錢 敏,李春陽,*,劉玉皎,王 帆,陳 新,吳 寒

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江蘇南京 210014;3.青海省農(nóng)林科學(xué)院,青海西寧 810000;4.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所,江蘇南京 210014)

蠶豆在我國已有二千年栽培史[1],是我國目前種植面積和產(chǎn)量位居第三的食用豆類作物,僅次于大豆和花生[2],分別占世界蠶豆種植面積和總產(chǎn)量的53.8%和64.1%[3]。中醫(yī)認為蠶豆的花、果實、種殼,及葉均可入藥,有止血,利尿解毒,消腫之功效,并且國外已有用蠶豆提取抗癌物質(zhì)的報道[4]。有研究證明蠶豆中含有豐富的酚類化合物,具有降低小鼠心血管疾病的風險,可作為很好的天然抗氧化食物和功能食物的來源[5]。

目前,國內(nèi)對豆類酚類物質(zhì)研究較多,主要是比較不同品種豆類多酚含量及其抗氧化活性[6-8],李思荻等[7]研究發(fā)現(xiàn),合豐大豆和白蕓豆對羥基自由基的清除能力強于其他豆類,提取液中的多酚含量與其抗氧化性成正相關(guān)關(guān)系。國外對于蠶豆多酚的研究主要集中在其抗氧化活性[9-11]及酚類物質(zhì)組成成分分析[12-14],Marathe等[9]研究表明,表皮顏色較深的雜豆抗氧化性較強,且抗氧化性強弱與豆中所含酚類物質(zhì)有關(guān),Journi等[12]從蠶豆多酚中鑒定出槲皮素糖苷、表兒茶素糖苷等五種成分,Merghem等[13]利用電子噴霧質(zhì)譜及高效液相色譜技術(shù)從蠶豆原花青素中分離鑒定出原花青素二聚物B1、B2和B3及原花青素三聚物等六種主要化合物。

由于超聲提取具有操作簡單方便、提取率高、提取溫度低、不破環(huán)提取物結(jié)構(gòu)等特點,已廣泛用于提取天然植物有效成分,如橙皮多酚的提取[15]、海棠葉中總黃酮的提取[16]、茶多酚的提取[17]、獼猴桃根熊果酸的提取[18]、大豆異黃酮的提取[19]等。目前有關(guān)蠶豆多酚的提取主要還是溶劑浸提法,關(guān)于超聲波輔助提取蠶豆多酚工藝優(yōu)化的報道尚不多見。因此本文將系統(tǒng)優(yōu)化蠶豆多酚超聲提取工藝,并在已有報道的基礎(chǔ)上考慮了提取液的pH對多酚提取量的影響,以期獲得適宜的提取方法,為將來工業(yè)化高效提取蠶豆中酚類物質(zhì)提供參考,以便進行蠶豆的保健品開發(fā)和蠶豆抗氧化劑制品的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘇蠶三號 由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜所提供;甲醇、乙醇、丙酮、無水碳酸鈉 均為國產(chǎn)分析純;沒食子酸標準品與Folin-Ciocalteu試劑 購自Sigma公司。

AL104型電子天平 梅特勒托利多儀器有限公司;KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;Sigma 3K15離心機 德國Sigma公司;RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;萬能高速粉碎機 歐凱萊芙(香港)寶業(yè)公司;PHS-2C型數(shù)顯pH計 上海智光儀器儀表公司;752S型紫外可見分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 沒食子酸標準曲線的制作 配制濃度為1 mg/mL的沒食子酸標準溶液,分別吸取1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、10.00 mL于100 mL容量瓶中定容,得10、20、30、40、50、100 μg/mL的沒食子酸標準溶液,移取1 mL沒食子酸標準溶液于試管中,加入5 mL蒸餾水,1 mL 10%福林酚,反應(yīng)3 min后加3 mL 7.5% Na2CO3,室溫下放置2 h,于765 nm處測吸光值[20]。以濃度(X)對吸光度(Y)進行線性回歸分析,繪制出沒食子酸標準曲線。

