何為中 范業(yè)賡 劉麗敏 劉紅堅(jiān) 余坤興 翁夢(mèng)苓

摘 要：為了簡(jiǎn)化甘蔗組織培養(yǎng)流程，降低生產(chǎn)成本，該文以甘蔗品種GT44和B9無(wú)根試管苗為材料，先經(jīng)葉片噴施植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理，然后煉苗24 h，接著把處理后的試驗(yàn)苗移植于沙土混合栽培基質(zhì)中，研究其在日光溫室條件下完成不定根的形成和生長(zhǎng)過(guò)程;同時(shí)比較了無(wú)根試管苗和有根試管苗的移栽存活率和生長(zhǎng)情況。試管苗生根率調(diào)查時(shí)間為試管苗移植后第3天開(kāi)始至第10天結(jié)束，成活率的調(diào)查時(shí)間為試管苗移植后的第30天。結(jié)果表明：經(jīng)吲哚丁酸（IBA）和ABT2號(hào)生根粉處理的無(wú)根試管苗的移栽成活率分別為96.3%和97.7%，接近傳統(tǒng)生根試管苗的移栽成活率，且其單株試管苗生根成本為傳統(tǒng)生根方法的1/28。甘蔗品種GT44和B9試管苗首次出現(xiàn)可見(jiàn)根的時(shí)間均發(fā)生在試管苗移栽后的第4天。試管苗根的再生可以在有菌的沙土基質(zhì)栽培和日光溫室條件下完成，而不需要在無(wú)菌的MS生根培養(yǎng)基和培養(yǎng)室中進(jìn)行生根;基因型和試管苗素質(zhì)是影響甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根的關(guān)鍵因素;甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根技術(shù)比傳統(tǒng)試管苗培養(yǎng)基生根技術(shù)擁有更多優(yōu)勢(shì)，且操作簡(jiǎn)單、程序簡(jiǎn)化、生根率和成活率高、省工、節(jié)省能源和生產(chǎn)成本、效率高，替代傳統(tǒng)的試管苗生根技術(shù)，應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：甘蔗試管苗，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，葉片導(dǎo)入，沙土基質(zhì)，光合自養(yǎng)生根

中圖分類號(hào)：Q945

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2018）10-1298-12

Abstract：The purpose of the study on photoautotrophic rooting of sugarcane microshoots was to simplify the process of sugarcane tissue culture and reduce the production cost. In this experiment，the sugarcane variety GT 44 and B9 rootless microshoots，were used as test materials. The microshoots were first treated with leaves and sprayed with plant growth regulator and then hardened for 24 hours. Then the treated microshoots were transplanted into mixture of soil and sand，the adventitious root formation and growth process were completed under sunlight greenhouse conditions. Meanwhile，the survival rate and growth of rootless and rooted microshoots were compared during transplanting in the green house. The rooting rate of microshoots was measured from the third day after microshoots transplantation to the end of the tenth day. The investigation of survival rate was on the 30th day after microshoots transplantation. The results showed that the survival rate of rootless microshoots treated with indole butyric acid（IBA） and ABT2 rooting powder was to 96.3% and 97.7%，respectively，which was close to the survival rate of traditional rooting microshoots. The rooting cost of microshoots by the developed root technique was only 1/28 of that by the traditional rooting method. The first visible roots of sugarcane variety GT44 and B9 were appeared on the fourth day after transplanting of the microshoots. The regeneration of microshoot roots could be done in the sandy soil substrate and solar greenhouse instead of? rooting in sterile MS rooting medium and culture room. The genotype and the quality of microshoots were the factors that affect photosynthetic autotrophic root of the key factors. The photoautorophic rooting of microshoots present more advantages over the traditional rooting technique such as simple operation，simplified protocol，the high rooting rate and survival rate，labor saving，energy saving and lower production costs and high efficiency，and it can replace the traditional root technology for commercial production.

