張少偉 崔紅艷 蘇瑛

摘要：【目的】明確促卵泡激素β亞基（FSHβ）基因在雷州黑鴨群體中的遺傳變異情況，為雷州黑鴨群的品種選育提供分子標(biāo)記。【方法】采用PCR-SSCP對(duì)200羽雷州黑鴨FSHβ基因的外顯子2（exon2）和內(nèi)含子l（intl）進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，通過(guò)測(cè)序篩查出多態(tài)性位點(diǎn)（SNP位點(diǎn)），同時(shí)分析不同基因型與雷州黑鴨產(chǎn)蛋性狀間的相關(guān)性?！窘Y(jié)果】在雷州黑鴨FSHβ基因的g.1103451A>T（intl）處發(fā)現(xiàn)一個(gè)單核苷酸突變位點(diǎn)（A→T），其存在3種基因型（AA型、AT型和TT型），對(duì)應(yīng)的基因型頻率分別為0.538、0.359和0.103。T等位基因頻率（0.718）高于A等位基因頻率（0.282），且g.1103451A>T位點(diǎn)在雷州黑鴨群體中符合Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P>0.05）。雷州黑鴨的開(kāi)產(chǎn)日齡以TT型個(gè)體最早，其次是AT型個(gè)體，分別比AA型個(gè)體提前5.48和4.00 d，其差異均達(dá)顯著水平（P<0.05，下同）；在開(kāi)產(chǎn)體重和300日齡產(chǎn)蛋數(shù)方面，也表現(xiàn)為T(mén)T和AT型個(gè)體顯著高于AA型個(gè)體，且以TT型個(gè)體最高，分別為1299-31g/羽和134.37枚；其他產(chǎn)蛋性狀指標(biāo)在不同基因型個(gè)體間的差異均不顯著（P>0.05）?！窘Y(jié)論】雷州黑鴨FSHβ因intl存在一個(gè)SNP位點(diǎn)（g.1103451A>T），其與產(chǎn)蛋性能間存在顯著相關(guān)性，主要對(duì)早期產(chǎn)蛋和生長(zhǎng)發(fā)育具有促進(jìn)作用，可作為雷州黑鴨品種選育的輔助選擇分子標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：雷州黑鴨：FSHβ基因：SNP位點(diǎn)：產(chǎn)蛋性能：關(guān)聯(lián)分析

