孫 乾,張愛琴,李 芳,董 聰,孔令明,*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052;2.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830021)

向日葵,又名太陽花,菊科向日葵屬[1-2],葵花籽即為向日葵的果實(shí),葵花籽粕則是葵花籽提油后的副產(chǎn)物?？ㄗ哑蔂I養(yǎng)物質(zhì)豐富,其中含有40%左右的優(yōu)質(zhì)植物蛋白[3],氨基酸組成均衡,還含有鈣、磷、煙酸、類脂、還原糖及天然食用紅色素、糠醛等[4]。為了充分利用優(yōu)質(zhì)蛋白的資源,已有國內(nèi)外眾多學(xué)者分別對(duì)林蛙[5]、大豆[6]、大米[7]、黑籽瓜[8]、銀杏[9]、紫菜[10]、芝麻[11]、竹筍[12]等動(dòng)植物中蛋白及多肽資源做了深入的研究。目前,對(duì)于多肽的制備方法主要有酸法、堿法、微生物發(fā)酵法[13-16]、電法、人工嫁接法、基因表達(dá)法和酶解法[17-21]等,其中輔助酶解法的因素有超聲波、微波、酶的激活劑、酶的抑制劑和最適酶解條件等。

國外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,大豆多肽具有一定的抗氧化、抗癌、降血脂作用[22-24]。國內(nèi)也有相關(guān)研究,許巖等[25]運(yùn)用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)植物蛋白以及多肽進(jìn)行研究,并擴(kuò)大其在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用;趙文竹等[26]對(duì)食源性植物糖蛋白的提取、純化,并指出了未來的發(fā)展趨勢(shì);鄭豐杰[27]等利用酶解法對(duì)多肽的制備優(yōu)化,闡明了植物性蛋白多肽的可利用價(jià)值前景。

活性肽是指可抑制大分子過氧化功能并具有清除自由基作用的多肽。分子的供氫能力和分子自身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性都直接或間接影響著抗氧化肽的抗氧化活性。在葵花籽粕的優(yōu)質(zhì)蛋白中,含有較多量的優(yōu)良活性肽物質(zhì),但在實(shí)際生產(chǎn)中,大部分的葵花籽粕或被當(dāng)做制作飼料的填充物,或被直接填埋,這不僅浪費(fèi)了這種優(yōu)良的多肽類物質(zhì),也造成了生態(tài)環(huán)境的污染。如何將葵花籽粕利用起來,成為待解決的關(guān)鍵問題。因此,本文通過相關(guān)性實(shí)驗(yàn),對(duì)榨油后的葵花籽粕進(jìn)行一定的酶解,并確定葵花籽粕多肽酶解液的脫鹽及超濾工藝參數(shù),為研發(fā)葵花籽粕相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葵花籽粕 新疆莊子實(shí)業(yè)有限公司昌葵一號(hào);D301-G型陰離子交換樹脂、732型陽離子交換樹脂 上海楊浦化工有限公司;微孔濾膜 上海密粒膜分離技術(shù)有限公司;超濾膜 上海摩速科學(xué)器材有限公司。氫氧化鈉、濃硫酸、濃鹽酸、無水乙醇、石油醚、30%過氧化氫、乙酸鎂、考馬斯亮藍(lán)等試劑 均為分析純。

AL204-1C型分析天平 上海梅特勒托利多儀器有限公司;1200-30高溫爐 上海均珂儀器科技有限公司;DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱、ZK-100B型萬能粉碎機(jī) 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;PC-400D電熱板 上海麥尚科學(xué)儀器有限公司;超濾裝置 Millipore公司;SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠;RF-02型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器儀 上海青浦瀘西儀器廠;DZKW-S-6型電熱恒溫水浴鍋、4-10型箱式電阻爐 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;雷磁PHS-3C型 pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;TD5A-WS型臺(tái)式低速離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;TU-1810型紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備 葵花籽粕蛋白提取工藝:葵花籽粕→粉碎→過80目篩→脫脂和綠原酸→懸浮液→調(diào)pH9.0→離心取上清液(4500 r/min,15 min)→收集上清液調(diào)pH4.0～4.5→離心取沉淀(4500 r/min,15 min)→真空冷凍干燥后待用[28]。

