王興娜,吳曉紅,周 惠，余 芳，王 帆,*,陳寶宏,*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江蘇南京 210014;2.江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院工程技術(shù)學(xué)院,江蘇南京 211168)

果梅(PrunusmumeSieb. Et Zucc)為薔薇科植物,又分為白梅、青梅和紅梅[1]。我國是果梅的原產(chǎn)地,也是適合種植果梅地域最廣的國家[2]。果梅具有很強的抗氧化能力[3-6],據(jù)Han[7]等2001年報道,果梅中的蘆丁具有較強的抗氧化能力,Yan等[8]2014年報道果梅中的綠原酸具有清除過氧化氫自由基的能力。

正是由于綠原酸具有抗氧化等多種生物功能[10-15],是國際公認(rèn)的“植物黃金”,需要從植物中提取出來;而在加工過程中,綠原酸很容易與蛋白質(zhì)中的極性基團結(jié)合,影響蛋白的色澤,降低了果品的營養(yǎng)價值[16],這就需要在加工前把綠原酸去除,因此研究綠原酸的提取工藝無論在醫(yī)藥行業(yè)還是食品加工業(yè)都是很有必要的。

綠原酸含量高的植物有杜仲(樹皮中可達5%)、金銀花(花中可達5%)、向日葵(籽實中可達3%)、咖啡(咖啡豆中可含2%)、菊花(0.2%)。綠原酸提取方法主要有兩種,分別是水提法和有機溶劑提取法。其中杜仲葉綠原酸水提法的最佳工藝條件為:溫度60 ℃,料液比(g∶mL)1∶15,提取時間3 h[17]。水提法還有纖維素酶輔助法[16,18-19]。目前還是以乙醇提取法使用較多。杜仲葉中綠原酸乙醇提取法的最佳提取工藝為:乙醇濃度40%,料液比(g∶mL)1∶35,超聲波時間30 min,浸泡時間60 min,此條件下綠原酸的得率為8.0418 mg/g[20]。乙醇提取法多以超聲輔助提取[21-27]。目前尚未見果梅中綠原酸提取工藝研究的報道。

本文擬采用超聲波輔助乙醇提取果梅果肉中綠原酸,對其工藝進行優(yōu)化,并在前期研究[5]的基礎(chǔ)上,用蘆丁作陽性對照,用氧化自由基吸收能力(ORAC)為指標(biāo)，對果實中綠原酸的抗氧化活性作進一步評價,以期為果梅中綠原酸的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

果梅 品種為軟條紅梅,采自國家果梅種質(zhì)資源圃(南京);綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品 南京景竹生物有限公司;AAPH(偶氮二異丁脒鹽酸鹽)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司;Trolox(水溶性維生素E) 美國Acros Organics公司;熒光素鈉、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、PBS、無水乙醇、NaOH試劑、稀硫酸等 均為國內(nèi)分析純。

多功能酶標(biāo)儀 Mirotek Laborsystem GmbH,Overath Germany;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA 上海亞榮生化儀器廠;電子天平TE214S 德國賽多利斯股份公司;HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;MP3002電子天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司;800-1離心機 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;KQ-300DE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;UV5500紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;控溫多用組織搗碎機 江陰市保利科研有限公司;JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;微機型pH計 上海康儀儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 綠原酸的提取 果梅果實去核后每份10.0 g稱量好,剪碎、搗碎后加入不同體積、不同濃度的酸乙醇(用稀鹽酸和NaOH調(diào)整)浸泡24 h后,用300 W超聲波在不同溫度下輔助提取綠原酸20～60 min。綠原酸提取液在25 ℃經(jīng)4000 r·min-1離心10 min,取上層清液于25 mL容量瓶中,經(jīng)多次洗滌離心后,用60%乙醇定容至刻度,取其中的1 mL用60%乙醇稀釋至25 mL,用紫外分光光度法在328 nm測定提取液的吸光值(A)。