求得回歸方程為Y=0.0088X+0.0558(0～100 μg/mL,R2=0.9996),其中X為沒食子酸濃度,單位為μg/mL,Y為吸光度。

1.2.2 蠶豆多酚的提取及含量測定 將蠶豆冷凍干燥(-20 ℃預(yù)凍6 h,-80 ℃冷凍20 h,放入凍干機中,在冷阱溫度為-45 ℃,真空度為13.3 Pa、加熱隔板溫度為30 ℃左右冷凍干燥24 h),用萬能粉碎機將蠶豆粉碎,過60目篩,制得蠶豆粉(水分含量2.98%±0.06%,w/w),-20 ℃保存?zhèn)溆谩蚀_稱取1 g蠶豆粉,按料液比1∶15 (g/mL)加入60%乙醇溶液進行超聲提取,超聲功率300 W,超聲溫度35 ℃,提取20 min后4500 r/min離心10 min,收集上清液,殘渣用同樣的方法再次提取,合并兩次上清液,45 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸干,甲醇定容至10 mL,-20 ℃避光儲存,用于多酚含量的測定。多酚提取量以每克提取物(干基)中所含相當于沒食子酸的量mg表示。

式中:C為測量液總酚濃度(μg/mL);V為提取液的總體積(mL);N為稀釋倍數(shù);M為樣品除去水分質(zhì)量(g);1000為質(zhì)量轉(zhuǎn)化單位(mg/μg)。

1.2.3 提取劑種類的選擇 準確稱取1 g蠶豆粉,按料液比1∶15 (g/mL)的比例分別加入體積分數(shù)均為60%的甲醇、乙醇、丙酮,用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)至pH4(下文同),在300 W、35 ℃下超聲提取20 min,提取兩次,研究不同提取劑種類對蠶豆多酚提取效果的影響。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 乙醇體積分數(shù)對提取效果的影響 準確稱取1 g蠶豆粉,按料液比1∶15 (g/mL)分別加入pH4,不同濃度的乙醇水溶液(20%、40%、60%、80%、100%),300 W、35 ℃下超聲提取20 min,提取兩次,研究乙醇體積分數(shù)對蠶豆多酚提取效果的影響。

1.2.4.2 料液比對提取效果的影響 準確稱取1 g蠶豆粉,分別加入10、15、20、25、30 mL體積分數(shù)為60%、pH4的乙醇水溶液,300 W、35 ℃下超聲提取20 min,提取兩次,研究料液比對蠶豆多酚提取效果的影響。

1.2.4.3 提取時間對提取效果的影響 準確稱取1 g蠶豆粉5份,分別加入15 mL體積分數(shù)為60%、pH4的乙醇溶液。300 W、35 ℃下超聲提取10、15、20、25、30 min,提取兩次,研究提取時間對蠶豆多酚提取效果的影響。

1.2.4.4 提取液pH對提取效果的影響 準確稱取1 g蠶豆粉,分別加入15 mL體積分數(shù)為60%不同pH3、4、5、6、7、8、9的乙醇溶液,300 W、35 ℃下超聲提取20 min,提取兩次,研究pH對蠶豆多酚提取效果的影響。

1.2.5 響應(yīng)面實驗設(shè)計 根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計原則,以乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間、pH四個因素為自變量,多酚提取量為響應(yīng)值,設(shè)計了四因素三水平的響應(yīng)面分析實驗,各因素水平見表1。

表1 Box-Benhnken響應(yīng)面實驗因子與水平Table 1 Variables and levels in response surface design

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復(fù)三次,實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差(Means±SD)表示,采用Excel 2003軟件作圖,使用SAS 9.3 軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進行處理分析,設(shè)置顯著水平為p<0.05,極顯著水平為p<0.01。中心組合實驗數(shù)據(jù)處理使用Design Expert 8.0.6軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑種類對提取效果的影響

從圖1可以看出,60%不同提取劑的提取效果依次為:乙醇>甲醇>丙酮,且乙醇的成本較低、環(huán)境友好,所以本文選擇乙醇作為提取溶劑。在楊希鵑等[21]的蠶豆多酚提取實驗中,60%甲醇的提取率高于60%乙醇,這可能是因為不同品種蠶豆中的酚類物質(zhì)組成不同,導(dǎo)致極性不同,對甲醇和乙醇的親和性不同,從而導(dǎo)致最佳提取溶劑種類有差異。

圖1 提取劑種類對多酚提取量的影響Fig.1 The influence of the type of extracting solution on extraction volume

2.2 單因素實驗結(jié)果與分析

2.2.1 乙醇體積分數(shù)對提取效果的影響 由圖2可以看出,隨著乙醇濃度增大,多酚提取量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,當乙醇濃度達到40%時,提取量最大。分析原因可能是蠶豆中多酚與多糖、蛋白質(zhì)等以氫鍵和疏水鍵形成穩(wěn)定的化合物,隨著乙醇濃度升高,對氫鍵斷裂作用越強,多酚提取量升高[22]。然而,當乙醇濃度超過40%時,多酚提取量下降,根據(jù)相似相溶原理推測可能是由于溶劑與多酚極性差異增大,多酚類物質(zhì)得不到充分溶解,提取量反而下降。本文中多酚提取量隨乙醇體積分數(shù)的變化趨勢與王文昕等[23]的響應(yīng)面法優(yōu)化花生紅衣多酚提取的報道是相符的。因此本文選擇乙醇體積分數(shù)為40%。

