□ 富 玥 內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市食品藥品檢驗(yàn)所

四環(huán)素包括四環(huán)素、土霉素、金霉素等，在較高濃度時(shí)其具有良好的殺菌作用。但是在近年來發(fā)現(xiàn)該類藥物可影響新生兒骨、牙的生長(zhǎng)。久用四環(huán)素類可引起畜禽等動(dòng)物機(jī)體的正常菌群減少，導(dǎo)致維生素缺乏癥，引起真菌繁殖，或引起二重感染?？股仡愃幬镞€是常見的致肝損傷藥物，在各類藥物性肝損傷的發(fā)病因中占首位。

本文根據(jù)四環(huán)素類抗生素的性質(zhì)采用市售成品中性HLB小柱作為固相萃取柱，用EDTA-Mcllvainc緩沖溶液進(jìn)行低溫提取。以不易損失、靈敏度高的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜作為定性、定量手段，建立了一種回收率高、快捷、靈敏、穩(wěn)定的檢測(cè)方法，為雞肉中四環(huán)素類抗生素檢測(cè)提供參考方法和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

超高相液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：UPLC I-CLASS/Xevo TQ-S；色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 （1.7 μm，2.1 mm×50 mm）；高速冷凍離心機(jī)：HC-3018R；旋渦振蕩器：XW-80A；氮吹儀：OA-SYS；純水機(jī)：PCJ-40。

1.2 材料與試劑

四環(huán)素類抗生素對(duì)照品，四環(huán)素純度98.4%；土霉素純度88.8%；金霉素純度94.1%；乙腈、甲醇為色譜純；乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉均為分析純；水為去離子水，由PCJ-40制得；固相萃取小柱：Oasis HLB固相萃取柱，60 mg/3 mL；檸檬酸溶液：0.1 mol/L，稱取10.55g檸檬酸，用水溶解，定容至500 mL；磷酸氫二鈉溶液：0.2 mol/L，稱取14.2 g磷酸氫二鈉，用水溶解，定容至500 mL；Mcllvainc緩沖溶液：將500 mL 0.1 mol/L檸檬酸溶液與313 mL磷酸氫二鈉溶液混合，必要時(shí)用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)pH=4.0±0.05；EDTA-Mcllvainc緩沖溶液：稱取30.3 g乙二胺四乙酸二鈉放入813 mL Mcllvainc緩沖溶液中，溶解，搖勻。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

準(zhǔn)確稱取51.0 mg三種四環(huán)素類抗生素于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配置成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，冷凍保存。

1.3.2 儀器條件

流動(dòng)相：A為0.01%甲酸水，B為0.3%乙腈。0～7 min，90%A線性變化至70%A；7～8 min，70%A線性變化至90%A；8～10 min，90%A。流速0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量 5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）電離，正離子模式掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式檢測(cè)；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣流速650 L/hr；錐孔氣流：150 L/hr；碰撞氣為氬氣。

化合物的檢測(cè)離子對(duì)（m/z）、錐孔電壓等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.3.3 樣品提取

取雞肉樣品10 000 r/min均質(zhì)1 min試料2 g，置50 mL容量瓶中，加入EDTA-Mcllvainc緩沖溶液8 mL，旋渦混勻2 min，10 000 r/min離心10 min（溫度低于10 ℃），取上清液于另一離心管內(nèi)，重復(fù)提取一次，合并上清液，待凈化。

1.3.4 凈化

取Oasis HLB 固相萃取柱（60 mg/3 mL），依次用3 mL甲醇、3 mL水活化，加入8 mL提取液過柱，用3 mL水、3 mL 5%甲醇水溶液淋洗，減壓抽干3 min。用5 mL甲醇洗脫，氮?dú)獯抵两? mL（溫度低于30 ℃），用甲醇補(bǔ)至1 mL，過0.22 μm濾膜待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶液的選擇

由于四環(huán)素類藥物中含有許多羥基、烯醇羥基及羰基，在中性條件下能與多種金屬離子形成不溶性螯合物。用EDTA-Mcllvainc緩沖溶液作為提取液可防止四環(huán)素類抗生素形成螯合物，更好提取該物質(zhì)。

2.2 色譜柱及流動(dòng)相的選擇

Inertsil C8-3色 譜 柱（5 μm，2.1 mm×150 mm）柱中的粒徑較大，對(duì)物質(zhì)保留較差，導(dǎo)致過早出峰以及分離度太小，影響出峰。采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）可有效分離三種抗生素且在合適的時(shí)間段出峰。

由于使用ESI+電離源，本實(shí)驗(yàn)用甲酸代替了FTA，發(fā)現(xiàn)使用甲酸也可以有較好的峰型和保留時(shí)間，見圖1。并且比對(duì)了在水中添加0.3%甲酸和0.01%甲酸時(shí)各待測(cè)物的色譜圖。三種

表1 3種四環(huán)素類抗生素質(zhì)譜參數(shù)

圖1 3種四環(huán)素定性、定量離子色譜圖

注：A為金霉素定性離子色譜圖；B為金霉素定量離子色譜圖；C為土霉素定量離子色譜圖；D為土霉素定性離子色譜圖；E為四環(huán)素定性離子色譜圖；F為四環(huán)素定量離子色譜圖；G為總離子色譜圖待測(cè)物的保留時(shí)間隨著甲酸含量增加而縮短，峰寬和峰高也隨之變窄和變高，信噪比增加，但考慮到保留時(shí)間過短容易受實(shí)際樣品預(yù)先流出的雜質(zhì)干擾，本實(shí)驗(yàn)選擇甲酸的添加量為0.01%。

表2 三種四環(huán)素類抗生素線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

表3 3種四環(huán)素類抗生素的平均回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

配置三種四環(huán)素類抗生素濃度為20、50、70、100、130、150、200 μg/L混合基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)工作液，以定量離子峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以對(duì)應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸分析，得到線性回歸方程。空白樣品中加入低濃度標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液，以信噪比（S/N=3）計(jì)算三種待測(cè)物的檢出限，結(jié)果見表2。

2.4 精密度與回收率

在2.0 g空白雞肉樣品中添加3種四環(huán)素類抗生素標(biāo)準(zhǔn)工作液，使其含 量 分 別 為 50、100、200 μg/L， 做6份平行實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%，結(jié)果見表3。

3 結(jié)論

本文采用了市售HLB小柱為固相萃取柱，通過對(duì)提取液的選擇、色譜條件的優(yōu)化建立了一種簡(jiǎn)單、快速的雞肉中3種四環(huán)素類抗生素的分析方法，該方法相對(duì)于目前國(guó)標(biāo)方法具有儀器污染減少、基質(zhì)干擾少、適用性強(qiáng)等特點(diǎn)，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好。