于弘慧,馬挺軍,孫運(yùn)金,陳璧州,李紅衛(wèi),*

(1.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,北京 102206;2.農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

河北水晶梨 北京市昌平區(qū)回龍觀西大街物美超市;大腸桿菌ATCC8099 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;胰蛋白胨、酵母浸提液、NaCl、瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、抗壞血酸 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;DPPH、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、Folin-Phenol 美國(guó)Sigma公司;碳酸鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、碳酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙醇、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、草酸、水楊酸 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

低溫等離子體反應(yīng)器(北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院自制,交流電輸出0～6 kV,電源頻率10 kHz);IKA MS2磁力攪拌器、JA1003電子分析天平 上海天平儀器廠;WFJ2100可見(jiàn)光分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;TGL-16G臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠制造;MJ-25BM04B榨汁機(jī) 廣東美的精品電器制造有效公司;DHP-500電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司;MLS-3751L-PC高壓蒸汽滅菌鍋 日本Panasonic公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 梨汁制備 購(gòu)買同一生產(chǎn)批次無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械損傷、新鮮的水晶梨作為實(shí)驗(yàn)原料。自來(lái)水沖洗后,去皮,切成塊,放入攪碎機(jī)中榨取濾液備用,做低溫等離子體殺菌實(shí)驗(yàn)時(shí),將鮮榨梨汁在120 ℃高溫下滅菌15 min,然后將大腸桿菌ATCC8099稀釋至1.01×108～1.01×109cfu/mL,接種到梨汁中。

1.2.2 殺菌處理 將接種大腸桿菌后的梨汁分為3組,第一組用50 mL 120 ℃高溫滅菌15 min的無(wú)菌小燒杯盛裝3 mL梨汁放在磁力攪拌器上以500 r/min在低溫等離子體反應(yīng)器中進(jìn)行殺菌,電源電壓0～5 kV,氣體流量40～80 L/min,常溫常壓,液體距離放電口3 cm;第二組取30 mL梨汁放入50 mL小燒杯中進(jìn)行巴氏殺菌,90 ℃,10 min;第三組不進(jìn)行殺菌處理,室溫放置相同時(shí)間。將不同條件處理后的梨汁稀釋到適當(dāng)倍數(shù)(10-6～10-7),移取0.2 mL于LB培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,采用GB 4789-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)》[23]中平板計(jì)數(shù)法對(duì)大腸桿菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。殺菌率以logN0/N表示,N0為表示殺菌前梨汁大腸桿菌活菌數(shù),N表示殺菌后梨汁中大腸桿菌活菌數(shù)。

1.2.3 低溫等離子體殺菌單因素實(shí)驗(yàn) 為了考察殺菌時(shí)間對(duì)殺菌率的影響,取3 mL接種后梨汁進(jìn)行殺菌處理,控制電源電壓為4 kV,空氣流速為60 L/min,分別振蕩殺菌1、2、3、4、5 min;為了考察電源電壓對(duì)梨汁殺菌率的影響,取3 mL接種后梨汁進(jìn)行殺菌處理,殺菌時(shí)間固定為4 min,空氣流速60 L/min,電源電壓分別為1、2、3、4、5 kV,為了考察空氣流速對(duì)梨汁殺菌率的影響,取3 mL接種后梨汁進(jìn)行殺菌處理,控制殺菌時(shí)間為4 min,電壓控制在4 kV,空氣流速分別為40、50、60、70、80 L/min,每個(gè)處理做三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 低溫等離子體殺菌響應(yīng)面設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以殺菌時(shí)間、空氣流速、電源電壓為工藝參數(shù),設(shè)計(jì)三因素三水平Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),以大腸桿菌為考察指標(biāo),共設(shè)計(jì)5個(gè)中心點(diǎn)和17組實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 響應(yīng)面因素水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.5 殺菌前后梨汁品質(zhì)的指標(biāo)測(cè)定 選取最優(yōu)低溫等離子體殺菌工藝條件與巴氏殺菌品質(zhì)指標(biāo)做比較。VC含量的測(cè)定:采用國(guó)標(biāo)法[24],測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.1458x-0.1412R2=0.9899;總酚含量的測(cè)定:采用福林酚法,以沒(méi)食子酸計(jì)算,測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.5985x+0.0047R2=0.9834;總酸的測(cè)定:采用酸堿滴定法,以蘋(píng)果酸計(jì)算;還原糖的測(cè)定:采用直接滴定法,以葡萄糖計(jì)算;可溶性固形物含量的測(cè)定:使用手持糖度儀測(cè)定[25-26];色澤:采用色差儀進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 殺菌前后梨汁DPPH自由基的清除率 在干凈小燒杯中加入2 mL鮮榨梨汁、DPPH自由基溶液(0.2 mmol/L),振蕩混合后避光靜置30 min,在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A1,并做三次平行實(shí)驗(yàn),計(jì)算公式如下:

式中:A1為梨汁的吸光度;A2為梨汁與無(wú)水乙醇溶液混合吸光度;A3為乙醇與DPPH溶液混合測(cè)吸光度[27-28]。

1.2.7 殺菌前后梨汁羥自由基清除能力測(cè)定 在干凈的小燒杯中加入2 mL的 梨汁、FeSO4(10 mmol/L)、水楊酸-乙醇溶液(10 mmol/L)和 H202(6 mmol/L),充分混勻,避光放置10 min后于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A1。以VC作對(duì)照測(cè)吸光度為A2,蒸餾水做空白測(cè)吸光度為A3,并做三次平行實(shí)驗(yàn),計(jì)算公式如下：

式中:A1為梨汁的吸光度;A2為VC的吸光度;A3為蒸餾水的吸光度[27-28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

殺菌時(shí)間對(duì)殺菌率影響見(jiàn)圖1A,大腸桿菌的殺菌率隨著殺菌時(shí)間的增加而增加,在殺菌4 min時(shí)達(dá)到最大值,殺菌5 min時(shí),殺菌率基本維持不變,這是因?yàn)樵谳^短時(shí)間所釋放的等離子體活性成分較少,對(duì)大腸桿菌殺菌作用力低,所以殺菌率低,而達(dá)到一定時(shí)間后,等離子體釋放量不斷增加,大部分大腸桿菌被殺滅,再增加時(shí)間殺菌率也沒(méi)有很大的提高。最優(yōu)殺菌時(shí)間為3～5 min[29]。

圖1 殺菌時(shí)間(A)、電壓(B)、空氣流速(C) 對(duì)梨汁殺菌效果的影響Fig.1 Effect of sterilizing time(A),voltage(B)，air flow rate(C)on sterilization of pear juice

電源電壓對(duì)殺菌率影響見(jiàn)圖1B所示,大腸桿菌的殺菌率同樣隨著電源電壓的增大而增大,當(dāng)電壓達(dá)到3 kV時(shí)迅速增加,到4 kV時(shí)殺菌率上升相對(duì)緩慢,電壓升到5 kV時(shí)殺菌率變化較小,因?yàn)殡妷嚎梢钥刂频入x子體的釋放量,當(dāng)電壓升高時(shí),等離子體也增加,當(dāng)增加到一定量時(shí)就能夠?qū)⒋竽c桿菌殺滅。最適電壓為3～5 kV[30]。

空氣流速對(duì)殺菌率影響見(jiàn)圖1C,大腸桿菌殺菌率隨著空氣流速的加大而增加,其中當(dāng)空氣流速達(dá)到70 L/min時(shí),低溫等離子體對(duì)大腸桿菌殺滅效果趨于穩(wěn)定,基本能夠?qū)⒋蟛糠执竽c桿菌殺滅,由于等離子體是通過(guò)加壓的空氣來(lái)噴射到液體表面的,通過(guò)增加空氣流速,能夠使等離子體充分與液體接觸,而當(dāng)空氣流速增加到一定量時(shí),等離子體能夠與液體充分接觸進(jìn)而殺菌,因此再增加流速其殺菌率變化不明顯。最適空氣流速為60～80 L/min。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

通過(guò)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,利用響應(yīng)面法對(duì)低溫等離子體殺菌工藝進(jìn)行優(yōu)化,以大腸桿菌殺菌率為響應(yīng)值,進(jìn)行三因素三水平Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),17個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)計(jì)與結(jié)果如下。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)值Table 2 Experimental design and response value of Box-Behnken

以殺菌率為響應(yīng)值,通過(guò)Design Expert軟件得出響應(yīng)值與殺菌時(shí)間、電壓和空氣流速三個(gè)因素之間關(guān)系,對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合,獲得響應(yīng)值與變量之間的方程:Y=2.59+0.30A+0.71B+0.030C+0.34AB+0.005AC-0.010BC-0.20A2+0.075B2-0.20C2

由表3可知,該模型為極顯著模型(p<0.01),失擬項(xiàng)不顯著(p=0.4305),說(shuō)明該模型與實(shí)驗(yàn)擬合較好。R2=0.9563,因此95.63%的殺菌率可用該模型解釋,能夠較好的表達(dá)各個(gè)因素與殺菌率之間的關(guān)系。殺菌時(shí)間A、電壓B及其交互項(xiàng)AB對(duì)殺菌率的影響極顯著(p<0.01);空氣流速C、交互項(xiàng)AC與BC、二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)殺菌率影響均不顯著(p>0.05)。去除不顯著因子后所得三因素之間的回歸方程為:

表3 響應(yīng)面方差分析Table 3 Variance analysis of response surface

Y=2.59+0.30A+0.71B+0.030C+0.34AB

交互項(xiàng)AB的響應(yīng)面及等高線圖如圖2所示。

圖2 殺菌時(shí)間與電源電壓響應(yīng)面和等高線Fig.2 Responsive surfaces of sterilizing time and voltage and contour line

該圖為空氣流速一定即70 L/min時(shí),殺菌時(shí)間與電源電壓交互作用對(duì)殺菌率的影響,由圖我們可以看出,殺菌率隨著電壓和殺菌時(shí)間的增加而增加,且電源電壓對(duì)殺菌率影響更為顯著。

2.3 擬合優(yōu)化的驗(yàn)證

通過(guò)擬合模型優(yōu)化出最佳殺菌工藝條件為:殺菌時(shí)間5 min,電源電壓為5 kV,空氣流速為70.61 L/min,其殺菌率為3.81 logN0/N。利用該最優(yōu)參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,其分別為3.67、3.59、3.88 logN0/N,與模型預(yù)測(cè)值相符,在允許誤差范圍內(nèi),因此該模型可靠、有效。

2.4 巴氏殺菌對(duì)梨汁殺菌效果

原含有1.01×108～1.01×109cfu/mL大腸桿菌的梨汁,經(jīng)過(guò)90 ℃,10 min巴氏殺菌后未有大腸桿菌檢出。

2.5 不同殺菌方式對(duì)梨汁殺菌效果及品質(zhì)的影響

由表4可以看出,殺菌處理后,L值、總酸含量、還原糖和可溶性固形物變化不顯著(p>0.05)。而低溫等離子體殺菌與巴氏殺菌后的ΔE差異顯著(p<0.05),說(shuō)明經(jīng)過(guò)熱處理后梨汁顏色有顯著的變化,與Hartyani的研究結(jié)果一致[31]?？偡雍蚔C含量的下降較為顯著(p<0.05),經(jīng)過(guò)巴氏殺菌后,梨汁的總酚和VC的保留率分別為39.2%和38.2%,而經(jīng)過(guò)低溫等離子殺菌處理,梨汁總酚和VC的保留率達(dá)到了65.7%和58.8%,分別高出巴氏殺菌26.5%和20.6%,這是由于巴氏殺菌的高溫作用使VC和酚類物質(zhì)發(fā)生了分解等化學(xué)反應(yīng)。

表4 不同殺菌方式對(duì)梨汁品質(zhì)的影響Table 4 Effects of different sterilization methods on pear juice quality

2.6 不同殺菌方式對(duì)梨汁抗氧化能力的影響

由圖3可知,梨原汁的DPPH自由基清除能力達(dá)到了95.23%,清除羥自由基能力達(dá)到72.45%,殺菌處理后DPPH自由基和羥自由基清除能力均呈下降趨勢(shì),其中低溫等離子體殺菌后DPPH的清除率為79.02%,羥自由基清除能力為66.23%,而巴氏殺菌對(duì)其影響較為嚴(yán)重,DPPH的清除率為61.89%,羥自由基清除清除率為52.92%。低溫等離子體殺菌與巴氏殺菌相比,前者對(duì)DPPH自由基和羥自由基的清除能力分別比后者高出17.99%和18.37%,可見(jiàn)前者對(duì)梨汁抗氧化能力的負(fù)面影響顯著低于后者。

圖3 不同殺菌方法對(duì)梨汁抗氧化能力的影響Fig.3 Effect of different sterilization methods on the antioxidant capacity of pear juice

3 結(jié)論

低溫等離子體能夠快速、有效的殺滅梨汁中的大腸桿菌,當(dāng)殺菌時(shí)間為5 min、電源電壓為5 kV、空氣流速為70 L/min時(shí),其殺菌效果最佳,殺菌率為3.81 logN0/N。與巴氏殺菌對(duì)比,低溫等離子體殺菌能夠更好的維持梨汁原有的品質(zhì),尤其是對(duì)總酚和VC的影響明顯小于前者,此外,低溫等離子體殺菌會(huì)降低梨汁對(duì)DPPH自由基和羥自由基的清除能力,但其降幅明顯低于前者?？梢?jiàn),低溫等離子體殺菌是一種具有良好應(yīng)用前景的非熱殺菌方式。

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