劉思敏 黃思婕 陸笛 劉柳 孫寧靜

摘 要：該研究以廣西特色柿品種‘恭城月柿為材料，在采后貯藏過程中對其氧化還原電位（ORP）、乙烯生物合成量、硬度、色差、抗氧化酶及細胞壁降解酶活性的變化進行了測定，初步探討柿果實氧化還原電位與乙烯生物合成和相關酶活性的關系。結果表明：貯藏期果實的硬度整體呈下降趨勢，乙烯利處理果實的硬度從采后3 d即急速下降，至貯藏末期始終顯著低于對照。貯藏前14 d果實轉色較緩慢，采后15 d乙烯利處理果實的總色差ΔE值快速上升至29.6，轉色完全，顯著高于對照的11.9。在貯藏前期處理和對照果實的ORP均穩(wěn)定在7.5 mv·g-1，采后15 d乙烯利處理果實的ORP快速上升至11.9 mv·g-1，是對照組的1.4倍。乙烯利處理果實的乙烯生物合成量在貯藏前期呈較低水平，采后15 d乙烯生成量急劇增加至0.372 μL·kg-1·h-1的高峰，對照乙烯生成量則始終維持在0.033 μL·kg-1·h-1的較低水平?？梢?，乙烯生成量的增加與ORP的上升關系密切。此外，抗氧化酶中的過氧化物酶（POD）和細胞壁降解酶中的β-D-半乳糖苷酶（β-D-Gal）活性與ORP呈極顯著正相關，表明二者受果實ORP變化的影響。因此，經(jīng)乙烯利處理柿果實的ORP貯藏末期顯著上升，促進乙烯生物合成量的急劇增加，誘導抗氧化酶POD和細胞壁降解酶 β-D-Gal活性增強，導致果實急速后熟軟化。柿果實ORP可能作為開關調(diào)控1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）生成乙烯這一生物化學反應，即打破ORP的穩(wěn)定狀態(tài)引發(fā)乙烯合成的啟動。

關鍵詞：柿，氧化還原電位，乙烯，酶活性，軟化，保鮮

中圖分類號：Q945

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2018）10-1326-09

Abstract：Ethylene is a common plant hormone which can accelerate the ripening of fruits. Post-harvest ripening involves a variety of complex metabolic processes such as ethylene biosynthesis，reactive oxygen species biosynthesis and cell wall degradation hydrolyses. ‘Gongcheng persimmon is a distinctive variety of Guangxi Zhuang Autonomous Region，and was used as the research material to determine the changes of indexes e.g.，oxidation reduction potential（ORP），ethylene biosynthesis，firmness，total chromatism，and related enzyme activities during the storing experiment. The results demonstrated that firmness decreased continuously during the whole storing period，the firmness of fruits were treated with ethephon were declining rapidly during the first three days of storage，and were significantly lower than the control at all times. During the first fourteen days of storage，the total color chromatism was rising slowly. Fifteen days after harvest，the color of fruits，which were treated with ethephon，had changed completely and delta E value rapidly increased to the maximum of 29.6 which is evidently higher than that of the control 11.9. The ORP changed within a smaller range and maintained at 7.5 mv·g-1 in the prophase of storage. Fifteen days after harvest，the ORP of fruits which were treated with ethephon increased rapidly to 11.9 mv·g-1，1.4 times as much as that of the control. Additionally，ethylene biosynthesis did not change significantly during the first fourteen days. However，from the fifteenth days after harvest，the ethylene biosynthesis rate of fruits were treated with ethephon increased sharply to 0.372 μL·kg-1·h-1 and reached the maximum，but the control kept at a stable level of 0.033 μL·kg-1·h-1. Thus，the increase of ethylene biosynthesis was closely related to the rise of ORP. Furthermore，the activity of peroxidase（POD） belonging to the antioxidative enzymes and β-D-galactosidase（β-D-Gal） belonging to the cell wall degrading enzymes were also significantly and positively correlated to ORP，indicating that POD and β-D-Gal activities are affected by the ORP. Therefore，the ORP of persimmon fruits treated with ethephon increased observably at the end of storage，promoting a sharp biosynthesize of ethylene，increasing activities of POD and β-D-Gal，and finally resulting in the rapid softening and ripening of persimmon. It is proved that persimmon fruit ORP may act as a switch to control the biochemical reaction of ethylene biosynthesis，and breaking the ORP steady state can initiate ethylene synthesis.