Key words：sugarcane microshoots，plant growth regulator，leaf introduction，soil-sand substrate，photoautotrophic rooting

甘蔗組織培養(yǎng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于甘蔗新品種快速繁殖、脫毒健康種苗生產(chǎn)和轉(zhuǎn)基因甘蔗研究等方面，目前該項(xiàng)技術(shù)已在國(guó)內(nèi)外甘蔗生產(chǎn)區(qū)廣泛使用。傳統(tǒng)的植物組織培養(yǎng)技術(shù)包括四個(gè)階段，即初代培養(yǎng)（培養(yǎng)物建立）、繼代增殖、生根培養(yǎng)和移栽苗圃。前面三個(gè)階段都在無(wú)菌的、人工控制環(huán)境的室內(nèi)進(jìn)行，且操作步驟繁瑣、人工需求量大、成本高，導(dǎo)致植物試管苗生產(chǎn)成本居高不下。以生產(chǎn)甘蔗健康種苗為例，目前甘蔗健康種苗的售價(jià)一般每株為0.6～1.0元，以每畝種植1 800～2 000株計(jì)算，每畝種苗成本為1 080～2 000元，為使用種莖種植成本的4.5～8.33倍，蔗農(nóng)生產(chǎn)成本高，且無(wú)利可圖，難以接受，從而制約了甘蔗試管苗的普及種植。試管苗瓶外生根技術(shù)是近年研究成功的一項(xiàng)先進(jìn)的組培生根技術(shù)，是植物試管苗簡(jiǎn)化生產(chǎn)技術(shù)的重要組成部分。該技術(shù)的主要特征是將植物組織培養(yǎng)過(guò)程中的組培繼代增殖苗進(jìn)行處理后在溫室自養(yǎng)條件下直接進(jìn)行自養(yǎng)生根，它的主要特點(diǎn)是將試管苗生根階段中的生根和馴化結(jié)合起來(lái)，使傳統(tǒng)的培養(yǎng)室條件下的異養(yǎng)生根轉(zhuǎn)變?yōu)闇厥覘l件下的自養(yǎng)生根，省去了復(fù)雜的、成本極高的試管苗瓶?jī)?nèi)生根傳統(tǒng)程序。該技術(shù)的應(yīng)用不僅減少了一次無(wú)菌操作步驟，節(jié)約了培養(yǎng)室空間，又簡(jiǎn)化了健康種苗生產(chǎn)程序，降低了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率（Kim et al，1998;徐振華等，2002;Almeida et al，2005;黃卓忠等，2007;付艷華等，2009;劉敏等，2010;嚴(yán)華兵等，2010;何為中等，2011）。試管苗瓶外生根可使試管苗的生產(chǎn)成本降低35%～75%（徐振華等，2002;吳國(guó)智等，2010）。

甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根技術(shù)是本課題組在甘蔗試管苗瓶外生根技術(shù)基礎(chǔ)研制而來(lái)，它是將無(wú)根增殖試管苗噴施植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑后，在日光溫室環(huán)境下先煉苗24～48 h，然后按常規(guī)方法種植于普通日光溫室進(jìn)行光合自養(yǎng)生根。本研究采用該項(xiàng)技術(shù)后，甘蔗組織培養(yǎng)技術(shù)由傳統(tǒng)的四個(gè)步驟簡(jiǎn)化為三個(gè)步驟，即初代培養(yǎng)（培養(yǎng)物建立）、繼代增殖和移栽苗圃生根生長(zhǎng)。這樣省去了培養(yǎng)室內(nèi)生根這一環(huán)節(jié)，簡(jiǎn)化了甘蔗試管苗生產(chǎn)程序，降低生產(chǎn)成本在50%以上，對(duì)促進(jìn)甘蔗健康種苗大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用有積極作用。

1 材料與方法

所用甘蔗品種GT44和B9試管苗由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所提供，是通過(guò)培養(yǎng)基MS + 6-BA + NAA連續(xù)多次繼代培養(yǎng)而成。試驗(yàn)處理開(kāi)始第一步是對(duì)完成繼代培養(yǎng)的試管苗葉片噴施植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（ABT2號(hào)生根粉或者IBA），植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度及處理方法采用劉紅堅(jiān)和何為中（2015）、何為中（2015）報(bào)道的專利技術(shù)方法，接著在日光溫室煉苗24 h，煉苗過(guò)程中溫室環(huán)境變化不受人工控制，濕度變化范圍為60%～70%，溫度范圍為20～40℃ 和光照強(qiáng)度范圍為2 000～4 000 lx 。處理好的試管苗經(jīng)清水清洗后，將試管苗浸沒(méi)于消毒液中10 min，消毒液為500倍（v/v）亮盾[先正達(dá)（中國(guó)）公司產(chǎn)品]溶液或0.6%的高錳酸鉀溶液。消毒期間可翻動(dòng)試管苗1～2次，隨后將試管苗種植于日光溫室大棚，栽培基質(zhì)為新鮮河沙與充分風(fēng)化黃泥的混合物，混合比例為1∶1（v/v），生根過(guò)程中溫室環(huán)境變化不受人工控制，濕度變化范圍為70%～100%，溫度范圍為20～40 ℃ 和光照強(qiáng)度范圍為2 000 ～15 000 lx，以散射光為主。

