邵 穎,陳安徽,*,張 明,鄭 義,陳宏偉,夏振榮

(1.徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院,江蘇徐州 221008;2.江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點實驗室,江蘇徐州 221008;3.江蘇康能生物工程股份有限公司,江蘇儀征 221100)

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris(L.)Link)又名北蟲草,是真菌寄生于昆蟲的蛹形成的蟲菌復(fù)合體,為我國傳統(tǒng)滋補性中藥?，F(xiàn)代研究表明,蛹蟲草富含蟲草多糖、腺苷、蟲草素等多種生物活性成分,具有止咳、鎮(zhèn)痛、降壓、抗疲勞、抗菌消炎、抗癌、增強免疫、延緩衰老等多種生理活性[1-10]。因其與冬蟲夏草生物活性成分及生理活性相似,蛹蟲草一直被用作冬蟲夏草的替代品,并在2009年被批準為新資源食品。隨著生活水平的提高,人們保健意識的增強,保健品特別是藥食兩用資源得到了普遍關(guān)注,而蛹蟲草作為具有特定保健功效的新資源食品也得到了廣泛的認可。

目前圍繞蛹蟲草的研究主要集中于蛹蟲草無性型代謝產(chǎn)物的活性成分及藥理作用層面,針對蛹蟲草子實體的研究則主要是蛹蟲草高產(chǎn)栽培技術(shù)領(lǐng)域[11-16]。蛹蟲草子實體中纖維素含量較高,若直接食用則其中的活性成分無法充分發(fā)揮功效,通過速溶技術(shù)利用酶解方法處理蛹蟲草獲得速溶粉會最大限度地減少蛹蟲草資源的浪費,且對打破蛹蟲草子實體傳統(tǒng)應(yīng)用方法的局限及迎合現(xiàn)代快節(jié)奏生活的需求具有特定的現(xiàn)實意義。以蛹蟲草為資源的便捷食品的加工工藝及相關(guān)產(chǎn)品的生物學(xué)功效的研究已成為廣大食品從業(yè)人員的關(guān)注焦點。但目前關(guān)于蛹蟲草深加工技術(shù)及其制品的系統(tǒng)分析研究報道尚少。

環(huán)磷酰胺是臨床上治療惡性腫瘤最常用的烷化劑代表藥物,具有光譜抗癌作用[17]。因為環(huán)磷酰胺的主要代謝產(chǎn)物丙烯醛的肝臟毒性會引起受治患者藥物性肝損傷,而表現(xiàn)為血清轉(zhuǎn)氨酶升高及肝組織防御性抗氧化系統(tǒng)的抗氧化功能降低[18]。為了探討蛹蟲草速溶粉的生物學(xué)功能,名確蛹蟲草速溶粉對肝損傷的保護作用,本研究使用環(huán)磷酰胺構(gòu)建小鼠肝損傷模型,考察了蛹蟲草速溶粉對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的改善作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗小鼠120只,雌雄各半,體重(20±2) g,7～8周齡,購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司(許可證編號SCXK魯2014 0007);蛹蟲草速溶粉 江蘇康能生物工程股份有限公司;環(huán)磷酰胺 山西普德藥業(yè)股份有限公司;水飛薊賓 天津天士力圣特制藥有限公司;谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、還原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GSH-Px)、白細胞介素2(IL-2)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)檢測試劑盒 均購自南京建成生物工程研究所。

LGJ-18A 型冷凍干燥機 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠;FA2104N型電子分析天平、723C型可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司;TGL-16型臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器有限公司;SENCO R-502B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申勝生物技術(shù)公司;5804多功能臺式離心機 Eppendorf公司;Synergy2型多功能酶標儀 BioTek公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛹蟲草速溶粉的生產(chǎn)方法 參照專利一種蛹蟲草速溶粉的制備方法(ZL201310207185.9),并根據(jù)具體生產(chǎn)條件作適當調(diào)整[19]。

1.2.2 實驗動物分組及給藥 120只小鼠雌雄各半分開飼養(yǎng)。雌、雄小鼠分別隨機分為正常對照組(10只)、模型組(50只)。模型組小鼠每天按照80 mg/kg的劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺,正常對照組使用生理鹽水代替,連續(xù)注射3 d。造模后的小鼠隨機分為5組,每組10只,分別為肝損傷模型組、陽性對照組(150 mg/kg水飛薊賓)、蛹蟲草速溶粉高劑量組(80 mg/kg)、中劑量組(40 mg/kg)和低劑量組(20 mg/kg),小鼠連續(xù)灌胃14 d,肝損傷模型組和正常對照組每天等量給予生理鹽水。