Key words：persimmon，oxidation reduction potential，ethylene，enzyme activity，soften，retain freshness

‘恭城月柿是我國廣西的特色澀柿品種，存在著澀與甜、脆與軟的矛盾（王華瑞等，2004），采后脫澀處理導致的物理和化學傷害促進了果實的成熟軟化，從而影響其品質和貨架期（Yin et al，2012）。因此，貯藏期間果實的快速成熟軟化嚴重制約了廣西柿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。柿果實屬于呼吸躍變型果實，對乙烯極為敏感，貯藏環(huán)境中極微量的乙烯便可誘導其產(chǎn)生內(nèi)源乙烯從而導致其后熟軟化（Itamura，1986; Itamura et al，1991）。部分躍變型水果成熟期在樹上不易成熟，一旦與樹體脫離則迅速進入呼吸躍變期（Burg & Burg，1962）。Sun et al（2009，2010，2013）研究發(fā)現(xiàn)柿果實著生樹體期間乙烯合成的啟動由韌皮部的“光合產(chǎn)物流因子”和木質部的“水因子”共同控制，切斷任何一個途徑都能誘導果實內(nèi)源乙烯的大量生成。采后研究中，水分脅迫通過誘導啟動果蒂的乙烯合成，進一步促發(fā)果實的乙烯自動催化反應在柿果實中已得到證實（Nakano et al，2001，2002，2003）。但外源抗氧化劑（維生素C）可以明顯抑制采后柿（范靈姣等，2017）和獼猴桃（Yin et al，2013）乙烯合成前體物（ACC）積累和關鍵酶（ACS、ACO）活性增加，進而減少內(nèi)源乙烯生成。外投抗氧化劑會影響機體的氧化還原電位（ORP）及相關抗氧化指標（尹守錚，2010;王俊等，2016）。ORP表征機體中氧化還原狀態(tài)的相對強弱（向交等，2014），其在機體中過高或過低，都會導致應激及相關代謝的啟動進而加快衰老（廖鵬等，2006）。

目前，國內(nèi)外對ORP的研究較多地關注水體、土壤及發(fā)酵工業(yè)的環(huán)境監(jiān)測等領域，關于果實采后ORP變化與其成熟軟化的關系還未見報道。本研究通過研究柿果實采后貯藏過程中氧化還原電位、乙烯生物合成量、抗氧化酶以及細胞壁降解酶之間的關系，探討氧化還原電位在其后熟軟化中的作用，為果實采后保鮮技術提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和處理

供試品種為‘恭城月柿。2016年10月29日在廣西桂林市恭城縣采摘果實，采摘后當日運回廣西大學園藝系實驗室。挑選大小一致（180 ～ 200 g）、色澤均勻、成熟度一致、無病蟲害且無機械損傷的果實，貯藏于冷庫中用于試驗，溫度為25 ℃（變幅控制在1 ℃以內(nèi)），相對濕度為60%～70%。試驗貯藏時間為2016年10月29日至11月13日。

試驗共設兩個處理，每個處理用果量為350個。乙烯利處理，即先用1 000 mg·L-1的乙烯利溶液浸泡柿果實5 min后于陰涼處通風晾干果實表面的水分，然后于密封袋（80 cm × 80 cm）中密封處理24 h后置于冷庫中進行貯藏;去離子水處理為對照。每3 d對果實相關指標進行測定，并切取赤道部果肉，液氮速凍后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 測定指標與方法

1.2.1 硬度和總色差的測定 硬度的測定參照Wang et al（2010）的方法，每個處理隨機選取12個果實，在果實赤道部相反方向的兩面削去小塊果皮后，用質構儀TA.XT.plus（英國，Stable Micro Systems公司）進行穿刺，穿刺探頭為C002ST（直徑5 mm圓柱形探頭），深度為10 mm ，速度為1.5 mm·s-1。每個處理每次測定均進行3次生物學重復，每個重復4個果。

總色差的測定參照范靈姣等（2017）的方法，每個處理隨機選取9個果，用GR-10色差計（日本，KONICA MINOLTA公司）對果實赤道部隨機進行一次測定，每個處理每次測定均進行3次生物學重復，每個重復3個果。