1.1 存活率比較試驗(yàn)

光合自養(yǎng)生根技術(shù)和傳統(tǒng)生根試管苗溫室移栽存活率比較試驗(yàn)所用試管苗為甘蔗品種B9試管苗，設(shè)計(jì)2個(gè)處理，即分別用ABT 2號(hào)生根粉（北京艾比蒂生物科技有限公司產(chǎn)品）溶液（200 mg·L-1）和IBA 200 mg·L-1 + 6-BA 10 mg·L-1 混合物溶液噴施繼代無(wú)根試管苗，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度及處理采用劉紅堅(jiān)和何為中（2015）、何為中（2015）的專利技術(shù)方法，日光溫室煉苗24 h; 對(duì)照為生根試管苗，繼代試管苗在生根培養(yǎng)基MS + NAA 10 mg·L-1 +蔗糖 50 g·L-1 上于培養(yǎng)室培養(yǎng)15 d。無(wú)根和生根試管苗同時(shí)移栽于沙土栽培基質(zhì)中，種植盆規(guī)格為6孔×9孔 。無(wú)根試管苗種植后一段時(shí)間內(nèi)調(diào)查生根率和存活率。

試管苗存活率于移栽后30 d調(diào)查，處理和對(duì)照每個(gè)重復(fù)為一個(gè)種植盆，即6孔×9孔，重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)存活植株穴數(shù)量，即每穴有1株以上存活植株計(jì)入存活統(tǒng)計(jì)。生根率調(diào)查從移栽后4 d開(kāi)始至移栽后10 d止，每個(gè)品種每次取樣10穴，調(diào)查不可分割個(gè)體數(shù)量總數(shù)和生根個(gè)體數(shù)量。用微軟Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，試管苗存活率和生根率按以下公式計(jì)算：

存活率=存活植株穴數(shù)量調(diào)查植株穴數(shù)量×100%;

生根率=生根植株數(shù)量調(diào)查植株數(shù)量×100%。

1.2 單株試管苗生根成本比較試驗(yàn)

選擇生長(zhǎng)基本一致、每瓶苗數(shù)量大致相等（目測(cè)）的GT44增殖繼代試管苗作為材料，其中99瓶按照傳統(tǒng)方法進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)15 d后練苗，并種植于日光溫室;另120瓶進(jìn)入光合自養(yǎng)技術(shù)生根流程，即繼代試管苗在日光溫室內(nèi)開(kāi)瓶蓋，并噴施生根誘導(dǎo)溶液，成份為ABT 2號(hào)生根粉200 mg·L-1+D脯氨酸60 mg·L-1+吐溫0.2%，煉苗24 h，清洗消毒后移栽于日光溫室大棚中生根。試管苗種植基質(zhì)均為沙土混合物，混合比例為1∶1（v/v）;移栽30 d后統(tǒng)計(jì)存活植株數(shù)量，有1片以上（含1片）完全展開(kāi)葉片的植株計(jì)入存活植株數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 生根試管苗與無(wú)根試管苗移栽存活率比較

表1結(jié)果顯示，兩個(gè)處理試管苗的存活率都很高（96%以上），噴施IBA+6-BA處理的存活率達(dá)到97.7%，與有根試管苗的移栽存活率無(wú)顯著差異（P> 0.05）。在傳統(tǒng)的甘蔗試管苗生產(chǎn)工藝中，甘蔗試管苗都是先經(jīng)培養(yǎng)室生根培養(yǎng)誘導(dǎo)試管苗生根，然后再將生根試管苗移栽苗圃馴化;但甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根技術(shù)可使無(wú)根試管苗在普通日光溫室移栽條件下誘導(dǎo)生根，無(wú)需配制生根培養(yǎng)基和創(chuàng)造無(wú)菌培養(yǎng)條件，存活率與有根試管苗的移栽存活率接近。

