蔡弘揚 王晉

摘 要：目的： 拓撲替康對核干細胞因子表達的影響；方法： 采用免疫組化方法檢測NS基因及蛋白在HL-60白血病細胞中表達的影響；結(jié)果：免疫組化方法檢測NS在白血病細胞中陽性表達率高。結(jié)論： NS在白血病細胞系HL-60中表達。

關(guān)鍵詞：拓撲替康 核干細胞因子 影響

中圖分類號： R-0 文獻標識碼：A 文章編號：1003-9082（2018）05-0-01

拓撲替康（topotecan，TPT）以DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅰ（TopoⅠ）為作用靶點的半合成喜樹堿（CPT）衍生物，是一種新藥，呈水溶性，目前已廣泛應(yīng)用于多種實體瘤的治療及試用于惡性血液系統(tǒng)疾病的治療[1]，并取得較好療效。研究發(fā)現(xiàn)拓撲替康就是一種TopoⅠ抑制劑，作用位點比較獨特，拓撲異構(gòu)酶是一種細胞核內(nèi)酶，無多藥耐藥現(xiàn)象，有較好的選擇性特點。

核干細胞因子（NS）基因[2]是一個新基因，與增殖調(diào)控功能相關(guān)，在干細胞和腫瘤細胞中常見，是一種鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白， 存在于細胞核內(nèi)，以三磷酸鳥苷（GTP）依賴的形式游動，主要作用是和細胞增殖相關(guān)。近年來岳保紅[3]等人發(fā)現(xiàn)在早期多潛能狀態(tài)時的細胞內(nèi)核干細胞因子蛋白表達量大，如果細胞開始分化NS蛋白會表達量劇降且會很快不見。他們還發(fā)現(xiàn)NS蛋白參與細胞增值調(diào)控過程，提出了NS蛋白參與多種干細胞或者癌細胞自身不斷更新的進度，并且使細胞停留在分化狀態(tài)不再繼續(xù)分化。

一、材料與方法

1.材料

1.1細胞株

人源性白血病細胞系HL-60細胞，由中國協(xié)和醫(yī)科大學腫瘤研究所提供。

1.2試劑

TPT（注射用鹽酸拓撲替康）。

2.方法

2.1細胞培養(yǎng)

采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2飽和濕度下的恒溫箱中進行常規(guī)培養(yǎng)，平均2-3天換液一次，，正常情況下細胞生長懸浮成團，大小較均一，光滑圓潤，細胞膜完整，生長狀態(tài)良好，取2X106的細胞進行實驗。

2.2免疫組化實驗步驟

根據(jù)免疫組化的實驗說明。

2.2.1 免疫組化實驗步驟

細胞爬片：將新的蓋玻片（8*8mm）用酒精棉球擦洗凈，泡酸，75%的酒精溶液中浸泡30分鐘，然后取出用雙蒸水洗滌幾次，烘箱烘干，再用多聚賴氨酸（黏合劑）涂片，烤箱烘干，紫外消毒30分鐘。消毒好的蓋玻片放在90mm的培養(yǎng)皿中，并在次培養(yǎng)皿中接種細胞，細胞密度一般為2*104/ml，接種好后開始進行細胞爬片，放置在含量為5%的CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)，經(jīng)過2-3天后即可進行免疫細胞組織化學染色鑒定。

取出培養(yǎng)好細胞的蓋玻片后，PBS洗3次，每次5min，得到細胞涂片。

將細胞涂片放置在4%多聚甲醛內(nèi)固定30分鐘，到時間后，用蒸餾水進行沖洗，然后放置在含3%H2O2的去離子水中，室溫下浸泡10分鐘，目的是滅活內(nèi)源性過氧化物酶，以免影響后續(xù)試驗。

試劑盒內(nèi)取出封閉用正常山羊血清（試劑A），擠出1滴A于表面，放置室溫條件下20分鐘，然后輕輕甩去玻片表面多余液體。在載玻片表面滴加第一抗體（羊抗NS），放置4℃冰箱，過夜。

過夜后，取出，用PBS緩沖液沖洗，一般沖洗3次，每次沖洗5分鐘。取出試劑盒內(nèi)第二抗體SP-9000，試劑B，此步驟即滴加生物素標記的第二抗體，然后放置室溫下，10-15分鐘。

再用PBS緩沖液沖洗，共3次，每次5分鐘。試劑盒內(nèi)取出（試劑C），也即滴加1滴辣根酶標記鏈酶卵白素溶液，放置于室溫下，時間為10-15分鐘。PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加2滴DAB溶液（DAB溶液需要新鮮配制現(xiàn)配現(xiàn)用，放置太久失效），放在顯微鏡下觀察，并控制顯色時間。顯色好后用流動的自來水沖洗載玻片，沖洗后顯色反應(yīng)終止。經(jīng)過蘇木素復染，在經(jīng)過脫水﹑透明，然后封片。放置光學顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照。

2.2.2 陽性結(jié)果的判斷標準

顯微鏡下觀察，以細胞核內(nèi)出現(xiàn)淡黃至棕黃色顆粒為陽性細胞。并在顯微鏡下隨機計數(shù)300個細胞，以染色陽性的細胞所占的百分比值作為NS蛋白免疫組化檢測的結(jié)果。并對NS蛋白表達陽性所占比例進行下列計算：

