康雨芳,陳雪峰,常相娜,趙圓圓

(陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,陜西西安 710021)

疲勞是由于過度勞動或運動引起的機體生理生化功能改變而導(dǎo)致機體勞動或運動能力暫時降低的一種生理現(xiàn)象,它會引起注意力不集中、精神不振、抵抗力下降等一系列后果,嚴重影響日常工作和學(xué)習(xí),因此,研究能夠緩解或消除疲勞的物質(zhì)具有十分重要的意義[1]。

酵母胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)是酵母菌在生長代謝過程中分泌到細胞壁外的水溶性多糖,屬于次級代謝產(chǎn)物[2]。由于其具有包括抗氧化在內(nèi)的多種活性[3-5],且易于分離、可連續(xù)發(fā)酵,日益受到廣泛關(guān)注。而目前有研究表明,多糖具有抗疲勞活性,但大多局限于植物多糖和大型真菌多糖(如香菇和木耳),有關(guān)酵母胞外多糖抗疲勞的研究幾乎空白。本文通過負重游泳實驗以及體內(nèi)與疲勞相關(guān)指標的測定,研究膠紅酵母胞外多糖對小鼠的抗疲勞作用,并對其機理進行了初步探討,旨在為酵母胞外多糖作為藥物和保健品研發(fā)提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

膠紅酵母 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(編號:CICC 33013);昆明小鼠 健康,雄性,體重為(20±2) g,購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心,許可證號:SYXK2012(陜)2012-006;丙二醛(MDA)測定試劑盒、超氧化物岐化酶(SOD)測定試劑盒、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒、尿素氮(BUN)測定試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒、血乳酸(BLA)測定試劑盒和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒 南京建成生物工程研究所產(chǎn)品;活化培養(yǎng)基(YPD培養(yǎng)基) 葡萄糖10 g、蛋白胨10 g、酵母膏5 g、瓊脂10 g;種子培養(yǎng)基 葡萄糖15 g、(NH4)2SO415 g、K2HPO40.24 g、MgSO4·7H2O 1.8 g、CaCl20.28 g、NaCl 0.6 g、NaNO30.58 g;發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖15 g、(NH4)2SO415 g、K2HPO40.24 g、MgSO4·7H2O 1.8 g、CaCl20.28 g、NaCl 0.6 g、NaNO30.58 g;其他試劑 均為分析純。

UV-110紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;JY92-II超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;CT15RT臺式高速冷凍離心機 上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司;varioskan flash全波長掃描式多功能讀數(shù)儀 賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 膠紅酵母胞外多糖的制備 將保藏的膠紅酵母菌接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基上,28 ℃下培養(yǎng)48 h。從YPD培養(yǎng)基上挑取一環(huán)膠紅酵母菌接種到種子培養(yǎng)液中,28 ℃條件下培養(yǎng)72 h。然后將種子培養(yǎng)液以10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)液中,28 ℃下發(fā)酵培養(yǎng)5 d。將發(fā)酵培養(yǎng)液在8000 r/min的條件下離心10 min,棄去菌體,吸取5 mL發(fā)酵液,加入4倍體積95%的乙醇溶液進行醇沉,置于4 ℃冰箱中靜置過夜,8000 r/min離心10 min,棄去上清液,得到粗多糖沉淀,沉淀用一定量的蒸餾水溶解,流水透析2 d,蒸餾水透析1 d,去除小分子雜質(zhì),冷凍干燥,得到膠紅酵母粗多糖[6]。

1.2.2 分組與給藥 將20只雄性小鼠分為4組,每組10只。分為正常對照組(生理鹽水)、膠紅酵母粗多糖高(100 mg/kg·bw)、中(50 mg/kg·bw)、低(25 mg/kg·bw)劑量組。將膠紅酵母粗多糖用生理鹽水分別配制成10、5、2.5 mg/mL的溶液,每天灌胃1次,灌胃體積為0.1 mL/10 g·bw,連續(xù)給藥10 d。