2.2 甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根過(guò)程生根率變化

GT44和B9甘蔗試管苗移栽日光溫室后第3天調(diào)查沒(méi)有發(fā)現(xiàn)試管苗出現(xiàn)可見(jiàn)根，第4天后即可觀察到可見(jiàn)根出現(xiàn)，生根率為30%～40%，至第8天后兩個(gè)品種生根率接近100%。觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)第一次出現(xiàn)可見(jiàn)根的時(shí)間品種間是有差異的，如GT49首先出現(xiàn)可見(jiàn)根的時(shí)間為移栽后第9天，生根率接近20%;直到第20天生根率才達(dá)到100%，雖然GT44、B9和GT49生根快慢不同，但地上部分葉片轉(zhuǎn)青和新葉生長(zhǎng)是同步，未發(fā)現(xiàn)肉眼觀察到的差異。

2.3 甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根技術(shù)與傳統(tǒng)的試管苗生根技術(shù)比較

2.3.1 采用甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根技術(shù)簡(jiǎn)化了試管苗生產(chǎn)流程 傳統(tǒng)的甘蔗試管苗生產(chǎn)工藝流程由培養(yǎng)物建立、繼代增殖、生根培養(yǎng)和苗圃馴化移栽等四個(gè)步驟組成，其中前三個(gè)步驟無(wú)菌培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行，所有流程均要求無(wú)菌操作，苗圃馴化移栽在日光溫室中進(jìn)行。采用甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根技術(shù)后，新的甘蔗試管苗生產(chǎn)工藝流程由三個(gè)步驟組成（圖2），比傳統(tǒng)的試管苗生產(chǎn)流程更簡(jiǎn)化。在傳統(tǒng)的甘蔗試管苗生產(chǎn)工藝流程中，試管苗增殖繼代和生根培養(yǎng)過(guò)程都在室內(nèi)完成，都要求無(wú)菌操作，兩個(gè)步驟競(jìng)爭(zhēng)培養(yǎng)室和組織培養(yǎng)室內(nèi)設(shè)施設(shè)備，因此試管苗增殖繼代和生根培養(yǎng)工作有沖突，不可同時(shí)進(jìn)行，制約了試管苗的增殖繼代數(shù)量，從而影響試管苗生產(chǎn)數(shù)量;而在簡(jiǎn)化了的甘蔗試管苗生產(chǎn)工藝流程中，增殖繼代培養(yǎng)和試管苗生根分別在培養(yǎng)室和日光溫室中進(jìn)行，增殖繼代培養(yǎng)在封閉和無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行，而試管苗生根在開(kāi)放的、有菌的日光溫室中進(jìn)行，增殖繼代培養(yǎng)和試管苗生根工作不會(huì)產(chǎn)生沖突，可同時(shí)進(jìn)行，組織培養(yǎng)室內(nèi)設(shè)施設(shè)備可全部用于甘蔗試管苗繼代增殖，這一改變可大幅度增加試管苗繼代次數(shù)和產(chǎn)量，理論上，甘蔗試管苗繼代增殖工作不會(huì)被試管苗生根流程所打斷，試管苗增殖繼代時(shí)間大幅度延長(zhǎng)，在不增加組織培養(yǎng)室和室內(nèi)設(shè)施設(shè)備建設(shè)投入的情況下，試管苗生產(chǎn)量將會(huì)按增殖系數(shù)的幾何級(jí)數(shù)增加。

2.3.2 甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根技術(shù)流程比傳統(tǒng)的試管苗生根流程更簡(jiǎn)化 在傳統(tǒng)的甘蔗試管苗生根流程里，試管苗生根培養(yǎng)和操作流程都是在實(shí)驗(yàn)室或無(wú)菌培養(yǎng)室內(nèi)完成，試管苗是放在盛有根培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中進(jìn)行生根，生根環(huán)境特點(diǎn)是環(huán)境密閉，透氣性差;光照強(qiáng)度弱（<2 000 lx），恒溫（30 ℃）和高濕度（達(dá)到100%）。而甘蔗試管苗光合自養(yǎng)技術(shù)操作步驟及環(huán)境與傳統(tǒng)試管苗生根技術(shù)完全不同（圖3），甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根技術(shù)操作步驟少，簡(jiǎn)單;操作環(huán)境為普通日光溫室大棚，有菌開(kāi)放，透氣性好;光照強(qiáng)度高（>2 000 lx），溫度波動(dòng)幅度大和濕度波動(dòng)幅度處于70%～100%之間;生長(zhǎng)素通過(guò)噴施葉片導(dǎo)入試管苗，生根基質(zhì)為新鮮河沙與黃泥或充分氧化田園土的混合物，試管苗在生根期間內(nèi)并不一直浸泡培養(yǎng)基和生長(zhǎng)素溶液中。