葵花籽粕蛋白酶解工藝:葵花籽粕蛋白→粉碎→過80目篩→懸浮液(2%,w/v)→調(diào)pH7.0～7.5→微波預(yù)處理(微波功率500 W、微波時(shí)間3 min、微波溫度55 ℃)→酶解(堿性蛋白酶∶木瓜蛋白酶為2∶1、酶底比2%、底物濃度2%、pH7.5、溫度50 ℃、酶解時(shí)間3 h)→90 ℃滅酶10 min→離心(4500 r/min,20 min)→取上清液[29]。

對(duì)葵花籽粕蛋白進(jìn)行微波酶解處理后,將酶解后得到的抗氧化活性多肽酶解液作為脫鹽和超濾的樣品。

1.2.2 葵花籽粕多肽灰分的測(cè)定 參照GB 5009.4-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定[30]。

1.2.3 葵花籽粕多肽脫鹽率的測(cè)定 如式(1)。

式(1)

式中:Ma為脫鹽前灰分含量(mg);Mb為脫鹽后灰分含量(mg)。

1.2.4 測(cè)定滲透通量 如式(2)。

式(2)

式中:V為透過液的體積量(L);Sm為膜有效面積(m2=0.0116);t為超濾時(shí)間(h)。

1.2.5 測(cè)定膜污染度 如式(3)。

式(3)

式中:Ji為膜使用前的純水滲透通量;Jw為膜使用后的純水滲透通量。

1.2.6 葵花籽粕多肽抗氧化能力的測(cè)定

式(4)

1.2.6.2 ·OH的清除能力 采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法并做一定的修改[32]。①稱量0.8 mmol/L 的鄰二氮菲溶液1 mL加入試管中,加入蒸餾水1 mL、0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)2 mL和0.8 mmol/L的硫酸亞鐵溶液1 mL,混勻后再緩慢加入0.1%的H2O21 mL,置于37 ℃下恒溫1 h左右,測(cè)定其在536 nm處的吸光度為A1;②步驟同①,把0.1%的H2O21 mL用蒸餾水1 mL代替,測(cè)定其在536 nm處的吸光度為A2;③步驟同①,把蒸餾水1 mL用待測(cè)溶液1 mL代替,測(cè)定其在536 nm處的吸光度為A3?！H清除率按照以下公式計(jì)算:

式(5)

1.3 葵花籽粕多肽脫鹽單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.1 樹脂的預(yù)處理方法 陰陽離子使用前的處理方法:取2 g吸附樹脂→加入2倍體積飽和的NaCl溶液(浸泡24 h)→倒掉浸泡液體→蒸餾水漂洗至無顏色。

陽離子交換樹脂→加入2倍體積4%的NaOH溶液(浸泡4～8 h)→倒掉浸泡液體→蒸餾水漂洗至中性→再加入2倍體積5%的HCl(浸泡8～12 h)→倒掉浸泡液體→蒸餾水漂洗至中性→干燥備用。

陰離子交換樹脂→加入2倍體積5%的HCl(浸泡8～12 h)→倒掉浸泡液體→蒸餾水漂洗至中性→加入2倍體積4%的NaOH(浸泡4～8 h)→倒掉浸泡液體→蒸餾水漂洗至中性→干燥備用。

方才那一下，讓青辰真切體會(huì)到了什么叫“一力降十會(huì)”。與巖鷹力量上的差距，讓自己天葬刀的招式根本無法發(fā)揮出來，對(duì)方若是拼著命和自己死磕，必然會(huì)落得個(gè)兩敗俱傷、魚死網(wǎng)破的下場(chǎng)，只可惜自己并不想和一只鷹同歸于盡。