1.2.3 小鼠負重游泳實驗 小鼠連續(xù)灌胃10 d,在末次給藥30 min后,在小鼠的尾部負重其體重的5%的鉛絲,讓其在恒溫水槽中游泳,水槽深度為30 cm,水溫為(25±2) ℃,從小鼠入水開始計時,直到其沉入水面下10 s未能浮出水面為止,此時間即為小鼠游泳力竭時間[7]。

1.2.4 生化指標的測定 將游泳力竭的小鼠從水槽中撈出,摘眼球取血,室溫下靜置30 min,4000 r/min離心10 min,取上清液。按照試劑盒說明測定BUN、BLA、LDH等生化指標。

將取血后的小鼠立即解剖,分離出肝臟并用生理鹽水漂洗,用濾紙將多余的水分吸干,稱取處理后的肝臟0.1 g,加入9倍體積(mL)的生理鹽水,用超聲波細胞粉碎機進行勻漿,勻漿功率為180 W,勻漿時間1 s/次,間隔1 s,總時間為1 min,得到濃度為10%的組織勻漿,按照試劑盒說明測定MDA、SOD、CAT和GSH-Px等生化指標。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠紅酵母多糖對小鼠體重的影響

各組小鼠給藥前和給藥第10 d體重測定結(jié)果如表1所示,與正常對照組相比,各組小鼠體重變化的差異不大,無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05),表明膠紅酵母胞外多糖對小鼠的體重沒有明顯的影響。

表1 膠紅酵母多糖對小鼠體重的影響Table 1 Effect of Rhodotorula mucilaginosa extracellular polysaccharide on mice body

2.2 膠紅酵母多糖對小鼠負重游泳時間的影響

負重游泳獲得的實驗數(shù)據(jù)一直是反映運動耐力的重要指標,這是因為運動耐力的提高是機體抗疲勞最客觀和最直接的表現(xiàn)[8]。膠紅酵母多糖對小鼠負重游泳時間的影響如表2所示,與正常對照組相比較,膠紅酵母多糖高、中和低劑量組的小鼠負重游泳時間均極顯著增加(p<0.01),高、中和低劑量組對小鼠負重游泳時間的增加率分別為95.55%、61.78%和50.04%,且該效果與給藥劑量在實驗范圍內(nèi)呈一定的相關(guān)性。

表2 膠紅酵母多糖對小鼠負重游泳時間的影響Table 2 Effects of extracellular polysaccharide from Rhodotorula mucilaginosa on weight-loaded

2.3 膠紅酵母多糖對運動后小鼠血清中BUN的影響

由圖1可知,與正常對照組相比,膠紅酵母多糖高劑量組能極顯著降低小鼠血清中BUN的含量(p<0.01),膠紅酵母多糖中、低劑量組均能顯著降低血清中BUN的含量(p<0.05),降低率分別為29.79%、14.47%和15.77%,研究表明,在機體劇烈運動的過程中,氨基酸和蛋白質(zhì)的分解代謝增加,作為蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物BUN,將經(jīng)血液循壞由腎臟排出體外[9]。BUN與人身體的疲勞程度和負荷量大小呈正相關(guān),膠紅酵母多糖高劑量能顯著降低BUN的含量,延緩疲勞的出現(xiàn)。

圖1 膠紅酵母多糖對運動后小鼠血清中BUN含量的影響Fig.1 Effect of extracellular polysaccharide of Rhodotorula mucilaginosa on serum BUN

2.4 膠紅酵母多糖對運動后小鼠血清中BLA含量的影響

長時間劇烈的運動會造成機體相對缺氧和糖酵解的速度加快,從而產(chǎn)生大量的乳酸,因此,BLA水平反映的是機體的有氧代謝能力[10]。由圖2可知,膠紅酵母多糖高劑量組能極顯著降低血清中BLA的含量(p<0.01),降低率為56.15%,多糖中劑量組能顯著降低血清中BLA的含量(p<0.05),降低率為36.91%,說明膠紅酵母多糖可以減少血中乳酸的生產(chǎn),從而達到延緩疲勞的效果。