0引言

【研究意義】雷州黑鴨原產(chǎn)于廣東省雷州半島，是經(jīng)自然馴化與當(dāng)?shù)厝嗣耖L(zhǎng)期選育而形成的蛋鴨品種，通體烏黑亮澤，產(chǎn)蛋多，蛋個(gè)大，蛋殼青綠色，蛋黃橘紅，口感鮮美，且具有耐粗飼、抗病力和覓食力強(qiáng)、環(huán)境適應(yīng)性廣等特點(diǎn)（湯綺明，2013；黃駿騰等，2014）。在標(biāo)準(zhǔn)的飼養(yǎng)條件下，母鴨開(kāi)產(chǎn)日齡為90～120日齡，其中，春鴨在90日齡即可開(kāi)產(chǎn)，而秋鴨需到120日齡才開(kāi)始產(chǎn)蛋，產(chǎn)蛋期長(zhǎng)達(dá)1年，年均產(chǎn)蛋量250枚左右，高峰期產(chǎn)蛋率在90%以上（黃駿騰等，2014）?？梢?jiàn)，雷州黑鴨是培育高產(chǎn)、早熟、抗病型蛋用鴨的珍貴遺傳素材。促卵泡素（FSH）是一種糖蛋白類(lèi)促性腺激素，由動(dòng)物垂體前葉嗜堿性細(xì)胞分泌（Wang and Bernard，2012；李紅飛等，2017），是由a亞基和特異性β亞基形成的異源二聚體，調(diào)節(jié)下丘腦—垂體一性腺生殖軸中的反饋和負(fù)反饋?zhàn)饔茫℉uanget al，2015）。FSH的a亞基較保守，β亞基則決定種屬特性，故其行使的生物功能主要依賴(lài)于β亞基的特異作用，但β亞單位只有與a亞單位結(jié)合才具有生物學(xué)活性（Kato，1988；You et al，1996）。此外，F(xiàn)SHβ基因與畜禽繁殖性狀密切相關(guān)（楊孔等，2014；李俊等，2015；王蒙，2015；秦玉梅等，2017），因此，加強(qiáng)FSHβ基因研究對(duì)推進(jìn)畜禽品種改良具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，有關(guān)家畜FSHβ基因的研究主要集中在基因多態(tài)性與豬羊產(chǎn)仔數(shù)、牛產(chǎn)奶量等的相關(guān)性分析方面。李俊等（2015）在廣西環(huán)江香豬中未能檢測(cè)出FSHβ基因的多態(tài)性位點(diǎn)（SNP位點(diǎn)），表明FSHβ基因型在動(dòng)物繁殖性能上具有特異性和種屬性特點(diǎn)。Nazifi等（2015）運(yùn)用PCR-SSCP對(duì)3種本地羊的FSHβ基因多態(tài)性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FSHβ基因位點(diǎn)在不同種群間存在明顯差異。胡閃耀（2016）對(duì)美系和法系大白豬的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHβ基因存在AA、AB和BB基因型，其關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果表明，無(wú)論是初產(chǎn)大白母豬還是經(jīng)產(chǎn)大白母豬，均以BB基因型個(gè)體的總產(chǎn)仔數(shù)、健仔數(shù)和初生窩重最高。Aljuaydi等（2016）研究?jī)蓚€(gè)不同埃及山羊品種FSHβ基因外顯子1（exonl）、內(nèi)含子2（int2）和外顯子3（exon3）位點(diǎn)遺傳多態(tài)性及其與窩產(chǎn)仔數(shù)的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AA基因型在兩個(gè)山羊品種中均具有更多的產(chǎn)仔數(shù)。姚毅等（2016）通過(guò)分析波爾山羊、成都麻羊FSHβ基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)FSHβ基因可能是控制山羊繁殖性能的一個(gè)主效基因。在家禽方面，F(xiàn)SHβ基因研究側(cè)重于基因多態(tài)性與產(chǎn)蛋量（韓厚明等2008）、開(kāi)產(chǎn)日齡（王青娟，2012）、蛋品質(zhì)（王蒙，2015）等繁殖性能的相關(guān)性。洪坤月等（2007）采用PCR-SSCP檢測(cè)太湖雞的FSHβ基因多態(tài)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FSHβ基因型頻率以AA型最高、BB型最低，等位基因頻率A高于B，且FSHβ基因exon3位點(diǎn)不存在多態(tài)性。楊孔等（2014）分析了藏雞FSHβ基因多態(tài)性與產(chǎn)蛋性能的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藏雞與羅曼雞一樣，其FSHβ基因exon2和exon3均無(wú)突變位點(diǎn)。王蒙（2015）研究表明，在連城白鴨與白改鴨雜交群體的FSHβ基因序列上存在7個(gè)新SNPs位點(diǎn)，其中2個(gè)為酶切位點(diǎn)（c.82C>G和c.308T>G），酶切位點(diǎn)c.82C>G與雜交群體的鴨蛋品質(zhì)顯著相關(guān)，而酶切位點(diǎn)c.308T>G與雜交群體的產(chǎn)蛋量極顯著相關(guān)。王亞男等（2015）研究表明，京海黃雞FSHβ基因多態(tài)性存在AA、AB、BB、CC、CD和DD基因型，H_AB基因型個(gè)體體重顯著高于BB基因型個(gè)體，CC基因型個(gè)體體重極顯著高于CD基因型個(gè)體?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】家禽血漿中FSHB的含量受光照、饑餓和年齡等多種因素影響，進(jìn)而影響家禽的產(chǎn)蛋性能（Lewis et al，2005；額爾敦木圖等，2007），即FSHβ基因可作為家禽繁殖性狀的候選基因，但至今有關(guān)水禽FSHβ基因多態(tài)性與其產(chǎn)蛋性能的關(guān)聯(lián)研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用PCR-SSCP對(duì)雷州黑鴨FSHβ基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)測(cè)序篩查出SNP位點(diǎn)，繼而分析不同基因型與產(chǎn)蛋性狀間的相關(guān)性，明確FSHβ亞基基因在雷州黑鴨群體中的遺傳變異情況，為雷州黑鴨群的品種選育提供分子標(biāo)記。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試?yán)字莺邙営蓮V東省湛江市坡頭恒成種養(yǎng)合作社提供，共200羽，于300日齡時(shí)進(jìn)行翅靜脈采血（1.0 mL/羽），血樣-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1基因組DNA提取與檢測(cè)根據(jù)HiPure BloodDNA Mini Kit說(shuō)明提取雷州黑鴨基因組DNA，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取效果。