1.2.2 綠原酸提取量的測定

1.2.2.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 配制系列濃度為0.0004、0.0008、0.0012、0.0016、0.002、0.0024、0.0028 mg·mL-1的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。在328 nm處測定吸光度,以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo),以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C為橫坐標(biāo),繪制綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 綠原酸提取量的計算 以對應(yīng)濃度的乙醇溶液為空白對照。將A代入1.2.2.1得到的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到稀釋后的綠原酸含量(C)。綠原酸提取含量η(mg/10 g)按以下公式計算:

η=C×25×25/M

式中,C-稀釋后綠原酸濃度(mg·mL-1);M-果梅肉鮮重(g);一個25為稀釋倍數(shù);一個25為體積(mL)。

1.2.3 果梅肉綠原酸提取單因素實驗 準(zhǔn)確取果梅果肉10.0 g,加入乙醇進行提取,分別以乙醇濃度、pH、料液比、超聲時間、超聲溫度、提取次數(shù)作為因素,每次以一個因素為變量,其它定量,分別測定提取液的吸光值,并計算綠原酸提取量。

1.2.3.1 乙醇濃度對果梅肉綠原酸提取效果的影響 準(zhǔn)確稱取果梅果肉10.0 g,5份,按料液比(g∶mL)1∶6的比例分別加入40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液,調(diào)pH=4。浸泡24 h后,在50 ℃下,300 W超聲30 min。共提取2次。

1.2.3.2 料液比對果梅肉綠原酸提取效果的影響 準(zhǔn)確稱取果梅果肉10.0 g,5份,按料液比(g∶mL)1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8分別加入60%乙醇,調(diào)pH=4。浸泡24 h后,50 ℃用300 W超聲輔助提取30 min。共提取2次。

1.2.3.3 超聲時間對果梅肉綠原酸提取效果的影響 準(zhǔn)確稱取果梅果肉10.0 g,5份,按料液比1∶6(g∶mL)加入60%乙醇溶液,調(diào)節(jié)pH=4。浸泡24 h后,分別在50 ℃用300 W超聲輔助提取20、30、40、50、60 min。共提取2次。

1.2.3.4 pH對果梅肉綠原酸提取效果的影響 準(zhǔn)確稱取果梅果肉10.0 g,5份,按料液比(g∶mL)1∶6加入60%乙醇溶液,分別調(diào)pH=2、3、4、5、6。浸泡24 h后,在50 ℃用300 W超聲輔助提取30 min。共提取2次。

1.2.3.5 超聲溫度對果梅肉綠原酸提取效果的影響 準(zhǔn)確稱取果梅果肉10.0 g,5份,按料液比(g∶mL)1∶6分別加入60%乙醇溶液,調(diào)節(jié)pH=4。浸泡24 h后,300 W超聲輔助提取30 min,超聲溫度分別為20、30、40、50、60 ℃。共提取2次。

1.2.3.6 提取次數(shù)對果梅肉綠原酸提取效果的影響 準(zhǔn)確稱取果梅果肉10.0 g,8份,按料液比(g∶mL)1∶7分別加入60%乙醇溶液,調(diào)節(jié)pH=4。浸泡24 h后,在50 ℃用300 W超聲輔助提取30 min。分別提取1、2、3、4、5、6、7、8次。

1.2.4 正交實驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,按表1因素水平表進行正交實驗設(shè)計,以優(yōu)化提取條件。每個處理重復(fù)三次。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.5 綠原酸氧化自由基的吸收能力(ORAC)測定 在96微孔板上加入100 μL不同濃度的綠原酸待測液,同時加入不同濃度的Trolox做對照,再用12道移液器在每孔中加入50 μL 200 nmol/L熒光素鈉混合,37 ℃反應(yīng)15 min后,向每孔中加入50 μL 80 mmol/L的AAPH,誘發(fā)熒光淬滅。使用酶標(biāo)儀的實驗設(shè)置參數(shù)為:激發(fā)波長485 nm,發(fā)射波長528 nm,37 ℃;循環(huán)數(shù):35;循環(huán)周期:210 s;振蕩:8 s;振蕩幅度:4 mm。

ORAC值=[(AUC樣品-AUCAPPH)/(AUCTrolox-AUCAAPH)]×(MTrolox/M樣品)

式中,AUC-熒光衰退曲線下面積(Area under curve);M-摩爾濃度(Molarity)。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