圖2 膠紅酵母多糖對運動后小鼠血清中BLA含量的影響Fig.2 Effect of extracellular polysaccharide of Rhodotorula mucilaginosa on serum BLA

2.5 膠紅酵母多糖對運動后小鼠血清中LDH活力的影響

高強度運動中,機體內(nèi)部分細胞缺氧,造成血液中乳酸含量升高,而LDH能將機體中的乳酸催化脫氫轉(zhuǎn)化成丙酮酸。LDH的活性會隨著機體中乳酸增多而增強,因此LDH在一定程度上能夠反映機體無氧呼吸的程度[11]。由圖3可知,膠紅酵母多糖高劑量組能顯著提高血清中LDH的活性(p<0.05),增加率為33.18%,多糖中、低劑量組也能提高血清中LDH的活性,但不顯著。

圖3 膠紅酵母多糖對運動后小鼠血清中LDH活力的影響Fig.3 Effect of extracellular polysaccharide of Rhodotorula mucilaginosa on serum LDH activity

2.6 膠紅酵母多糖對運動后小鼠肝臟中MDA含量的影響

膠紅酵母多糖對運動后小鼠肝臟中MDA含量的影響如圖4所示,膠紅酵母多糖高、中和低劑量組均能顯著降低小鼠肝臟中的MDA值(p<0.05),與正常對照組相比,肝勻漿中MDA值分別降低了29.29%、23.57%和20.71%。在劇烈的運動中,抗氧化酶的活性會慢慢地降低,造成自由基過多進而導(dǎo)致機體受到損傷,因此,要盡可能的避免衰竭性的運動。MDA的大量積累,會對細胞造成傷害。實驗中膠紅酵母多糖能顯著降低運動后肝臟中MDA的含量。

圖4 膠紅酵母多糖對運動后小鼠肝臟中MDA含量的影響Fig.4 Effect of extracellular polysaccharide of Rhodotorula mucilaginosa on the content of MDA in the liver of mice after

2.7 膠紅酵母多糖對運動后小鼠肝臟中SOD活力的影響

由圖5可知,與正常對照組相比,膠紅酵母多糖高劑量組能極顯著增加小鼠SOD活力(p<0.01),增加率為18.69%,膠紅酵母多糖中劑量組能顯著增加小鼠SOD活力(p<0.05),增加率為16.37%,膠紅酵母低劑量組雖然效果不顯著,但是也能增加小鼠SOD活力,增加率為14.52%。SOD能夠清除氧自由基,是一種自由基清除劑,存在于生物體的各個組織中,可以消除機體在新陳代謝的過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)[10]。

圖5 膠紅酵母多糖對運動后小鼠肝臟中SOD含量的影響Fig.5 Effect of extracellular polysaccharide of Rhodotorula mucilaginosa on SOD activity in the liver of mice after

2.8 膠紅酵母多糖對運動后小鼠肝臟中CAT活力的影響

羥自由基是化學(xué)性質(zhì)最活潑的活性氧,它幾乎與細胞內(nèi)每一類有機物都能發(fā)生反應(yīng),破壞性極強,而CAT能分解此自由基,減少其對機體的損害。膠紅酵母多糖對運動后小鼠肝臟中CAT活力的影響見圖6,膠紅酵母高、中和低劑量組均能極顯著增加小鼠CAT活力(p<0.01),增加率分別為52.65%,44.74%和31.86%。

圖6 膠紅酵母多糖對運動后小鼠肝臟中CAT活力的影響Fig.6 Effect of extracellular polysaccharide of Rhodotorula mucilaginosa on CAT activity in the liver of mice after

