALACHOVK, et al. Kine-tics of ABTS derived radical cation scavenging by bucillamine, cysteine, and glutathione: Catalytic effect of Cu2+ions[J]. Biophysical Chemistry, 2016, 212: 9-16.