1.2.3 小鼠血清的制備及血清中ALT、AST、IL-2、TNF-α測定 末次給藥后禁食24 h,采取挖眼取血的方法收集小鼠血液并于4 ℃、3000 r/min條件下離心10 min收集血清于-20 ℃保存?zhèn)溆?。血清中各指標測定操作步驟按照試劑盒的要求進行。

1.2.4 小鼠肝組織勻漿的制備及生化指標的測定 小鼠快速頸椎脫臼處死后對死亡小鼠進行解剖,取出小鼠肝臟并用已預(yù)冷的生理鹽水進行漂洗,臟器上多余水分用濾紙吸干,手術(shù)剪剪碎肝臟并取0.1 g于玻璃勻漿管中,加入0.9 mL預(yù)冷生理鹽水于冰水浴中手動勻漿制成10%組織勻漿液,勻漿液于4 ℃、3000 r/min條件下離心15 min后,收集上清液于-20 ℃保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說明書的方法分別測定肝組織中SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用DPS7.05版軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析,實驗結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲草速溶粉對肝損傷小鼠血清AST和ALT活性的影響

蛹蟲草速溶粉對環(huán)磷酰胺致肝損傷小鼠血清中AST和ALT的影響見表1。由表1可知,腹腔注射環(huán)磷酰胺(80 mg/kg)后,雄性和雌性小鼠血清中的AST和ALT活力單位均顯著高于未注射環(huán)磷酰胺的正常對照組(p<0.01),表明造模成功。

表1 蛹蟲草速溶粉對環(huán)磷酰胺致肝損傷小鼠血清AST和ALT活性的影響Table 1 Effects of instant powder of Cordyceps militaris on serum AST and ALT in cyclophosphamide-treated mice

對造模成功小鼠給與不同劑量的蛹蟲草速溶粉后,各劑量組小鼠血清中AST和ALT活力雖仍高于正常對照組,但卻極顯著地低于模型組(p<0.01)。另外,各劑量組雄性、雌性小鼠血清中AST和ALT的活力與攝入蛹蟲草速溶粉的劑量間還呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系,隨著速溶粉攝入劑量的增加,小鼠血清中AST和ALT的活力呈降低趨勢。高劑量組雌性小鼠血清中AST和ALT的活力甚至低于陽性對照組。肝臟受損時,動物血漿中AST、ALT會升高,而攝入蛹蟲草速溶粉后其活力明顯降低,說明蛹蟲草速溶粉對不同性別的小鼠均具有降低血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力,有效改善肝臟受損的作用。

2.2 蛹蟲草速溶粉對環(huán)磷酰胺致肝損傷小鼠肝組織生化指標的影響

蛹蟲草速溶粉對環(huán)磷酰胺致肝損傷小鼠肝組織中抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響結(jié)果如表2和表3所示。

表2 蛹蟲草速溶粉對環(huán)磷酰胺致肝損傷小鼠(雄)肝組織SOD、CAT、GSH-Px、MDA的影響Table 2 Effects of instant powder of Cordyceps militaris on SOD,CAT,GSH-Px，and MDA in liver tissue of cyclophosphamide-treated mice(male)

表3 蛹蟲草速溶粉對環(huán)磷酰胺致肝損傷小鼠(雌)肝組織SOD、CAT、GSH-Px、MDA的影響Table 3 Effects of instant powder of Cordyceps militaris on SOD,CAT,GSH-Px and MDA in liver tissue of cyclophosphamide-treated mice(female)

由表2可知,模型組雄性小鼠攝入環(huán)磷酰胺后肝組織中SOD、CAT、GSH-Px的活力均顯著低于正常對照組,而MDA的含量顯著高于正常對照組(p<0.01),說明環(huán)磷酰胺造成了雄性小鼠肝臟抗氧化系統(tǒng)的損傷。

灌胃蛹蟲草速溶粉后,各劑量組小鼠肝組織中SOD、GSH-Px活力均極顯著高于模型組,MDA的含量極顯著低于模型組(p<0.01)。僅中、高劑量組小鼠肝組織中CAT活力顯著高于模型組,且達到了極顯著水平(p<0.01)。高劑量組小鼠的SOD活力甚至還顯著高于正常對照組,MDA含量顯著低于正常對照組(p<0.01)。說明蛹蟲草速溶粉具有較好的改善雄性小鼠肝組織過氧化的能力。