1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn) 依據(jù)張宇昊等[33-34]的研究,本實(shí)驗(yàn)使用陰陽離子混合床脫鹽法。在陰陽離子交換樹脂比例為3∶2、過柱速度為8倍柱/h的條件下,選取不同的酶解液pH:3.5、4.5、5.5、6.5、7.5;在酶解液pH為4.5、過柱速度為8倍柱/h的條件下,選取不同的陰陽離子交換樹脂比例:1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、2∶3、3∶1、3∶2;在酶解液pH為4.5、陰陽離子交換樹脂比例為3∶2的條件下,選取不同的過柱速度:2、5、8、10和15倍柱/h。以抗氧化性和脫鹽率為指標(biāo),確定最適的酶解液精制pH、陰陽離子樹脂比和過柱速度。

1.4 葵花籽粕多肽超濾分離單因素實(shí)驗(yàn)

對(duì)脫鹽所得葵花籽粕多肽酶解液在常溫條件下,使用截留分子量3 kDa的超濾膜進(jìn)行超濾。在液體流速2 mL/s、超濾時(shí)間60 min的條件下,選取0.05、0.1、0.15、0.2和0.25 MPa不同的壓力;在超濾壓力0.16 MPa、超濾時(shí)間60 min的條件下,選取0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mL/s不同的液體流速;在超濾壓力0.16 MPa、液體流速為2.5 mL/s的條件下,選取5、10、30、60、120、240和300 min不同的超濾時(shí)間。以滲透通量和膜污染度為指標(biāo),確定最適的超濾壓力、流速和時(shí)間。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Oringin 8.5結(jié)合SPSS 18.0軟件作圖,并對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葵花籽粕多肽脫鹽單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析

2.1.1 酶解液pH對(duì)脫鹽效果的影響 pH的變化對(duì)脫鹽效果的影響如圖1所示。

圖1 改變酶解液pH對(duì)脫鹽效果的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis liquid pH on desalination注：圖中不同英文字母表示差異顯著(p<0.05)；圖2、圖3同。

2.1.2 改變陰陽離子交換樹脂比例對(duì)脫鹽效果的影響 陰陽離子交換比例的變化對(duì)脫鹽效果的影響結(jié)果見圖2。

圖2 改變陰陽離子交換樹脂比例對(duì)脫鹽效果的影響Fig.2 Effect of changing the proportion of anion and anion exchange resin on desalination effect

2.1.3 改變過柱速度對(duì)脫鹽效果的影響 改變過柱速度對(duì)脫鹽效果的影響結(jié)果見圖3。

圖3 改變過柱速度對(duì)脫鹽效果的影響Fig.3 Effect of changing column velocity on desalting efficiency

2.2 葵花籽粕多肽超濾分離單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析

Yen G C等[35]的研究表明,抗氧化肽多為分子量小于1或1左右的短肽。分別選用3、5、10 kDa的超濾膜對(duì)脫鹽后的葵花籽粕多肽酶解液進(jìn)行超濾分析,結(jié)果如表1所示。

表1 葵花籽粕多肽酶解液在不同處理下的抗氧化能力Table.1 Antioxidant capacity of sunflower seed cake hydrolyzate under different treatments

由表1可知,隨著截留分子量的增大,葵花籽粕多肽酶解液的抗氧化能力逐漸減小,從側(cè)面說明了小分子肽段的抗氧化能力要相對(duì)較強(qiáng)一些。因此選擇葵花籽粕多肽酶解液的超濾膜為3。

2.2.1 超濾壓力對(duì)超濾效果的影響 超濾壓力對(duì)超濾的影響結(jié)果見圖4。

圖4 滲透通量和膜污染度受超濾壓力變化的影響Fig.4 Permeate flux and membrane fouling are affected by changes in ultrafiltration pressure

