玉力吐孜·迪力木臘提 努爾哈提·斯拉甫爾 烏斯?jié)M·依米提

摘 要：【目的】分離純化新疆喀什維吾爾族長壽老人腸道中的降膽固醇乳酸菌及其生物學特性研究?！痉椒ā客ㄟ^平板分離法從喀什維吾爾族長壽老人腸道中共分離獲得降膽固醇候選菌株10株，并采用硫酸鐵銨法測定菌株對選擇性培養(yǎng)基中膽固醇的脫除率，并進行了16SrDNA測序和分子鑒定。 【結果】篩選出的10株實驗菌株均能從培養(yǎng)基中除去膽固醇，去除率都大于60%，經(jīng)過分子鑒定為乳酸菌，都屬于腸球菌。其中篩選出3株調(diào)節(jié)能力較強的候選菌（R08-37，R05-24，R02-6）。表明這些菌株對人類的長壽能起到一定的作用。

關鍵詞：喀什 長壽老人腸道 降膽固醇 乳酸菌

中圖分類號：Q93-31 文獻標識碼：A 文章編號：1003-9082 （2018）05-0-02

目前，新疆南疆地區(qū)是我國正式命名的7大“長壽地區(qū)”之一[1]。研究者曾經(jīng)對我國著名的長壽地區(qū)進行多次調(diào)查和研究總結出的長壽因素有基因遺傳[2]、氣候條件、環(huán)境因素[3]、合理飲食結構、居住環(huán)境[4]等等，而長期忽略了人類共生微生物。近幾十年以來國內(nèi)外研究表明[5-7]，共生微生物也有較強的降膽固醇功能。

乳酸菌是人體腸道中重要的益生菌，除了在調(diào)節(jié)胃腸道微生態(tài)平衡、提高免疫系統(tǒng)功能起著重要的作用[8]以外還具有降低食物及人體血清中膽固醇含量的作用。

本研究首次我國喀什地區(qū)90歲以上維吾爾族長壽老人糞便為實驗材料，篩選出具有降膽固醇、對膽鹽及酸有較強的耐受性的乳酸菌，為食品、藥品等行業(yè)提供優(yōu)良菌種。

一、材料與方法

1.材料

樣品來源：從新疆喀什地區(qū)采集16位維吾爾族人糞便樣品（男性8名，女性8名），90～102歲；所有采樣對象在被采樣前至少兩個星期內(nèi)未服用任何含有活菌的發(fā)酵食品、未服用任何種類的抗生素類藥物。

主要試劑：改良的MRS+CaCO3固體培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基、濃度為0.1mg/mL 的高膽固醇MRS-CHOL選擇性培養(yǎng)基[9]；細菌基因組DNA提取試劑盒、溶菌酶、Tag聚合酶等。

2.方法

2.1 乳酸菌的分離、純化

將長壽老人糞便樣品進行梯度稀釋至10-4，10-5和10-6，在經(jīng)過滅菌并冷卻到45～50℃的改良MRS+CaCO3瓊脂培養(yǎng)基上涂布，37℃厭氧培養(yǎng)24-36h，挑取菌落比較大、有透明圈的菌落，進行純化處理，之后置于甘油中存儲。

2.2 菌株形態(tài)觀察

對分離得到的菌株進行菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色，并進行鏡檢[10]。

2.3 體外膽固醇能力的測定

運用硫酸鐵銨法[11]對膽固醇含量進行測定，且繪制出相應的標準曲線。

膽固醇的調(diào)節(jié)率/%=（C-A）/C╳100%

其中A指的是各實驗菌株發(fā)酵后的選擇培養(yǎng)液OD620nm； C指的是空白對照的OD620nm。

2.4 菌株鑒定

2.4.1 菌株屬的鑒定：對篩選出的革蘭氏陽性菌菌株實施生化特性測定，主要涉及硫化氫產(chǎn)生試驗、硝酸鹽還原試驗、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗、半乳糖試驗、45℃生長試驗，pH4.5生長試驗等。

2.4.2 菌株16S rDNA序列鑒定：對菌液進行活化處理，采用細菌基因組DNA快速抽提試劑盒進行提取。將細菌DNA作為基礎，采用27F（5-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3）、1492R（5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3）實施PCR擴增，采用1.0%瓊脂凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測，正確的擴增子則委托生物工程（上海）股份有限公司實施DNA測序。將最終結果提交NCBI基因庫，實施Blast比對分析。