圖2 乙醇體積分數(shù)對多酚提取量的影響Fig.2 The influence of the concentration of the extracting solution on extraction volume

2.2.2 料液比對提取效果的影響 由圖3可以看出,當料液比小于1∶25 (g/mL)時,隨料液比增大,蠶豆多酚提取量增大,這可能是因為,蠶豆組織中多酚與蛋白質(zhì)、生物堿、多糖等以氫鍵等形式結(jié)合在一起,阻礙多酚類物質(zhì)的提取,而有機溶劑和水的混合液能有效的抑制這種結(jié)合,因此提取液增大有利于蠶豆多酚的提取。但當料液比達到1∶25 (g/mL)以后,再增大溶劑的用量,多酚提取量下降,而且溶劑用量太大,會使熱負荷增大,提取完全所需要的時間增大[24]。在郭彩霞等[25]的響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助提取獼猴桃果皮多酚實驗中也觀察到類似現(xiàn)象。因此本文選擇的料液比為1∶25 (g/mL)。

圖3 料液比對提取量的影響Fig.3 The influence of the solid-liquid ratio on extraction volume

2.2.3 提取時間對提取效果的影響 由圖4可以看出,當提取時間從5 min增加到20 min時,多酚提取量由1.31 mg/g d.w.增加至1.74 mg/g d.w.。這可能是因為超聲波提取能加速介質(zhì)質(zhì)點運動,同時產(chǎn)生空化作用,使提取物質(zhì)加速浸出[26],當超聲時間大于20 min時,多酚提取量呈下降趨勢,這可能與超聲的時間過長,產(chǎn)生熱效應(yīng)使溫度升高,從而使得多酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)被破環(huán)有關(guān)[27]。在Yang等[28]的響應(yīng)面法優(yōu)化余甘子樹皮多酚及Sun等[29]的響應(yīng)面法優(yōu)化苦丁茶中酚類物質(zhì)提取的實驗中也觀察到類似現(xiàn)象。因此,選擇超聲提取時間為20 min。

圖4 提取時間對多酚提取量的影響Fig.4 The influence of the extracting time on extraction volume

2.2.4 提取液pH對提取效果的影響 由圖5可以看出,不同的pH對提取效果有顯著的影響,當pH為5時,多酚提取量最大。這可能是由于在酸性條件下多酚與酸形成佯鹽,以離子形式存在,容易析出;而且在酸性條件下多酚氧化酶的活性受到抑制,從而抑制了多酚在提取過程中的酶促氧化,進而提高了多酚的提取率。與趙謀明等[30]報道的多酚提取量隨pH變化趨勢相符。因此本文選擇pH5為適宜pH。

圖5 提取液pH對多酚提取量的影響Fig.5 The influence of the pH on extraction volume

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

2.3.1 二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析 響應(yīng)面設(shè)計與結(jié)果見表2。應(yīng)用Design Expert 進行回歸擬合分析,得到提取條件與多酚提取量之間的二次多項式模型為:

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and results

Y=2.17-(9.167E-003)A-0.028B+0.064C-0.026D-0.057AB-0.053AC-0.057AD-0.013BC+(2.500E-003)BD+0.047CD-0.13A2-0.19B2-0.22C2-0.20D2。

表3 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗表Table 3 Test of significance for regression equation coefficients

2.3.2 兩因子間交互作用分析 響應(yīng)面分析圖見圖6～圖11。

由圖6可知,當料液比一定時,隨著乙醇體積分數(shù)的增大,提取量先增大后減小;當乙醇體積分數(shù)一定時,隨料液比的變化,提取量也呈先增大后減小趨勢,且響應(yīng)面坡度較陡峭,說明乙醇體積分數(shù)和料液比的交互作用極顯著。

圖6 乙醇體積分數(shù)和料液比及其相互作用對蠶豆多酚提取量影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for extraction volume under the concentration of the extracting solution and solid-liquid ratio

圖7表示pH為5、料液比為1∶25 (g/mL)時乙醇體積分數(shù)和時間對蠶豆多酚提取量的影響。當時間一定時,隨乙醇體積分數(shù)變化,多酚提取量變化不明顯,趨勢較平緩;當乙醇體積分數(shù)一定時,隨時間變化,提取量先增后減,且弧度較陡,說明時間的主效應(yīng)大于乙醇體積分數(shù)。