2.3.3 甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根技術(shù)與傳統(tǒng)生根技術(shù)成本比較 按圖3所示兩種試管苗生根技術(shù)工藝流程，分別選取99瓶GT44試管苗進(jìn)行傳統(tǒng)的異養(yǎng)培養(yǎng)生根和120瓶試管苗進(jìn)行光合自養(yǎng)生根，移栽苗圃后統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2，并以表2平均每瓶存活植株數(shù)量和平均每孔存活植株數(shù)的計(jì)算結(jié)果為基礎(chǔ)分別計(jì)算了甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根方法和傳統(tǒng)試管苗生根方法的單株試管苗成本，它們分別是每株0.002 85元和每株0.081 1元，甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根方法的單株試管苗生根成本為傳統(tǒng)生根方法的1/28（表3）。如果采用甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根技術(shù)，甘蔗試管苗單株成本每株可降低0.083 95元。由于試管苗細(xì)小，又是叢生，數(shù)量統(tǒng)計(jì)難度，目測(cè)法選取試驗(yàn)材料有一定的誤差，傳統(tǒng)生根方法選取99瓶試管苗種植了511孔，而光合自養(yǎng)生根方法120瓶，只種植了459孔，誤差也有可能是叢栽種植時(shí)分苗不均勻所致，雖然有這樣的誤差存在，但試驗(yàn)結(jié)果還是能充分說(shuō)明甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根方法的單株試管苗生產(chǎn)成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的試管苗生根方法的單株成本。

2.3.4 甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根方法與傳統(tǒng)試管苗異養(yǎng)培養(yǎng)生根方法比較 通過(guò)對(duì)甘蔗試管苗葉片噴施外源生長(zhǎng)素和煉苗24 h，使外源生長(zhǎng)素對(duì)試管苗產(chǎn)生持續(xù)生根誘導(dǎo)效果，啟動(dòng)試管苗不定根發(fā)育進(jìn)程，在有菌的沙土栽培條件和一定光照、溫度和濕度條件下完成不定根根原基發(fā)育和伸長(zhǎng)，試管苗和根的生長(zhǎng)質(zhì)量均高于傳統(tǒng)的無(wú)菌培養(yǎng)生根方法，苗圃移栽存活率在96%以上，與有根試管苗的移栽存活率無(wú)顯著差異。甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根技術(shù)是一項(xiàng)新型的試管苗生根技術(shù)，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)基異養(yǎng)生根技術(shù)比（表4），具有顯著優(yōu)勢(shì)，該技術(shù)操作簡(jiǎn)單、簡(jiǎn)化試管苗生產(chǎn)流程、投入大幅度減少和生產(chǎn)效率高，可完全替代傳統(tǒng)試管苗生根技術(shù)。

3 討論

3.1 外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理方法與不定根的發(fā)生發(fā)育

本研究的獨(dú)特之處是將外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑溶液噴施甘蔗試管苗葉片和植株，然后在日光溫室內(nèi)煉苗24 h，接著種植日光溫室內(nèi)在光照和植物激素的共同作用下誘導(dǎo)不定根發(fā)生、根原基形成和伸長(zhǎng)并突破表皮，而傳統(tǒng)的植物試管苗生根方法是將外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑預(yù)先加入到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)消毒滅菌后，再接種試管苗于培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根;或者將植物試管苗先在一定濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（無(wú)菌）中浸泡或培養(yǎng)一段時(shí)間，然后轉(zhuǎn)入無(wú)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)（鞏振輝和申書(shū)興，2007;邱運(yùn)亮等，2010）。在植物試管苗瓶外生根試驗(yàn)研究方面，一般采用植物苗基部浸泡或速蘸生長(zhǎng)素溶液（林艷等，1998; 黃卓忠生等，2007;王雪嬌等，2017），他們報(bào)道的植物試管苗瓶外生根的最好生根率分別為切花月季試管苗72%、羅漢果試管苗96.11%和藍(lán)梅試管苗75%。目前甘蔗試管苗光合自養(yǎng)技術(shù)獲得最好的試管苗生根率為100%。外源生長(zhǎng)素（如IBA）處理促進(jìn)內(nèi)源IAA的積累（Gonacalves et al，2008;陳凌艷等，2011），而高濃度IAA是啟動(dòng)植物不定根發(fā)生發(fā)育的關(guān)鍵因素（Gaspar et al，1992; De Klerk，2002; Hou et al，2010）。林士杰等（2006）認(rèn)為在不定根發(fā)生過(guò)程中，外源激素NAA的作用可能通過(guò)改變各種內(nèi)源激素含量變化，從而使其達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡來(lái)間接誘導(dǎo)不定根的發(fā)生和分化。在甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根試驗(yàn)中，葉片噴施ABT2號(hào)生根粉處理比不噴施的對(duì)照提前5 d出現(xiàn)第一批可見(jiàn)根，且根的數(shù)量多，這個(gè)結(jié)果也間接表明，外源生長(zhǎng)素處理試管苗葉片后，內(nèi)源生長(zhǎng)素和碳水化合物加速向葉鞘基部區(qū)域運(yùn)輸，從而啟動(dòng)和加速了不定根的發(fā)生發(fā)育進(jìn)程，而沒(méi)有噴施的對(duì)照只有等葉片光形態(tài)建成后，葉片光合作用和合成內(nèi)源生長(zhǎng)素功能恢復(fù)正常后，葉鞘基部區(qū)域才有可能富積內(nèi)源生長(zhǎng)素和碳水化合物，才可能啟動(dòng)生根進(jìn)程，因此根生長(zhǎng)速度慢于噴施處理。

