王 雅,杜國(guó)英,鄒紅梅,馬敏倩

(蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730050)

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1),是一種含銅的氧化還原酶,廣泛分布于生物體內(nèi)。酪氨酸酶在黑色素生物合成的過(guò)程中起第一限速酶和第三功能酶的作用,是黑色素合成的關(guān)鍵酶。它主要參與反應(yīng)過(guò)程:催化L-酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)-多巴和將L-多巴氧化為多巴醌,再通過(guò)一系列的反應(yīng)形成黑色素[1-2]。酪氨酸酶活性的大小與生成黑色素的量成正比[3]。因此,酪氨酸酶在皮膚增白方面具有很大的研究?jī)r(jià)值。孜然(CuminumcyminumL.),又名孜然芹、安息孜然、枯茗等。屬于一年或兩年生的傘形科孜然芹屬植物,是亞洲、非洲和歐洲傳統(tǒng)的中草藥和調(diào)味料之一,具有較高的藥用和食用價(jià)值,在我國(guó)主要分布于新疆[4]。目前,國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)孜然具有降血糖、抑菌、抗氧化[5-7]等生物活性。但關(guān)于孜然抑制酪氨酸酶活性方面的研究鮮有報(bào)道。

本文在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以響應(yīng)面法優(yōu)化孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶的提取工藝,并研究了各極性部位對(duì)酪氨酸酶的抑制效果及主要活性成分的含量,以期為孜然抑制酪氨酸酶活性的作用機(jī)理和將孜然開(kāi)發(fā)為皮膚美白劑提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

孜然 蘭州黃河藥材市場(chǎng);L-酪氨酸、蘑菇酪氨酸酶(≥1000 U/mg)、Folin-Ciocalteu試劑、蘆丁、薯蕷皂苷元、葡萄糖 Sigma-Aldrich公司;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 天津天新精細(xì)化工開(kāi)發(fā)中心;其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

DNM-9602酶標(biāo)分析儀 北京普朗新技術(shù)有限公司;Scientz-N 真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;L-550/L550臺(tái)式低速離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司;DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;752N紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 孜然乙醇提取物的制備 孜然經(jīng)粉碎后過(guò)60目篩,稱取5.00 g的孜然粉末,按設(shè)定的液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和提取溫度回流提取后,離心,收集上清液,減壓濃縮,冷凍干燥,備用。

1.2.2 酪氨酸酶抑制活性的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[8]的方法,并稍作修改。吸取80 μL的樣品溶液(0.8 mg/mL)加到96孔酶標(biāo)板中,再加入預(yù)先在37 ℃保溫的100 μL的L-酪氨酸溶液(2 mmol/L),振蕩混勻,在37 ℃恒溫箱中放置10 min后,加入40 μL的酪氨酸酶溶液(40 μg/mL),混勻繼續(xù)在37 ℃反應(yīng)10 min,然后迅速用酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm處的吸光度AC1,AC2,AT1,AT2,按下式計(jì)算樣品對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率:

式中,AC1為未加樣品的加酶混合液在492 nm處的吸光度值;AC2為未加樣品和酶的混合液在492 nm處的吸光度值;AT1為加樣品和酶的混合液在492 nm處的吸光度值;AT2為加樣品而未加酶的混合液在492 nm處的吸光度值。

1.2.3 孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇 液料比為20∶1 (mL/g),提取時(shí)間為1.5 h,提取溫度為80 ℃,考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%)對(duì)孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的影響。

1.2.3.2 液料比的選擇 乙醇體積分?jǐn)?shù)由1.2.3.1確定,提取時(shí)間為1.5 h,提取溫度為80 ℃,考察不同液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1 mL/g)對(duì)孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的影響。

1.2.3.3 提取時(shí)間的選擇 乙醇體積分?jǐn)?shù)由1.2.3.1確定,液料比由1.2.3.2確定,提取溫度為80 ℃,考察不同提取時(shí)間(1、1.5、2、2.5、3 h)對(duì)孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的影響。

1.2.3.4 提取溫度的選擇 乙醇體積分?jǐn)?shù)由1.2.3.1確定,液料比由1.2.3.2確定,提取時(shí)間由1.2.3.3確定,考察不同提取溫度(50、60、70、80、90 ℃)對(duì)孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的影響。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理,以酪氨酸酶抑制率為響應(yīng)值,以乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度、提取時(shí)間等因素為自變量,進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),得到孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的最佳工藝條件。因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素及水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels for response surface analysis

1.2.5 孜然乙醇提取物中主要活性成分的含量測(cè)定 多酚含量的測(cè)定采用Folin-Ciocalteu比色法[9],以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品。黃酮含量的測(cè)定采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法[10],以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品。多糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸比色法[11],以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品。皂苷含量的測(cè)定采用香草醛比色法[12],以薯蕷皂苷元為標(biāo)準(zhǔn)品。各活性成分的含量計(jì)算公式分別如下:

1.2.6 孜然乙醇提取物不同極性部位對(duì)酪氨酸酶活性的影響 按1.2.4得到的最佳提取條件獲得孜然乙醇提取物后,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取3次,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑,冷凍干燥后,按1.2.2的方法測(cè)定各極性部位對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率,計(jì)算IC50(酪氨酸酶抑制率達(dá)到50%時(shí)的樣品濃度),曲酸做陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均做三次重復(fù),實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示,響應(yīng)面設(shè)計(jì)及分析由Design-Expert 8.0.6.1完成,數(shù)據(jù)處理及繪圖由Origin 9.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的影響 由圖1可知,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大,孜然乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率呈先增大后減小的趨勢(shì),乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí),抑制率達(dá)最大,之后又開(kāi)始下降?？赡苁且掖俭w積分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)提取溶劑的極性小,使孜然中抑制酪氨酸酶活性的成分不易溶出所導(dǎo)致的[13],因此70%乙醇為最佳提取溶劑。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on tyrosinase inhibition of ethanol extract from cumin

2.1.2 液料比對(duì)孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的影響 由圖2可知,隨著液料比的增大,孜然乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率呈增大趨勢(shì),當(dāng)液料比達(dá)到15∶1 (mL/g)時(shí)抑制率最大,之后基本保持不變?？赡苁请S著液料比的增大,會(huì)加快提取過(guò)程中液相和固相濃度差減小的速度,從而加快有效成分的溶出,從節(jié)約成本、提高效率的角度考慮,液料比不宜過(guò)大,故確定最佳液料比為15∶1 (mL/g)。

圖2 液料比對(duì)孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on tyrosinase inhibition of ethanol extract from cumin

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的影響 由圖3可知,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),孜然乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),當(dāng)提取時(shí)間為2 h時(shí)，抑制率達(dá)最大,之后略有下降?？赡苁请S著提取時(shí)間的延長(zhǎng),孜然中抑制酪氨酸酶的成分逐漸溶到乙醇中,但提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng),有些活性成分會(huì)在長(zhǎng)時(shí)間的有氧及高溫條件下受到破壞,導(dǎo)致抑制率下降,所以最佳提取時(shí)間確定為2 h。

圖3 提取時(shí)間對(duì)孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的影響Fig.3 Effect of extraction time on tyrosinase inhibition of ethanol extract from cumin

2.1.4 提取溫度對(duì)孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的影響 由圖4可知,隨著溫度的升高,孜然乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率呈先增加后減小的趨勢(shì),在80 ℃時(shí)抑制率達(dá)最大值,之后又有所下降?？赡苁窃谝欢ǖ臏囟确秶鷥?nèi),隨著溫度升高,具有活性的物質(zhì)溶解度會(huì)加大,但是超過(guò)一定溫度后,部分活性物質(zhì)會(huì)被破壞[14],導(dǎo)致抑制能力減弱,故確定最佳提取溫度為80 ℃。

圖4 提取溫度對(duì)孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on tyrosinase inhibition of ethanol extract from cumin

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理,結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),以獲得孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的最佳提取條件。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and test results of response surface

2.2.2 回歸方程擬合及方差分析 用Design-Expert 6.0軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合,得到四個(gè)因素的二次多元回歸方程:

Y=42.75+0.49A+0.79B+1.10C+1.44D-0.59AB+0.31AC+1.18AD-0.71BC+0.25BD+0.74CD-2.50A2-1.66B2-2.38C2-3.16D2

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of varlance of the regression model

一次項(xiàng)中液料比、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)酪氨酸酶抑制率的影響極顯著(p<0.01),乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)酪氨酸酶抑制率的影響顯著(p<0.05)。二次項(xiàng)中四因素對(duì)酪氨酸酶抑制率的影響均極顯著(p<0.01)。交互項(xiàng)中乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度的交互作用對(duì)酪氨酸酶抑制率的影響極顯著(p<0.01),其他各因素兩兩之間的交互作用對(duì)酪氨酸酶抑制率的影響均不顯著(p>0.05)。

由F值可知,各個(gè)因素對(duì)酪氨酸酶抑制率的影響程度的次序?yàn)?D(提取溫度)>C(提取時(shí)間)>B(液料比)>A(乙醇體積分?jǐn)?shù))

2.2.3 響應(yīng)面圖分析 利用 Design-Expert 8.0.6.1軟件作出各因素之間交互作用的響應(yīng)面圖。等高線的形狀越接近橢圓,表示兩因素交互作用越顯著,接近圓形則與之相反。響應(yīng)面曲面越陡,中心投影點(diǎn)越靠近橢圓中心,表示兩因素交互作用越顯著[15]。圖5所示為固定液料比和提取時(shí)間為零水平時(shí),乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度的交互作用對(duì)酪氨酸酶抑制率的影響極顯著。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度的交互作用對(duì)酪氨酸酶抑制率的響應(yīng)面圖Fig.5 The interactive effects of ethanol concentration and extraction temperature on tyrosinase inhibition rate

隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度的增加,酪氨酸酶抑制率也在不斷的增大,當(dāng)增加到中心區(qū)域時(shí),抑制率達(dá)到最大,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度的繼續(xù)增加,提取率又隨之減小,且提取溫度的上升幅度大于乙醇體積分?jǐn)?shù)的上升幅度,說(shuō)明提取溫度對(duì)酪氨酸酶抑制率的影響較乙醇體積分?jǐn)?shù)顯著。而其余各因素間的交互作用對(duì)酪氨酸酶抑制率的影響均不顯著,因此沒(méi)有在此提供交互作用影響不顯著的響應(yīng)面圖。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由Design-Expert 8.0.6.1軟件從回歸模型中得出最佳提取條件:乙醇體積分?jǐn)?shù)71.41%,液料比15.68∶1 (mL/g),提取時(shí)間2.16 h,提取溫度為83.37 ℃,該條件下酪氨酸酶抑制率達(dá)到理論最大值43.20%。為驗(yàn)證響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性并考慮到實(shí)際操作的可行性,將提取條件修正為:乙醇體積分?jǐn)?shù) 71%,液料比16∶1 (mL/g),提取時(shí)間2.2 h,提取溫度為83 ℃。用修正后的條件進(jìn)行三次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),測(cè)得實(shí)際酪氨酸酶抑制率為(42.61%±0.56%),基本接近于預(yù)測(cè)值(43.20%)。說(shuō)明該模型與實(shí)際情況擬合較好,證明了實(shí)驗(yàn)的可靠性。

2.4 孜然乙醇提取物中主要活性成分的含量

分別以沒(méi)食子酸、蘆丁、薯蕷皂苷元、葡糖糖作為標(biāo)準(zhǔn)品,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)溶液取樣量(mL)與吸光值的4個(gè)回歸方程:Y=0.3521X+0.0020,R2=0.9983;Y=0.2120X+0.0040,R2=0.9991;Y=0.4752X+0.0054,R2=0.9992;Y=0.1820X+0.0014,R2=0.9984。經(jīng)計(jì)算,由表4可知,孜然乙醇提取物中黃酮和多糖的含量較高,皂苷含量較低。

表4 孜然乙醇提取物中主要成分的含量Table 4 The content of main components of cumin ethanol extract

已研究發(fā)現(xiàn)植物提取物中的多種活性成分,如酚類、黃酮類、有機(jī)酸、多糖類等具有美白潛力,其中多酚類和黃酮類物質(zhì)具有較大的美白潛力,因?yàn)樗鼈兣c酪氨酸酶的底物(酪氨酸或多巴)有著相似的結(jié)構(gòu),可以作為底物類似物結(jié)合酪氨酸酶,從而減弱底物與酪氨酸酶的結(jié)合能力,達(dá)到減少黑色素生成的目的[16-17]。

2.5 孜然乙醇提取物不同極性部位對(duì)酪氨酸酶活性的影響

由表5和表6可知,孜然乙醇提取物不同極性部位對(duì)酪氨酸酶活性的抑制能力均比曲酸(陽(yáng)性對(duì)照)弱,但也有較好的抑制作用。可能是孜然乙醇提取物相對(duì)來(lái)說(shuō)是粗提取,其中含有一些雜質(zhì)或具有拮抗作用的成分,從而造成孜然乙醇提取物不同極性部位對(duì)酪氨酸酶活性的抑制效果不是很突出[18]。各相對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率隨著濃度的增大而增大,IC50從大到小依次為:水相、石油醚相、正丁醇相和乙酸乙酯相,表明乙酸乙酯相和正丁醇相對(duì)酪氨酸酶活性的抑制能力最好,可能是孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的成分主要集中在中等極性和極性較大的部位。多酚、黃酮、皂苷、多糖等都為極性較大的物質(zhì),因此它們都可能是孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的功效成分。

表5 不同極性部位對(duì)酪氨酸酶活性的影響Table 5 Effects of different polar fractions on tyrosinase activity

表6 曲酸對(duì)酪氨酸酶活性的影響Table 6 Effect of kojic acid on tyrosinase activity

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面設(shè)計(jì),優(yōu)化得到了孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的最佳工藝參數(shù):乙醇體積分?jǐn)?shù)71%,液料比16∶1 (mL/g),提取時(shí)間2.2 h,提取溫度83 ℃,在此優(yōu)化條件下酪氨酸酶抑制率達(dá)(42.61%±0.56%),與預(yù)測(cè)值43.20%接近。表明由響應(yīng)面法得到的孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶的提取工藝是有效可行的;孜然乙醇提取物中多酚、黃酮、皂苷、多糖四種活性成分的含量分別為(1.35%±0.03%)、(4.40%±0.29%)、(0.76%±0.04%)、(4.89%±0.28%);孜然乙醇提取物不同極性部位對(duì)酪氨酸酶活性均有抑制作用,且與濃度有依賴關(guān)系,其IC50從大到小依次為:水相>石油醚相>正丁醇相>乙酸乙酯相,表明乙酸乙酯和正丁醇部位富集了孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的主要活性成分,其抑制機(jī)理有待進(jìn)一步研究,為深入研究孜然的美白功效提供依據(jù)。

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