1.2.2 SNP位點(diǎn)篩查根據(jù)GenBank已公布的鴨FSHβ基因（101794876）全長(zhǎng)序列查找其外顯子2（exon2）和內(nèi)含子1（intl），采用Primer Primer 6.0設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系40.0μL：其中DNA模板1.0μL，Premix Taq DNA聚合酶20.0μL，上、下游引物各1.0μL，ddH20 17.0μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃30 s，退伙30 s，72℃1 min，進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；72℃延伸2 min。以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是否出現(xiàn)在目的條帶的預(yù)期位置，然后將目的基因片段送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)序列比對(duì)分析篩查SNP位點(diǎn)。

1.2.3 PCR-SSCP分析根據(jù)篩查到的SNP位點(diǎn)，采用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物（表2），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系10.0μL：DNA模板1.0μL，Premix Taq DNA聚合酶4.5μL，上、下游引物各1.0μL，ddH20 2.5μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃1 min，進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；72℃延伸2 min，4℃保存?zhèn)溆谩Ｓ?.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增效果。取3.0μLPCR產(chǎn)物，加入7.0μL變性上樣緩沖液，于PCR儀上295℃變性10 min后取出冰浴5 min，防止復(fù)性。經(jīng)10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，銀染顯色并拍照。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)雷州黑鴨FSHB基因PCR-SSCP分析獲得的各種基因型，計(jì)算基因型頻率和等位基因頻率，并進(jìn)行卡方適合性檢驗(yàn)。同時(shí)采用SAS 9.2對(duì)不同基因型個(gè)體問(wèn)的產(chǎn)蛋性狀進(jìn)行多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1雷州黑鴨FSHβ基因SNP位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果

由圖1可看出，采用exon2和intl引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均可獲得單一、清晰的目的條帶，其大小與預(yù)期結(jié)果一致。測(cè)序結(jié)果表明，雷州黑鴨FSHβ基因的g.1103451A>T（int1）處存在一個(gè)突變位點(diǎn)（圖2）。以SSCP引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，也獲得單一、清晰的目的條帶（圖3），且條帶大小與預(yù)期結(jié)果一致，即可用于后續(xù)的多態(tài)性分析。雷州黑鴨FSHβ基因SNP位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SSCP分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在117羽雷州黑鴨個(gè)體中共有3種基因帶型（圖4），經(jīng)測(cè)序得知，分別為AA型、AT型和TT型（圖5）。

2.2雷州黑鴨FSHβ基因SNP位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率

由表3可知，F(xiàn)SHβ基因SNP位點(diǎn)（g.1103451A>T）中以TT型的基因型頻率最高，為0.538，AT型為0.359，AA型最低（0.103）。此外，T等位基因頻率（0.718）高于A等位基因頻率（0.282），說(shuō)明純合的TT型是雷州黑鴨的優(yōu)勢(shì)基因型。經(jīng)卡方適合性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，，說(shuō)明g.1103451A>T位點(diǎn)在雷州黑鴨群體中符合Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P>0.05）。

2.3雷州黑鴨FSHβ基因SNP位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性參數(shù)

遺傳特性分析結(jié)果表明，雷州黑鴨FSHβ基因SNP位點(diǎn)（g.1103451A>T）的期望雜合度（H）為0.405，觀測(cè)雜合度（Ho）為0.359，說(shuō)明該位點(diǎn)呈中等的遺傳多態(tài)性；其有效等位基因數(shù)（Ne）為1.68，多態(tài)信息含量（PIC）為0.323（0.250

2.4雷州黑鴨V基因SNP位點(diǎn)與其產(chǎn)蛋性狀的相關(guān)性

由表4可知，開(kāi)產(chǎn)日齡以TT型個(gè)體最早，較AA型個(gè)體提前5.48 d左右，二者差異顯著（P<0.05，下同）；AT型個(gè)體比AA型個(gè)體提前4.00 d開(kāi)產(chǎn)，其差異也達(dá)顯著水平。在開(kāi)產(chǎn)體重方面，TT和AT型個(gè)體差異不顯著（P>0.05，下同），但二者顯著高于AA型個(gè)體。300日齡產(chǎn)蛋數(shù)也以TT型個(gè)體最多（134.37枚），其次是AT型個(gè)體（132.58枚），AA型個(gè)體最少（123.30枚），且TT和AT型個(gè)體顯著高于AA型個(gè)體。其他產(chǎn)蛋性狀指標(biāo)在不同基因型個(gè)體間的差異均不顯著。綜上所述，雷州黑鴨FSHβ基因TT型效應(yīng)與其產(chǎn)蛋性能存在顯著相關(guān)性。