De Klerk（2002）報(bào)道蘋(píng)果試管苗微扦插不定根發(fā)生發(fā)育過(guò)程劃分為三個(gè)階段：脫分化階段（0～24 h）、誘導(dǎo)階段（24～96 h）和分化階段（96 h后），在分化階段根原基形成、伸長(zhǎng)和突破表皮，在取得切段120 h后，根原基分生組織才形成，根突破表皮應(yīng)該是5 d以后。不同植物品種或基因型的不定根發(fā)生發(fā)育時(shí)間也是有差異的，Schwambach et al（2008）將藍(lán)桉樹(shù)（Eucalyptus globulus×maidennii）的微枝扦插生根分為三個(gè)階段，處理后0～5 d為誘導(dǎo)階段，5～15 d為根原基形成階段和15～45 d為根原基伸長(zhǎng)階段。本研究結(jié)果表明，GT44和B9第一批根出現(xiàn)時(shí)間是移栽后第4天或者處理后第5天，生根率達(dá)100%的時(shí)間是移栽9 d后，由于試管苗單株間生理狀態(tài)不一樣，不定根發(fā)生發(fā)育也有先后;另外品種不同不定根發(fā)生發(fā)育情況也不一樣，如GT49第一批根出現(xiàn)的時(shí)間是處理后第10天，生根率達(dá)100%的時(shí)間出現(xiàn)在處理后的第21天。

De Klerk（2002）研究結(jié)果表明根誘導(dǎo)到根原基形成前這個(gè)時(shí)期，生長(zhǎng)素起促進(jìn)作用，而根原基伸長(zhǎng)階段，生長(zhǎng)素起抑制作用;徐振華等（2002）報(bào)道大量研究結(jié)果表明，根原基的啟動(dòng)和形成階段生長(zhǎng)素起著關(guān)鍵作用，而根原基的伸長(zhǎng)和生長(zhǎng)則可以在沒(méi)有外源生長(zhǎng)素的條件下實(shí)現(xiàn)。甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根通過(guò)植株噴施外源生長(zhǎng)素啟動(dòng)不定根的發(fā)生發(fā)育，隨著不定根發(fā)育進(jìn)程的推進(jìn)，外源生長(zhǎng)素的效應(yīng)也會(huì)逐漸衰減直至消失，而培養(yǎng)基異養(yǎng)生根時(shí)，試管苗生根完成前一直浸泡在含有生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基里，不利于根原基伸長(zhǎng)和苗的生長(zhǎng)，因此，甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根技術(shù)是一種更符合不定根發(fā)生發(fā)育規(guī)律的生根方法。