表3為蛹蟲草速溶粉對環(huán)磷酰胺致肝損傷雌性小鼠肝組織中SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA含量的實驗結(jié)果。由實驗結(jié)果可知,模型組小鼠肝組織中SOD、CAT和GSH-Px活力均顯著低于正常對照組,而MDA含量則顯著高于正常對照組(p<0.01),說明造模成功。

與模型組相比,各劑量組小鼠肝組織中CAT活力極顯著增加(p<0.01),且中、高劑量組甚至高于陽性對照;各劑量組小鼠肝臟中MDA的含量顯著低于模型組和正常對照組(p<0.01),高劑量組中MDA含量還低于陽性對照;中、高劑量組小鼠肝臟中SOD活力顯著高于模型組(p<0.01),且在數(shù)值上還高于陽性對照;另外,與模型組相比較,中、高劑量組小鼠肝組織中GSH-Px活力存在極顯著差異(p<0.01),但在本實驗條件下低劑量組與模型組之間差異不顯著。實驗結(jié)果說明蛹蟲草速溶粉同樣可以改善雌性小鼠肝組織過氧化狀況。

2.3 蛹蟲草速溶粉對小鼠血清IL-2、TNF-α的影響

白細胞介素-2(IL-2)是趨化因子家族中的一種細胞生長因子,大多通過活化T細胞生成。IL-2能夠促使T細胞發(fā)生免疫反應(yīng),這種反應(yīng)具有依賴性,也可以有效地治療由自身抗體引起的疾病。腫瘤壞死因子(TNF-α)作為一類通過巨噬細胞與單核細胞生成的單核因子,能夠借助于機體的免疫功能,對同一腫瘤起到直接和間接的雙重抗癌活性[20]。環(huán)磷酰胺作為抗癌藥物,使用過程中不僅存在因為環(huán)磷酰胺主要代謝物丙烯醛引起的肝臟毒性作用,還會造成機體免疫系統(tǒng)的抑制作用[21]。本實驗通過測定各組小鼠血清中IL-2、TNF-α的含量,初步考察了經(jīng)環(huán)磷酰胺處理后蛹蟲草速溶粉對小鼠機體免疫的影響。具體實驗結(jié)果如表4所示。

表4 蛹蟲草速溶粉對環(huán)磷酰胺致肝損傷小鼠血清中IL-2、TNF-α 含量的影響Table 4 Effects of instant powder of Cordyceps militaris on IL-2 and TNF-α in serum of cyclophosphamide-treated mice

由表4可知,模型組小鼠注射環(huán)磷酰胺后其血清中IL-2、TNF-α的含量均顯著低于未注射的正常對照組小鼠(p<0.01),說明環(huán)磷酰胺顯著削弱了小鼠的免疫能力。小鼠攝入蛹蟲草速溶粉后,除低劑量組雄性小鼠血清中TNF-α指標外,其他各組小鼠血清中IL-2、TNF-α的含量與模型組間均存在極顯著差異(p<0.01),說明蛹蟲草速溶粉具有顯著提高環(huán)磷酰胺致肝損傷小鼠免疫功能的作用。比較各劑量組小鼠血清中IL-2、TNF-α的含量發(fā)現(xiàn),隨著蛹蟲草速溶粉攝入劑量的增加,小鼠血清中IL-2、TNF-α的含量也隨之增加。另外,高劑量組雌、雄小鼠血清中IL-2、TNF-α的含量接近陽性對照組,說明蛹蟲草速溶粉能夠有效提高雌、雄小鼠的免疫能力。

3 結(jié)論與討論

利用環(huán)磷酰胺腹腔注射的方式成功構(gòu)建了小鼠肝損傷模型,以水飛薊賓為陽性對照,對造模成功小鼠灌胃不同劑量的蛹蟲草速溶粉,考察了蛹蟲草速溶粉對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的保護作用。