由圖4可得,在0.04～0.16 MPa的范圍內(nèi),隨著超濾壓力的增大,滲透通量逐漸增大,膜污染度逐漸減小。當(dāng)壓力在0.16 MPa繼續(xù)增大時(shí),滲透通量轉(zhuǎn)為減小,膜污染度增大。這有可能是因?yàn)槌跗诘膲毫?未使大分子物質(zhì)在膜表面停留;后期的壓力,使大分子物質(zhì)在膜表面聚集量迅速增大,導(dǎo)致滲透通量降低,膜過度被污染。因此選定超濾壓力為0.16 MPa。

2.2.2 液體流速對(duì)超濾效果的影響 液體流速對(duì)超濾的影響結(jié)果見圖5。

圖5 滲透通量和膜污染度受液體流速變化的影響Fig.5 Permeate flux and membrane fouling are affected by changes in velocity of flow rate

由圖5曲線趨勢(shì)可以得出,在一定指標(biāo)范圍內(nèi),隨著液體流速的增大,滲透通量逐漸增大,膜污染度則呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)。當(dāng)多肽酶解液流速在2.5 mL/s時(shí),膜污染度迅速增大。這有可能是因?yàn)榱魉僭龃?導(dǎo)致膜面凝膠層與流動(dòng)邊界層的厚度降低。因此選定液體流速為2.5 mL/s。

2.2.3 超濾時(shí)間對(duì)超濾效果的影響 水與溶質(zhì)向溶液主體擴(kuò)散,滲透通量急劇下降,這種濃差極化現(xiàn)象會(huì)嚴(yán)重影響超濾時(shí)的效果。超濾時(shí)間對(duì)超濾的影響結(jié)果見圖6。

圖6 滲透通量和膜污染度受超濾時(shí)間變化的影響Fig.6 Permeate flux and membrane fouling are affected by changes in ultrafiltration time

由圖6曲線趨勢(shì)可以得出,在一定指標(biāo)范圍內(nèi),隨著超濾時(shí)間的延長,滲透通量逐漸降低,膜污染度逐漸增大。大分子物質(zhì)隨著時(shí)間的增長,在膜表面不斷聚集堵塞,導(dǎo)致滲透通量下降、膜污染度升高。當(dāng)超濾時(shí)間在60 min時(shí),滲透通量已經(jīng)下降了45.73%,此時(shí)的膜污染度處于一個(gè)相對(duì)平穩(wěn)期,由較高的膜污染度降到較低的程度,而也正是在60 min時(shí),膜的滲透通量呈現(xiàn)出逐漸增大的趨勢(shì),因此選定超濾時(shí)間為60 min。

在超濾壓力為0.16 MPa、液體流速為2.5 mL/s、超濾時(shí)間為60 min的條件下,有最大的滲透通量為25.98 L/m2·h和最小的膜污染度為0.021。

3 討論與結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)可知,采用陰陽離子混合床法對(duì)葵花籽粕多肽酶解液進(jìn)行脫鹽處理,酶解液pH的高低、陰陽離子交換樹脂的比例和過柱速度快慢都直接影響到酶脫鹽率及抗氧化性,雖然使用此方法抗氧化性在一定程度上有所降低,但脫鹽率有很大提高。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的相關(guān)數(shù)據(jù)表明,使用3 kDa的超濾膜進(jìn)行多肽的過濾是一種較為理想的方法,這一定程度上是因?yàn)槎嚯牡目寡趸芰ΩS分子量的變化而產(chǎn)生相應(yīng)的變化,分子量小反而抗氧化能力較強(qiáng),說明了小分子的肽段更具有較強(qiáng)的抗氧化性。但隨時(shí)間推移,過多的大分子物質(zhì)在膜孔壁聚集,致使?jié)B透通量下降、膜污染度升高。同理,前期的壓力大、流速快,膜滲透通量較大,相應(yīng)的膜污染度亦較小;后期的壓力較大、流速較快,致使膜前大分子物質(zhì)迅速聚集,造成膜滲透通量降低、膜污染度較高。

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