陽性細胞所占百分數(shù)=細胞陽性染色個數(shù)/300×100%。

采用文獻報道的常用方法，根據(jù)陽性細胞數(shù)和著色深度計分乘積即表達強度進行評分。

癌細胞免疫組化染色著色深淺計分標準：0分為無色，l分為淡黃色，2分為黃色，3分為棕黃色。

表達強度=染色深淺×陽性細胞所占百分比?！?分的判定為表達陰性，>1判定為表達陽性。

二、結(jié)果

免疫組化結(jié)果示TPT對 HL-60細胞NS蛋白表達的影響：

HL-60細胞內(nèi)加入0.4?mol/L的拓撲替康，經(jīng)過36小時后，收集細胞進行免疫組化，檢測到核干細胞因子蛋白在細胞中的陽性細胞百分比為5.67%，而對照組中不加拓撲替康的細胞內(nèi)核干細胞因子蛋白表達陽性的細胞百分比例已達到89.67%，顯然，兩者相比差異具有統(tǒng)計學意義性（P<0.05）。（表1）。

三、討論

拓撲替康是1996年在美國上市的半合成抗腫瘤新藥，在臨床上已開始使用，這種藥物由Smithkline Beecham制藥公司制造，供應(yīng)于各地，它也是世界上第一個以拓撲異構(gòu)酶Ⅰ為靶酶的抗腫瘤藥物，也有國產(chǎn)的拓撲替康，價格也較進口便宜，但療效較進口為差。

急性白血病 （acute leukemia） [4]是一種惡性血液系統(tǒng)疾病，特點是造血干細胞功能大部分喪失，細胞不斷增殖克隆，白血病患者的造血干細胞和正常的造血干細胞存在類似的特點。白血病是血液系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率越來越高，死亡率也很高，這就嚴重影響了國民健康。但是隨著聯(lián)合化療的不斷發(fā)展[5]，骨髓移植術(shù)的不斷提高，免疫治療及基因治療的不斷改善[5]，急性白血病的治療效果明顯得到了很大的提高。有研究報道核干細胞因子在正常造血系統(tǒng)的造血干細胞中發(fā)現(xiàn)，在成熟細胞和淋巴細胞沒有發(fā)現(xiàn)它的蹤跡；白血病細胞是些不分化的幼稚細胞，無限增殖克隆[6]，因此，NS在白血病細胞可發(fā)現(xiàn)，但目相關(guān)關(guān)NS在白血病細胞表達的研究不多甚至少有[7]。拓撲替康能否以抑制NS蛋白在白血病細胞中表達的方式，來阻止白血病細胞的無限克隆增殖還需進一步研究，TPT對白血病細胞的抗腫瘤作用與NS基因的表達之間是否存在相關(guān)的關(guān)系有待進一步探索。本研究應(yīng)用相關(guān)分子生物學技術(shù)探討TPT對白血病細胞誘導凋亡的作用，并檢測TPT是否能夠抑制白血病細胞中的核干細胞因子及其蛋白的表達使其下調(diào)，從而更深層次的明確TPT治療白血病細胞的作用機制，為臨床提供有價值的實驗資料。

本研究結(jié)果顯示：通過免疫組化結(jié)果顯示對照組（未用TPT作用組）可見核內(nèi)棕黃色著色深度深，而經(jīng)過0.4?mol/L TPT作用36小時后的HL-60細胞著色深度明顯變淺甚至沒有著色，結(jié)果都表明TPT可以抑制白血病細胞中NS基因的表達，使之下調(diào)，推理之TPT通過抑制NS蛋白成為治療白血病的機制之一也不為不可能。也有研究表明，NS可能在細胞周期中干細胞和癌細胞穿越G2/M調(diào)控點的決定方面是一個特異性因子，由于它僅表達于干細胞和惡性腫瘤細胞中，而白血病既是干細胞疾病又是惡性腫瘤，因此在白血病細胞中研究NS基因和NS蛋白也比較合適，而TPT是Topo-Ⅰ的抑制劑，具有廣譜抗腫瘤作用，其作用機制也并不十分完全明了，因此，TPT有可能通過下調(diào)NS基因而達到抗白血病作用可能為其作用機制之一。

TPT可以通過抑制HL-60細胞中NS蛋白的表達，并且也可能是通過抑制NS基因的表達，使NS基因表達下調(diào)，從而導致細胞離開細胞增殖周期而不斷發(fā)生分化，使白血病細胞發(fā)生凋亡而達到抗腫瘤作用。

參考文獻

[1]劉庭波，呂聯(lián)煌.c-myc反義寡脫氧核苷酸誘導人髓系白血病細胞系HL-60細胞凋亡.中國實驗血液學雜志，2001，9（1）：34-38

[2]張志宏；劉思金；等；RNA干擾抑制膀胱腫瘤細胞BIU-87核干細胞因子基因表達對其增殖的影響[J]；中華泌尿外科雜志；2006，S1：28-29

[3]岳保紅，孫玲等.核干細胞因子基因在急性白血病細胞表達的檢測和意義[J]，中華檢驗醫(yī)學雜志，2006，29（4）：324

[4]Joan C.Ritland Politz， Ilvin Polena， Ian Trask，et al A Nonribosomal Landscape in the Nucleolus Revealed by the Stem Cell Protein NS.Molecular Biology of the cell.2005，16：3401-3410.

[5]Tsai RY，Mckay RD.A nucleolar mechanism controlling cell proliferation in stem cells and cancer cells. Genes Dev， 2002， 16（23）：2991-3003.

[6]Joan C.Ritland Politz， Ilvin Polena， Ian Trask，et al A Nonribosomal Landscape in the Nucleolus Revealed by the Stem Cell Protein NS.Molecular Biology of the cell.2005，16：3388-3396.

[7]Liu S，J，CaiZW，Liu Y，J，et al， Role of nucleostemin in growth regulation of gastric cancer，liver cancer，liver cancer and other rnalignancies[J].World J Gastroenterol，2004，10（9）：1246-1249.