1.2.2 氧化還原電位的測定 ORP測定參照Chen et al（2005）的方法并做部分改良。每個處理隨機選取12個果，每個果取赤道部果肉10 g制作切片（=12 mm，δ=5 mm），置于150 mL的磷酸緩沖液（0.1 mol·L-1，pH7.0）中30 min，濾紙過濾后，用經(jīng)醌氫醌飽和溶液標定后的金屬鉑電極600s-ORP（美國，JENCO公司）進行測定，時間為2 min。每個處理每次測定均進行3次生物學重復，每個重復4個果。

1.2.3 乙烯生物合成量的測定 每個處理隨機選取5個果實置于4 L密封容器中，25 ℃環(huán)境下密封6 h，用注射器采集5管（每管5 mL）頂空氣體，采用氣相色譜儀GC-17A（日本，Shimadzu公司）進行測定，GC條件為色譜柱：固定相為Porapak Q的不銹鋼填充柱[2 m × 3 mm（od）];檢測器：氫火焰離子化檢測器（FID）;氣體為載氣：N2（流速50 mL·min-1），燃氣：H2（30 mL·min-1），助燃氣：空氣（300 mL·min-1）;檢測溫度為檢測器：200 ℃，進樣口：110 ℃，色譜柱：90 ℃;微量注射器手動進樣（美國，Hamilton公司），進樣量為1 000 μL。

1.2.4 酶液制備及酶活性測定 過氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）酶液的制備參照Aebi（1984）和Chance & Meahly（1995）的方法略加改進，取果肉 3.0 g，液氮研磨，加入 5.0 mL提取緩沖液（0.1 mol·L-1磷酸緩沖液，pH7.8;5 mmol·L-1 DTT;5% PVP）搖勻，4 ℃離心30 min，取上清液用于酶活性的測定。酶活性的測定采用比色法，SOD參照Li et al（2016）的方法進行，CAT和POD參照Khademi et al（2014）的方法進行。

多聚半乳糖醛酸酶（PG）、纖維素酶（Cx）、β-D-半乳糖苷酶（β-D-Gal）酶液的制備參照Andrews & Li（1995）和 Zhou et al（1999）的方法略加改進。取果肉3.0 g，液氮研磨，加 6.0 mL 0.2 % 硫酸鈉溶液搖勻，4 ℃離心15 min，棄上清液加入 6 mL 100 mmol·L-1的醋酸鈉緩沖液（內(nèi)含 100 mmol·L-1NaAc，1%（V/V）巰基乙醇，1.5% PVP（K-30），pH 5.2，置冰槽中搖勻，4 ℃離心30 min，上清液用于酶活性測定。PG活性測定按照Jiang et al（2010）的方法，Cx活性測定采用3，5-二硝基水楊酸法（Opiyol & Ying，2010），β-D-Gal活性測定按照Itamura et al（2013）的方法。以上生理指標的測定，每個處理每次測定均進行3次生物學重復，每個重復4個果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010（美國，Microsoft公司）和SPSS 17.0軟件（中國，IBM SPSS公司）進行數(shù)據(jù)的作圖、分析和統(tǒng)計，采用最小顯著差異法（LSD）進行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 柿果實貯藏期間硬度和總色差的變化

采后果實硬度和顏色變化直觀反映其成熟的變化狀態(tài)。圖1：A顯示，貯藏期果實的硬度整體呈下降趨勢，乙烯利處理組果實從采后3 d即急速下降，由起始的13.2 N降低至9.96 N，至貯藏末期始終顯著低于對照，對照果實軟化進程緩慢。圖1：B顯示，果實總色差值ΔE貯藏期間呈上升趨勢，乙烯利處理組果實的ΔE值貯藏前14 d變化較小，果實轉色比較緩慢，采后15 d，ΔE值快速升高至29.6，轉色完全，顯著高于對照（11.9）。由此可見，乙烯利處理加快了果實軟化和轉色，促進了果實的后熟。