2.9 膠紅酵母多糖對運動后小鼠肝臟中GSH-Px活力的影響

GSH-Px廣泛存在于有機體內(nèi),能夠清除由活性氧誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化物,是一種重要的過氧化物分解酶,它能減少脂質(zhì)過氧化物對機體的損傷,減少疲勞的產(chǎn)生[12]。膠紅酵母多糖對運動后小鼠肝臟中GSH-Px活力的影響見圖7,與正常對照組相比,膠紅酵母多糖高劑量組能極顯著提高肝臟中GSH-Px的活力(p<0.01),提高率為53.87%,膠紅酵母多糖中、低劑量組能顯著提高GSH-Px的活力(p<0.05),提高率分別為34.21%和31.12%。

圖7 膠紅酵母多糖對運動后小鼠肝臟中GSH-Px活力的影響Fig.7 Effect of extracellular polysaccharide of Rhodotorula mucilaginosa on GSH-Px activity in the liver of mice after

3 討論與結(jié)論

疲勞是由于機體長時間從事過于緊張、繁重的工作及任務(wù)引起的效率暫時下降的一種生理和心理現(xiàn)象[8]?？蛊谧钪苯拥谋憩F(xiàn)就是運動耐力的提高,負重游泳時間的長短反應(yīng)機體對疲勞的耐受能力[13]。機體長時間劇烈運動時會產(chǎn)生大量的乳酸,乳酸解離會引起一系列生化反應(yīng),導(dǎo)致疲勞的產(chǎn)生,而LDH活力的增加會加速肌肉中過多乳酸的清除,延緩疲勞的發(fā)生。血清中BUN含量增加是由于機體不能夠通過脂肪和糖分解代謝獲得足夠的能量,體內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸分解代謝增強[14]。因此,血清中的BUN、BLA和LDH水平是體現(xiàn)了機體的有氧代謝能力和疲勞程度[15]。CAT和SOD是體內(nèi)清除活性氧自由基的重要酶,體現(xiàn)了生物體的抗氧化能力,減少組織中MDA的積累,避免因機體抗氧化能力減弱導(dǎo)致體內(nèi)自由基生成量增多,防止機體細胞受到損傷,GSH-Px能夠起到保護細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能不受過氧化物損害的作用,達到提高運動耐力,延緩疲勞的效果。

本研究表明膠紅酵母胞外多糖高、中和低劑量組均能極顯著延長小鼠負重游泳的時間,提高小鼠的運動能力,其中,高劑量組(100 mg/kg·bw)作用效果最好。同時,與正常對照組相比,膠紅酵母多糖能顯著提高小鼠運動后血清中LDH的活力,降低血清中BUN和BLA的含量,說明膠紅酵母多糖通過增強小鼠體內(nèi)LDH的活力,減少劇烈運動過程中的無氧糖酵解和蛋白質(zhì)分解,清除過度勞累產(chǎn)生的過多的BLA和BUN,降低它們在機體內(nèi)的積累,從而達到抗疲勞的目的。此外,與正常對照組相比,膠紅酵母多糖能顯著降低小鼠運動后肝臟組織中MDA的含量,增加SOD、CAT和GSH-Px的活力,減少活性氧自由基的積累,加速清除脂質(zhì)過氧化物,提高機體的抗氧化能力,抵抗疲勞。王書全等[16]對螺旋藻多糖的抗疲勞作用進行了研究,在300 mg/kg·bw劑量作用下效果最佳,小鼠負重游泳時間延長了59.90%,朱磊等[17]研究報道黑木耳多糖以100 mg/kg·bw劑量效果最好,游泳時間增加65.04%,本實驗中,膠紅酵母多糖以100 mg/kg·bw劑量效果最好,游泳時間增加了95.55%,抗疲勞作用效果更顯著。

綜上所述,膠紅酵母多糖可以延長小鼠負重游泳的時間,具有抗疲勞作用,是一種比較優(yōu)良的抗疲勞物質(zhì)。

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