3.2 試管苗質(zhì)量對(duì)甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根的影響

甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根過(guò)程是試管苗由異養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)渡到自養(yǎng)生長(zhǎng)的過(guò)程，同時(shí)也是生長(zhǎng)環(huán)境從無(wú)菌過(guò)渡到有菌環(huán)境的過(guò)程，生長(zhǎng)環(huán)境從恒溫、恒濕、光照強(qiáng)度恒定和弱光照的人工環(huán)境過(guò)渡到環(huán)境溫濕度和光照強(qiáng)度大幅度波動(dòng)及高光照強(qiáng)度環(huán)境過(guò)程，甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根過(guò)程中脅迫因素很多，包括環(huán)境脅迫、 生物脅迫、高濃度植物激素處理脅迫和營(yíng)養(yǎng)缺乏脅迫，因此只有高素質(zhì)試管苗才能抵抗各種脅迫而生存下來(lái)完成不定根的發(fā)生發(fā)育過(guò)程，甘蔗試管苗質(zhì)量包括植株高度4～6 cm，植株健壯和葉面積大、葉片青綠，特別是葉片質(zhì)量和葉面積大小特別重要，因?yàn)閲娛┩庠醇に刂饕ㄟ^(guò)葉片發(fā)揮作用，另外植株生根和生長(zhǎng)所需要的碳水化合物和內(nèi)源生長(zhǎng)素均來(lái)源于葉片。試管苗的植物學(xué)形態(tài)和生理狀態(tài)受基因型影響，不同甘蔗品種試管苗的株高、葉片形態(tài)特征、葉片太小和植株的生理生化特征差別大，抗逆性也不一樣，導(dǎo)致不同品種試管苗光合自養(yǎng)生根特征差異大，甘蔗品種桂糖44號(hào)和B9表現(xiàn)極易生根;桂糖32號(hào)和桂糖49號(hào)表現(xiàn)為易生根;而桂糖48號(hào)表現(xiàn)為難生根。徐振華等（2002）報(bào)道不同植物、不同基因型、不同幼化程度對(duì)不定根的發(fā)生發(fā)育有決定性的影響，并且認(rèn)為多次繼代、半木質(zhì)化、葉片肥厚、莖稈粗壯的無(wú)根試管苗是獲得較高生根率的保證。Thomas（2000）報(bào)道，葡萄砧木插條的葉面積、質(zhì)量和著生位置影響根的發(fā)生發(fā)育，帶小葉的插條在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上不定根出現(xiàn)遲，且根質(zhì)量差，莖生長(zhǎng)弱和芽早期萌發(fā);而帶大葉的插條相反，不定根發(fā)生早，根活力強(qiáng)。在甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根試驗(yàn)中，試管苗葉片多、大和青綠的容易生根，生根率高和存活率高，反之則難生根，生根率和存活率都低。王濤等（2007）報(bào)道香果樹(shù)試管苗瓶外生根試驗(yàn)中，試管苗莖越粗，苗越壯，其生根效果越好，莖粗>0.15 cm時(shí)生根率達(dá)到81.6%，平均單株生根6條，平均根長(zhǎng)達(dá)到5 cm。