2.2 柿果實貯藏期間氧化還原電位和乙烯生物合成量的變化

ORP表征果實的氧化還原狀態(tài)如圖2：A所示，貯藏期果實的ORP在前14 d穩(wěn)定在7.6 mv·g-1，采后15 d，乙烯利處理組果實ORP快速升高至11.9 mv·g-1，顯著高于對照的8.7 mv·g-1。乙烯是五大植物激素之一，能夠加快果實的成熟。從圖2：B可以看出，貯藏期乙烯利處理組果實的乙烯生物合成量始終高于對照組，采后15 d，乙烯生成量急劇增加至0.372 μL·kg-1·h-1的高峰，對照乙烯生成量則維持在0.033 μL·kg-1·h-1。貯藏期果實的ORP與乙烯生物合成量呈極顯著正相關（表1），這表明果實乙烯生成量增加與ORP上升關系密切。

2.3 柿果實貯藏期間抗氧化酶的變化

SOD、CAT、POD是活性氧代謝系統(tǒng)中的重要酶系統(tǒng)，可以清除果實內(nèi)活性氧從而延緩其成熟衰老。從圖3可以看出，乙烯利處理果實的抗氧化酶活性整體高于對照。貯藏期果實SOD活性整體呈下降趨勢，采后15 d，乙烯利處理組果實的SOD活性從起始的5.25 U·min-1·g-1降低至4.6 U·min-1·g-1，高于對照的3.56 U·min-1·g-1。圖3：B-C顯示，乙烯利處理組果實的CAT活性在貯藏前9 d變化較小，采后9～15 d，CAT活性有一個急劇上升-下降的變化趨勢，其中在第14天達到最大值347.47 U·min-1·g-1，對照組CAT活性穩(wěn)定在7.9 U·min-1·g-1。更有意思的是貯藏前14 d，果實的POD活性在0.035 U·min-1·g-1以下且無明顯變化，采后15 d，乙烯利處理組果實的POD活性急速上升至0.504 U·min-1·g-1，顯著高于對照0.005 U·min-1·g-1。貯藏期間，柿果實SOD和CAT活性與ORP、乙烯生成量、硬度和總色差的相關性不顯著，但POD活性與ORP、乙烯生成量和色差呈極顯著正相關，與果實硬度呈顯著負相關（表1），說明整個貯藏期，POD活性的升高與ORP升高、乙烯生物合成量增加以及果實的成熟軟化關系密切。

2.4 柿果實貯藏期間細胞壁降解酶的變化

PG、Cx和 β-D-Gal是促進細胞壁組分水解，調(diào)控果實成熟軟化的關鍵酶。圖4：A-B顯示，貯藏期PG活性整體呈先上升后下降的變化趨勢，乙烯利處理組果實的PG活性始終稍高于對照組，乙烯利處理組果實的Cx活性與對照果實無明顯差異。從圖4：C可以看出，貯藏期果實的 β-D-Gal活性整體呈上升趨勢，乙烯利處理組果實的 β-D-Gal活性在貯藏前14 d變化較小，采后15 d，β-D-Gal活性急速上升至最大值60.64 μmol·min-1·g-1，至貯藏末期始終顯著高于對照。貯藏期果實的PG和 β-D-Gal活性與硬度呈顯著負相關，β-D-Gal活性與ORP、乙烯生物合成量和總色差呈極顯著正相關（表1），由此可見，β-D-Gal活性的升高與ORP升高、乙烯生物合成量增加以及果實的成熟軟化關系密切。

3 討論與結論

植物激素乙烯被證實是促進調(diào)控果實成熟軟化和衰老的重要因子，人工合成乙烯利遇水釋放乙烯氣體，廣泛用于躍變型果實的人工催熟，如香蕉（郭斐，2016）、菠蘿蜜（王俊寧等，2014）、番茄（徐愛東，2011）、櫻桃（Khorshidi & Davarynejad，2010）、梨（Choi et al，2013）、無花果（李春麗和沈元月，2016）等水果。本研究發(fā)現(xiàn)，乙烯利處理顯著促進果實硬度下降和總色差升高，催熟作用明顯，同時乙烯利處理果實的乙烯生成量急劇增加。貯藏期，乙烯生成量與果實硬度呈顯著負相關，與總色差呈極顯著正相關。驗證了乙烯是調(diào)控柿果實成熟軟化的關鍵因素。