圖7 乙醇體積分數(shù)和時間及其相互作用對蠶豆多酚提取量影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots for extraction volume under the concentration of the extracting solution and extracting time

圖8表示當料液比為1∶25 (g/mL)、提取時間為20 min時,乙醇體積分數(shù)和pH對蠶豆多酚提取量的影響。當pH一定時,隨乙醇體積分數(shù)的變化,提取量先增后減,趨勢較平緩;當乙醇體積分數(shù)一定時,隨pH變化,提取量先增大后減小,幅度較陡峭,說明pH的主效應(yīng)大于乙醇體積分數(shù),又等高線圖呈橢圓形,說明兩者間交互作用顯著。

圖8 乙醇體積分數(shù)和pH及其相互作用對蠶豆多酚提取量影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots for extraction volume under the concentration of the extracting solution and pH

圖9表示當乙醇體積分數(shù)為45%、pH為5時,料液比和時間對蠶豆多酚提取量的影響。當時間一定時,隨料液比的增大,蠶豆提取量先增大后減小;當料液比一定時,隨時間變化,料液比先增后減。由等高線為圓形,可知兩者交互作用不顯著。

圖9 料液比和時間及其相互作用對蠶豆多酚提取量影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots for extraction volume under solid-liquid ratio and extracting time

圖10表示乙醇體積分數(shù)為45%、提取時間為20 min時,料液比和pH對蠶豆多酚提取量的影響。當pH一定時,隨料液比升高,提取量先增后減;當料液比一定時,隨pH變化,提取量先升高后降低。由其等高線呈圓形,可知兩者交互作用不顯著。

圖10 料液比和pH及其相互作用 對蠶豆多酚提取量影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.10 Response surface and contour plots for extraction volume under solid-liquid ratio and pH

圖11表示乙醇體積分數(shù)為45%、料液比為1∶25 (g/mL)時,時間和pH對蠶豆多酚提取量的影響。當pH一定時,隨時間升高,提取量先增后減;當時間一定時,隨pH變化,提取量先升高后降低。

圖11 時間和pH及其相互作用 對蠶豆多酚提取量影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.11 Response surface and contour plots for extraction volume under extracting time and pH

2.3.3 最佳條件的預(yù)測及驗證實驗 通過響應(yīng)面優(yōu)化得到超聲波提取蠶豆多酚的最佳提取工藝條件為:乙醇體積分數(shù)44.71%、料液比1∶23.89 (g/mL)、時間20.09 min、pH4.8,此時蠶豆多酚提取量達到最大值(2.06±0.23) mg/g d.w.。為方便實際操作,各條件調(diào)整為:乙醇體積分數(shù)45%、料液比1∶25 (g/mL)、時間20 min、pH5,在此條件下進行驗證,測得蠶豆多酚提取量為(2.03±0.16) mg/g d.w.,與預(yù)測值(2.06±0.23) mg/g d.w.誤差值為1%,證實了該模型的有效性。本實驗多酚提取量與楊希鵑等[21]在正交優(yōu)化條件甲醇體積分數(shù)60%,料液比1∶15 (g∶mL),超聲波功率300 W 的條件下提取 20 min,得到的蠶豆多酚提取量47.78 mg/100 g d.w.相比較高,推測可能是因為本實驗考慮了提取溶劑的pH,有機酸的添加促進了結(jié)合酚的釋放,從而提高了總酚的含量;該值與鞏藹[8]報道的用60%乙醇溶液水浴浸提3 h得到的蠶豆多酚含量值0.25%相近,但與Siah[31]用70%丙酮提取得到的多酚提取量6.2～10.7 mg/g d.w.、趙艷等[6]用70%丙酮(丙酮∶水∶乙酸=70∶29.5∶0.5,V/V/V)在25 ℃下振蕩3 h得到的總酚提取量5.80～8.37 mg/g d.w.實驗值相比還是較低,結(jié)果的差異可能與蠶豆品種、生長環(huán)境、栽培條件以及實驗方法等的不同都有很大關(guān)系。

3 結(jié)論

本實驗采用單因素實驗及響應(yīng)面Box-Benhnken實驗設(shè)計,對超聲輔助提取蠶豆多酚工藝進行優(yōu)化,得到的最佳工藝條件為:乙醇體積分數(shù)45%、料液比1∶25 (g/mL)、提取時間20 min、pH5,在此條件下蠶豆多酚提取量為(2.03±0.16) mg/g d.w.,與預(yù)測值(2.06±0.23) mg/g d.w.高度相符,模型可靠。

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