由綠原酸溶液濃度(C)和吸光值(A)作圖,得線性方程為A=77.946C+0.005(R2=0.9987),線性范圍為0.0000～0.0028 mg/mL。

圖1 綠原酸吸光值與濃度變化曲線圖Fig.1 Variation curve of absorbance and concentration of chlorogenic acid

2.2 單因素實驗結(jié)果與分析

2.2.1 不同乙醇濃度對果梅肉綠原酸提取量的影響 由圖2可知,乙醇濃度由40%提高到60%,綠原酸提取量隨著濃度的增加而增加;從60%到80%,綠原酸提取量隨著濃度的增加而減少,60%乙醇浸泡提取得到的綠原酸量最高。鄧素蘭等[28]認(rèn)為70%以上的乙醇溶液會引起綠原酸沉淀。

圖2 乙醇濃度對果梅果肉綠原酸提取量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction of chlorogenic acid from Prunus mume

2.2.2 不同料液比對果梅肉綠原酸提取量的影響 由圖3可知,料液比(g:mL)為1∶7時經(jīng)過兩次提取,提取得到15.3596 mg/10 g鮮重的綠原酸,是料液比(g:mL)為1∶9提取兩次得到綠原酸量(16.216 mg/10 g鮮重)的95%。在1∶7之前,隨著料液比的增大,綠原酸提取量較快增長;在1∶7之后,隨著液料比的增大,綠原酸提取增加量變化不大。由此可見,料液比為1∶7 (g∶mL)時,較節(jié)約且效率較高,可作為提取果梅中綠原酸合適的料液比。

圖3 料液比對提取果梅果肉中綠原酸的影響Fig.3 Effect of the ratio of material to liquid on the extraction of chlorogenic acid from Prunus mume

2.2.3 不同超聲溫度對果梅肉綠原酸提取量的影響 從圖4可以看出,用60%乙醇浸泡果梅,然后不同溫度下超聲30 min,50 ℃前隨著超聲溫度的上升,提取的綠原酸含量也越來越多,在溫度為50 ℃時,提取量達到最大;隨后溫度越高,綠原酸提取量逐漸降低。

圖4 超聲溫度對提取果梅果肉中綠原酸的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the extraction of chlorogenic acid from Prunus mume

因為綠原酸易溶解于熱水、乙醇,所以隨著溫度升高,提取量變大;但綠原酸的鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,溫度過高時易氧化分解而使提取率下降,另一方面,在水介質(zhì)中,超聲波產(chǎn)生的微射流對細胞表面產(chǎn)生沖擊、剪切,這需要密度與內(nèi)壓比高,在爆破時能形成一定高溫與強壓梯度的氣泡,溫度較高時不利于氣泡的生成,也造成提取率下降。本實驗結(jié)果證明,50 ℃的超聲溫度較適合。

2.2.4 不同超聲時間對果梅肉綠原酸提取量的影響 從圖5可以看出,用60%乙醇浸泡果梅,隨著超聲時間變長,綠原酸提取量變高,但超過30 min后,隨著超聲時間加長,提取量反而下降,需要限定超聲時間為30 min。

圖5 超聲時間對提取果梅果肉中綠原酸的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on the extraction of chlorogenic acid from Prunus mume

若要從植物中提取活性成分,需要破碎細胞壁或打通溶劑進入細胞內(nèi)的通道。細胞壁的主要成分是纖維素、半纖維素及木質(zhì)素,而超聲波能很好的降低纖維素的結(jié)晶度和聚合度,打開結(jié)晶區(qū),同時使半纖維素部分水解,并除去木質(zhì)素的包裹,打通溶劑進入細胞內(nèi)的通道,使提取時間縮短,提高綠原酸的提取率,所以30 min內(nèi),超聲有利于綠原酸的提取。但超聲提取時間過長,容易產(chǎn)生熱效應(yīng),導(dǎo)致綠原酸發(fā)生降解[29],所以綠原酸的提取量又開始下降。