3討論

由于g.1103451A>T位點(diǎn)堿基A→T的突變位于基因內(nèi)含子上，因此不會(huì)引起編碼氨基酸的改變。雖然內(nèi)含子在基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中被剪切，并不參與功能蛋白合成，但其變異可通過(guò)mRNA運(yùn)輸、基因轉(zhuǎn)錄、定位及翻譯等過(guò)程影響基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)（Nottet al，2003），故推測(cè)FSH基因內(nèi)含子變異對(duì)雷州黑鴨的產(chǎn)蛋性能也有明顯影響。Haigh等（2007）研究表明，內(nèi)含子參與基因的表達(dá)調(diào)控，且對(duì)于某些基因的特異表達(dá)必不可少。洪坤月等（2007）研究推測(cè)，在內(nèi)含子序列中可能存在某些調(diào)控因子的結(jié)合位點(diǎn)。本研究結(jié)果表明，雷州黑鴨FSHβ基因intl上的堿基突變（A→T）對(duì)其產(chǎn)蛋量和開(kāi)產(chǎn)日齡均有顯著影響，說(shuō)明FSHβ基因在產(chǎn)蛋和早期生長(zhǎng)方面具有促進(jìn)作用，但該突變是否是通過(guò)影響FSHβ基因表達(dá)而影響其產(chǎn)蛋性能尚需進(jìn)一步探究。此外，SSCP分型結(jié)果表明，雷州黑鴨FSHβ基因SNP位點(diǎn)（g.1103451A>T）的A、T等位基因頻率分別為0.282和0.718，經(jīng)卡方適合性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)g.1103451A>T位點(diǎn)在雷州黑鴨群體中符合Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，即具有穩(wěn)定的遺傳效應(yīng)；SNP位點(diǎn)（g.1103451A>T）的He、PIC分別為0.405和0.323，屬中度多態(tài)位點(diǎn)?？梢?jiàn)，雷州黑鴨群體在g.110345 1A>T位點(diǎn)上具有一定的選擇潛力。

本研究利用SAS 9.2對(duì)不同基因型個(gè)體與其產(chǎn)蛋性能的表型值進(jìn)行多重比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雷州黑鴨的開(kāi)產(chǎn)日齡以TT型個(gè)體最早，其次是AT型個(gè)體，分別比AA型個(gè)體提前5.48和4.00 d，其差異均達(dá)顯著水平；在開(kāi)產(chǎn)體重和300日齡產(chǎn)蛋數(shù)方面，也表現(xiàn)為T(mén)T和AT型個(gè)體顯著高于AA型個(gè)體，且以TT型個(gè)體最高，說(shuō)明FSHβ基因在雷州黑鴨的產(chǎn)蛋性能和早期生長(zhǎng)方面具有促進(jìn)作用。涂小璐等（2008）研究表明，文昌雞FSH～]基因5端突變位點(diǎn)與開(kāi)產(chǎn)日齡和42周齡產(chǎn)蛋量顯著相關(guān)。王青娟（2012）通過(guò)分析文昌雞FSHβ基因（intl）SNP位點(diǎn)多態(tài)性與其產(chǎn)蛋性狀的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AB基因型個(gè)體在開(kāi)產(chǎn)日齡上表現(xiàn)出比AA基因型個(gè)體晚2.97 d的劣勢(shì)。王蒙（2015）研究發(fā)現(xiàn)，連城白鴨與白改鴨雜交Ft代FSHβ基因突變位點(diǎn)c.308T>G與120日齡產(chǎn)蛋量極顯著相關(guān)。王亞男等（2015）對(duì)京海黃雞FSHβ基因多態(tài)性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在外顯子上的突變點(diǎn)對(duì)產(chǎn)蛋性能無(wú)影響，但對(duì)早期體重有影響。雖然本研究結(jié)果與上述相關(guān)研究結(jié)果存在不同程度的差異，但可確定FSHβ基因?qū)仪菰缙诋a(chǎn)蛋和生長(zhǎng)發(fā)育具有促進(jìn)作用，即FSHβ基因g.1103451A>T位點(diǎn)可作為雷州黑鴨品種選育的分子標(biāo)記。

4結(jié)論

雷州黑鴨FSHβ基因intl存在一個(gè)SNP位點(diǎn)（g.1103451A>T），其與產(chǎn)蛋性能間存在顯著相關(guān)性，主要對(duì)早期產(chǎn)蛋和生長(zhǎng)發(fā)育具有促進(jìn)作用，可作為雷州黑鴨品種選育的分子標(biāo)記。