小鼠血清中ALT、AST活力測定結(jié)果表明,各劑量組雌、雄小鼠血清中AST和ALT活力均顯著低于模型組(p<0.01),且高劑量組雌性小鼠血清中AST、ALT的活力甚至低于陽性對照。蛹蟲草速溶粉對肝損傷小鼠肝組織中抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響結(jié)果顯示,各劑量組雄性小鼠肝組織中SOD、GSH-Px活力均顯著高于模型組,MDA的含量顯著低于模型組(p<0.01),中、高劑量組雄性小鼠肝組織中CAT活力顯著高于模型組,且達到了極顯著水平(p<0.01);對于雌性小鼠而言,各劑量組小鼠肝組織中CAT活力與模型組間存在極顯著差異(p<0.01),且高劑量組甚至高于陽性對照;各劑量組小鼠肝臟中MDA的含量顯著低于模型組和正常對照組(p<0.01),高劑量組中MDA含量還低于陽性對照;中、高劑量組小鼠肝臟中SOD、GSH-Px活力顯著高于模型組(p<0.01)。小鼠注射環(huán)磷酰胺后其血清中IL-2、TNF-α的含量均顯著降低,但在攝入蛹蟲草速溶粉后,除低劑量組雄性小鼠血清中TNF-α指標外,其他各組小鼠血清中IL-2、TNF-α的含量均極顯著地高于模型組(p<0.01)。

ALT、AST是動物血清中重要的轉(zhuǎn)氨酶,正常機體血清中含量為零或者很少,當機體肝組織損傷時,肝細胞漿內(nèi)的ALT、AST會因為肝細胞膜通透性的增加而被釋放入血使得血液中ALT和AST含量增加[22]。本實驗中,環(huán)磷酰胺致肝損傷小鼠攝入蛹蟲草速溶粉后,小鼠血清中ALT和AST的活性與模型組比較均極顯著降低(p<0.01),且活性與蛹蟲草速溶粉的攝入劑量間存在著劑量效應(yīng)關(guān)系。在肝組織抗氧化防御系統(tǒng)中,SOD、CAT和GSH-Px是機體重要的抗氧化酶,具有清除自由基的作用。MDA是機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的代謝產(chǎn)物,是反映脂質(zhì)過氧化的敏感指標,也可間接反映肝細胞的損傷程度[23]。本實驗中,蛹蟲草速溶粉顯示了明顯的改善小鼠肝組織過氧化的能力,同時顯著地降低了小鼠肝組織中MDA的含量,提示了蛹蟲草速溶粉具有肝損傷改善作用。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)了蛹蟲草多糖對CCl4導(dǎo)致的小鼠急性肝損傷的顯著保護作用及蛹蟲草基質(zhì)多糖對酒精所致的小鼠急性肝損傷的明顯改善作用,兩種多糖均能有效降低小鼠血漿中AST和ALT活力,降低肝組織中MDA含量,提高肝組織中SOD、GSH-Px活力[24-25]。分析其改善小鼠肝損傷的機制可能是由于蛹蟲草及其基質(zhì)的多糖可以直接捕捉、清除自由基,阻斷或終止自由基連鎖反應(yīng)鏈,加快體內(nèi)自由基的清除,增加SOD活性,穩(wěn)定生物膜結(jié)構(gòu),抑制MDA產(chǎn)生,從而減輕干細胞變性,促進損傷肝組織結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)。本研究中蛹蟲草速溶粉對小鼠肝損傷的保護作用與上述兩種多糖的保護作用保持一致,至于蛹蟲草速溶粉的肝損傷保護作用是否是通過其改善小鼠過氧化狀態(tài)實現(xiàn)的值得深入探討,另外起到肝損傷保護作用的物質(zhì)基礎(chǔ)是源于蛹蟲草速溶粉中的多糖還是其他的活性成分也值得進行進一步研究。

環(huán)磷酰胺導(dǎo)致小鼠肝損傷的同時,模型組小鼠血清中IL-2及TNF-α的含量顯著降低,研究過程中通過測定小鼠血清中TNF-α及IL-2的含量初步分析了蛹蟲草速溶粉對因為環(huán)磷酰胺的使用可能造成的免疫抑制小鼠的免疫增強作用。結(jié)果表明,與模型組相比,除低劑量組雄性小鼠血清中TNF-α指標無差異外,其他各組中TNF-α及IL-2的含量均顯著提高(p<0.05),且含量與蛹蟲草速溶粉的劑量間呈現(xiàn)正相關(guān)性。

以新資源食品蛹蟲草為原料通過速溶加工技術(shù)制作的蛹蟲草速溶粉對于環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的小鼠肝損傷具有明顯的保護作用,同時也對因為環(huán)磷酰胺攝入引起的機體免疫低下起到了一定的免疫增強作用。蛹蟲草速溶粉明顯的肝損傷改善功效的驗證為其在保健品、保健食品、藥品開發(fā)等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了參考。

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