3.3 環(huán)境因素對(duì)甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根的影響

3.3.1 光照 甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根過(guò)程中光照發(fā)揮了關(guān)鍵作用，光照強(qiáng)度一般控制在2 000～15 000 lx，長(zhǎng)期弱光照和長(zhǎng)期強(qiáng)光照不利于試管苗正常生長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致植株死亡率升高，最佳光照強(qiáng)度為5 000～8 000 lx，并且以散射光為好，因此要求溫室大棚四周?chē)芰媳∧け苊怅?yáng)光直接照射苗圃，遮陽(yáng)網(wǎng)只蓋天面，不蓋溫室四周，保證溫室苗圃有較強(qiáng)的散射光。林艷等（1998）認(rèn)為弱光及較強(qiáng)散射光對(duì)切花月季組培苗微插生根有利，生根過(guò)程應(yīng)盡量避免強(qiáng)光直射，尤其是在溫度較高的夏季更應(yīng)該注意。甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根過(guò)程是試管苗從異養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)渡到自養(yǎng)生長(zhǎng)的過(guò)程，期間涉及根的再生與生長(zhǎng)、葉片結(jié)構(gòu)和功能正?；约靶氯~和新芽的生長(zhǎng)，這些任務(wù)的完成都需要光照和光合作用條件的改善才能完成。潘瑞熾（2014）認(rèn)為單子葉植物葉片展開(kāi)和根原基啟動(dòng)是受光敏色素控制的。甘蔗試管苗葉片是恒溫、恒濕和異養(yǎng)的人工環(huán)境下生長(zhǎng)發(fā)育而成，其葉片與大田生長(zhǎng)植株葉片不一樣，表現(xiàn)異常，沒(méi)有功能氣孔、表皮發(fā)育不正常和光合效率低等，試管苗溫室移栽后，如果不采取遮光和保濕措施等，則試管苗根本不可能存活。植物試管苗移植到溫室后葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生一系列變化，以適應(yīng)外界環(huán)境條件，這些變化包括葉片厚度逐漸增加、葉肉細(xì)胞分化成柵欄組織和海綿組織、氣孔密度減小、氣孔形狀由圓形變成橢圓形等（Chandra et al，2010）。Rodriguez et al（2003）報(bào)道了甘蔗試管苗從培養(yǎng)室到溫室馴化期間的生理指標(biāo)變化結(jié)果，發(fā)現(xiàn)光合作用指標(biāo)在移栽溫室后逐步由異常過(guò)渡到正常，如光合作用最大值從室內(nèi)培養(yǎng)時(shí)的0.51 μmol CO2·m-2·s-1增加到馴化第14天的3.54 μmol CO2·m-2·s-1，而試管苗的蒸騰速率則由室內(nèi)培養(yǎng)時(shí)的0.97 mol H2O·m-2·s-1降低到馴化第14天的0.66 mol H2O·m-2·s-1，氣孔功能正常后，表皮水分損失下降;并且認(rèn)為只要環(huán)境條件滿足要求，試管苗是能夠?qū)崿F(xiàn)自養(yǎng)代謝的。目前植物組織培養(yǎng)流程中大部分植物種類都是采用培養(yǎng)基異養(yǎng)生根方法，生根環(huán)境特點(diǎn)為弱光照（光照強(qiáng)度≤2 000 lx）、MS培養(yǎng)基供應(yīng)養(yǎng)分和生長(zhǎng)環(huán)境密閉、通透性差，致使試管苗光合作用弱和葉片發(fā)育異常。如果植物試管苗移栽至日光溫室（光照強(qiáng)度：1 000～80 000 lx，波長(zhǎng)300～2 000 nm）后試管苗光合效率能大幅度提高和葉片通過(guò)光形態(tài)建成恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)和功能，試管苗獲得自養(yǎng)代謝能力，那么植物試管苗都可實(shí)現(xiàn)光合自養(yǎng)生根，到時(shí)植物試管苗光合自養(yǎng)生根技術(shù)則可替代傳統(tǒng)的異養(yǎng)生根技術(shù)，簡(jiǎn)化生根程序，降低生產(chǎn)成本，提高效率。

3.3.2 溫度 溫度是影響甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根的最重要的環(huán)境因素之一，最適宜生根溫度為28～30 ℃，平均氣溫低于20 ℃時(shí)，第一次出現(xiàn)根的時(shí)間延后到移栽后15 d，且存活率下降，溫度調(diào)節(jié)方式包括冬季蓋塑料薄膜增加溫度，增加光照，夏季蓋遮蔭網(wǎng)降低溫度和光照強(qiáng)度。果樹(shù)試管苗生根的溫度范圍一般在21～30 ℃，蘋(píng)果無(wú)根試管苗的最佳生根溫度為28 ℃，而在23 ℃和21 ℃生根率下降（李勝等，2003）。

3.3.3 濕度 濕度對(duì)甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根也有重要影響，但是可以控制，濕度太低，試管苗容易脫水死亡;濕度太高病原微生物滋生導(dǎo)致試管苗染病死亡，降低存活率，因此，一般溫室濕度控制在70%～100%，并在拱棚頂部開(kāi)小孔通風(fēng)透氣，且每隔5 d噴施土菌消溶液控制土傳病害發(fā)生和蔓延。另外，溫室苗圃排灌條件要好，既要保證水份供應(yīng)，又要避免積水導(dǎo)致試管苗死亡，存活率下降。

甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根技術(shù)是通過(guò)葉片噴施高濃度外源激素，誘導(dǎo)內(nèi)源生長(zhǎng)素合成，生長(zhǎng)素通過(guò)極性運(yùn)輸在試管苗葉鞘基部富集，高濃度內(nèi)源生長(zhǎng)素刺激啟動(dòng)試管苗不定根的發(fā)生，在有菌環(huán)境條件下完成細(xì)胞分裂、根原基的形成和伸長(zhǎng)過(guò)程;基因型和試管苗質(zhì)量是影響甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根的關(guān)鍵因素;甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根技術(shù)比傳統(tǒng)試管苗培養(yǎng)基生根技術(shù)擁有更多優(yōu)勢(shì)，并且操作簡(jiǎn)單、程序簡(jiǎn)化、生根率和成活率高、省工、節(jié)省能源、節(jié)省生產(chǎn)成本和效率高，能夠替代傳統(tǒng)的試管苗生根技術(shù)，應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)。