2.5 分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)過Excel（2010）進行初步統(tǒng)計，所有的數(shù)據(jù)均重復三次，每次實驗均做平行實驗，實驗結果表示為均值±標準偏差（X ±SD）。應用SPSS（19.0）軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)間的比較采用獨立樣本T檢驗（Independent-Samples T test）、單因素方差分析（one-way ANOVA）多重比較進行分析。P<0.05表示差異顯著有統(tǒng)計學意義。

二、結果與分析

1.菌株的分離、純化

通過分離獲取人源乳酸菌10株，經(jīng)革蘭氏染色表現(xiàn)為陽性。

2.體外檢測膽固醇含量

將膽固醇質(zhì)量濃度（mg/mL）作為橫坐標，將620nm下的吸光度值作為縱坐標，做出標準曲線，如圖1所示，可得擬合直線方程為：y=0.5308x+0.001，該方程的R2=0.9941，存在較高的擬合度，表明此直線方程可作為標準曲線。

3.人源乳酸菌調(diào)節(jié)能力測定

對從采集的8份樣品（長壽組）中分離獲得的10株菌株進行體外降膽固醇能力以及各菌株對膽固醇的去除率的測定，10株調(diào)節(jié)率≥60%的乳酸菌（表1）

由表可知，對膽固醇調(diào)節(jié)能力的測定結果顯示，菌株R08-37的調(diào)節(jié)能力最高，對應的調(diào)節(jié)膽固醇的量為52.75ug/mL。

4.候選菌株的生化鑒定和16SrDNA測序結果

已分離的10株乳酸菌均為革蘭氏染色陽性，吲哚實驗、硫化氫實驗、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗、半乳糖試驗等均表現(xiàn)為陰性，于15℃、45℃環(huán)境下能夠生長，于60℃環(huán)境下不可生長；可耐受6.5%NaCl，可于pH9.6環(huán)境下生長，結合《伯杰氏細菌鑒定手冊》，繼而判斷為腸球菌屬。

5.菌株16SrDNA鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹

采用MEGA6.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

從圖中可知，RO1-1HQ603859、RO1-2HQ603858、R02-6（JF896442）、R02-7（JF896442）、R04-20（DQ411813）為Enteroco durans的不同變異品系；R05-21（AF539705）、R05-22（AJ306297）、R05-23（HM443954）均為Enterococcus faecium的不同變異品系；R05-24（D16552）、R08-37（AF469172）為Lactobacillus plantanum的不同變異品系。

將10株候選菌株目的片段委托生物工程（上海）生物科技有限公司測序后，提交NCBI進行Blast比對結果顯示均為腸球菌。

三、討論

由表1可以得知已篩選分離純化的39株人源乳酸菌都能調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的膽固醇，其中篩選出10株調(diào)節(jié)膽固醇能力高于60%的候選菌株。郭欽【12】、溫子輝【13】、彭燦【14】、呂秀紅【15】研究的食品源乳酸菌的降膽固醇率分別達到30.9%、52.2%、69%，50.03%。本實驗的結果符合常規(guī)，也具有很大的優(yōu)勢。

篩選出的乳酸菌除了具備降膽固醇功能外，還應考慮到其他方面的功能。在本實驗中，所選取的菌株不僅要具有降膽固醇活性，而且生長范圍均比較廣（15℃～45℃）、耐pH9.6、耐鹽（6.5%），有較強的腸道膽鹽環(huán)境耐受性，具有菌株特異性。

綜上所述，乳酸菌的去除膽固醇能力、低pH的耐受性并無明顯相關性，菌株之間存在差異性。在本研究中，所篩選出的三株菌株具有進一步深入研究的價值，繼而為乳酸菌和長壽的關系研究奠定基礎。

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作者簡介：玉力吐孜·迪力木臘提（1990.2.1-），女，維吾爾族，碩士，研究方向：微生物資源開發(fā)。

通訊作者：烏斯?jié)M·依米提，男，維吾爾族，副教授，博士，研究方向：微生物資源與開發(fā)。