氧化還原電位（ORP）代表機體氧化還原狀態(tài)的相對強弱（向交等，2014），表征氧化還原反應的自由能和反應的方向（Gibbs，1873）。氧化還原反應由兩個半反應組成，即氧化半反應和還原半反應，每個半反應都有其對應的電位（Boyer，2002）。在生命體中，呼吸作用及各種代謝途徑都離不開氧化還原反應，它不僅為生物提供能量，還決定生命體的衰老和死亡（董亮等，2013）。而果實乙烯合成過程中，ACC與O2由ACC氧化酶（ACO）生成乙烯（C2H4）本質上是一個氧化還原反應，電子傳遞和氧化還原狀態(tài)的不斷變化影響其反應的進行方向。本研究中，柿果實ORP在貯藏前14 d相

對穩(wěn)定，采后15 d，乙烯利處理組ORP快速上升顯著高于對照，同時伴隨乙烯的大量生成，果實ORP與乙烯生成量呈極顯著正相關。這表明柿果實貯藏期，乙烯合成與ORP穩(wěn)定狀態(tài)之間關系密切，ORP可能作為開關調(diào)控ACC生成乙烯這一生物化學反應，即打破ORP的穩(wěn)定狀態(tài)引發(fā)乙烯合成的啟動，進而加快果實后熟。

細胞內(nèi)存在著一套完整的氧化系統(tǒng)和還原系統(tǒng)。正常情況下，二者處于有機平衡，細胞功能正常。一旦二者失衡，就會導致應激反應，進而加快衰老（Gerontol，1956）。植物在正常的代謝活動中會產(chǎn)生超氧陰離子（O-2·）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（·OH）等活性氧（ROS）（Li et al，2016），ROS是打破細胞內(nèi)氧化系統(tǒng)與還原系統(tǒng)之間動態(tài)平衡的主要因素。而SOD、CAT、POD是生物體內(nèi)活性氧防御系統(tǒng)的重要酶系統(tǒng)，可以清除組織中ROS，減少ROS積累對細胞造成的傷害，從而延緩衰老（王成濤等，2011）。本研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化酶中SOD活性在整個貯藏期維持較高水平無顯著變化，而CAT和POD活性在貯藏前期活性維持在較低水平，且POD活性與ORP呈極顯著正相關。這表明，SOD對果實內(nèi)ROS的清除作用貫穿整個貯藏期，對維持細胞內(nèi)氧化還原動態(tài)平衡起重要作用。而CAT和POD對ROS的清除作用，可能在H2O2積累到一定水平后才啟動，且CAT作用時間早于POD。SOD、CAT、POD的協(xié)同作用通過維持ORP相對穩(wěn)定，達到延緩果實快速衰老軟化的目的。同時，POD活性上升與ORP穩(wěn)定狀態(tài)密切相關，果實內(nèi)ORP穩(wěn)定狀態(tài)打破可能是誘導POD活性快速上升的主要原因。

細胞壁降解是導致果實軟化的直接原因。一系列細胞壁降解酶（PG、Cx、β-D-Gal等）的相互作用，使得細胞中膠層結構發(fā)生改變，細胞壁物質降解，細胞壁整體結構最終被破壞（Huber，1983）。PG和Cx促進果實軟化的作用在藍果忍冬（趙麗娟，2016）、西瓜（劉景安等，2013）、蘋果（劉超超等，2011）等果實中已經(jīng)得到證實。齊秀東等（2015）發(fā)現(xiàn)，不耐貯藏的‘京白梨果實中，β-D-Gal相比PG和Cx與其成熟軟化存在著更為密切的關系。這一結果在草莓（薛炳燁等，2006）、桃（闞娟等，2012）和番茄（Gross & Wallner，1979）等果實中也有過類似報道。本研究中，β-D-Gal活性與硬度呈極顯著負相關，與乙烯生成量、總色差呈極顯著正相關，其與乙烯生成量、硬度和總色差的相關度遠大于PG和Cx，這與齊秀東等（2015）在梨果實中研究的結果相一致。同時，β-D-Gal活性與ORP呈極顯著正相關，表明貯藏期，β-D-Gal活性受ORP變化的影響，ORP上升誘導其活性的增加，從而促進細胞壁降解，加快果實軟化進程。

綜上所述，氧化還原電位在柿果實后熟軟化過程中起關鍵作用。外源乙烯通過打破果實內(nèi)氧化還原電位的穩(wěn)定狀態(tài)，引發(fā)自身乙烯合成的啟動，促進內(nèi)源乙烯大量生成，誘導抗氧化酶POD和細胞壁降解酶β-D-Gal活性增強，從而加快貯藏期果實的后熟衰老進程。