2.2.5 不同pH對果梅果實綠原酸提取量的影響 從圖6可知,綠原酸提取量先隨著pH的增大而增大,在pH=4時達到最大提取量,隨后,隨著pH的增大而減小?？梢妏H=4的60%乙醇提取綠原酸效果最佳。因為綠原酸為酚酸類化合物,在酸性條件下,有利于其溶出,并且酸性條件能使原料的細胞壁軟化,因此,一般用酸乙醇進行提取。

圖6 pH對提取果梅果肉中綠原酸的影響Fig.6 Effect of pH value on the extraction of chlorogenic acid from Prunus mume

2.2.6 不同提取次數(shù)對綠原酸提取量的影響 從圖7可以看出,在最佳單因素條件下,提取8次時,綠原酸的累積提取量為20.3 mg/10 g鮮重;提取次數(shù)3次時,提取到的綠原酸的量為19.8 mg/10 g,占8次總提取量的97.4%。因此,如果為節(jié)約時間和成本,一般提取3次即可。

圖7 提取次數(shù)對提取果梅中綠原酸的影響Fig.7 Effect of extraction times on the extraction of chlorogenic acid from Prunus mume

2.3 正交實驗結(jié)果分析

由表2正交實驗均值可以得出提取工藝的最佳組合為A2B2C2D2E2F3,可知,綠原酸的最佳提取工藝是乙醇濃度為60%(A2),料液比(g∶mL)為1∶7(B2),pH為4(C2),超聲時間為30 min(D2),超聲溫度為50 ℃(E2),提取次數(shù)為4次(F3)。由極差分析結(jié)果可以看出,提取次數(shù)對果梅果實中綠原酸提取量影響最大,料液比次之,超聲溫度、pH、乙醇濃度、超聲時間的影響依次減弱。

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

驗證實驗表明,在乙醇濃度為60%,料液比(g∶mL)為1∶7,pH為4,超聲時間為30 min,超聲溫度為50 ℃時,提取3次、4次、8次時綠原酸的提取量分別為19.8 mg/10 g鮮重、20.0 mg/10 g鮮重、20.3 mg/10 g鮮重,3次、4次綠原酸的提取量分別占8次的97.4%和98.5%,考慮到3次、4次綠原酸的提取量差異小,加之時間與經(jīng)濟成本,因此,確定提取3次。最終確定最佳組合為A2B2C2D2E2F2,即乙醇濃度為60%(A2),料液比(g:mL)為1∶7(B2),pH為4(C2),超聲時間為30 min(D2),超聲溫度為50 ℃(E2),提取次數(shù)為3次(F2),此時綠原酸提取量為19.8 mg/10 g鮮重。

2.4 綠原酸ORAC測定

ORAC法以偶氮類化合物AAPH作為過氧自由源,熒光素鈉為熒光指示劑,Trolox為定量標(biāo)準(zhǔn),用酶標(biāo)儀進行分析。經(jīng)測定,綠原酸與蘆丁的ORAC值如表3。

表3 蘆丁和綠原酸的ORAC值Table 3 ORAC values of chlorogenic acid and rutin

從表3的回歸方程及相關(guān)系數(shù)可見,蘆丁和綠原酸的濃度與(AUC樣品-AUCAPPH)之間都存在良好的線性相關(guān)。回歸方程的曲線斜率可以表示各自的抗氧化能力,ORAC值就是各樣品曲線斜率與Trolox曲線斜率的比值。經(jīng)計算,綠原酸比蘆丁的ORAC值有顯著差異(0.01

3 結(jié)論

根據(jù)正交實驗和單因素實驗結(jié)果,最終確定果梅肉中綠原酸提取的最佳工藝條件為:乙醇濃度 60%、料液比(g∶mL)為1∶7、pH為4、超聲時間30 min、超聲溫度50 ℃、提取次數(shù)3次。在此提取工藝條件下,得到的綠原酸量為19.8 mg/10 g鮮重。提取過程中,除提取次數(shù)和料液比的控制很重要,可以提高綠原酸的提取量外,超聲溫度、pH的控制也非常重要。

經(jīng)測定發(fā)現(xiàn),綠原酸的氧化自由基清除能力比蘆丁強很多。可見,綠原酸在果梅中含量較高,而其對多種類型的氧化源都具有較強抗氧化能力,因此綠原酸可以作為果梅中一個重要的抗氧化功能成分加以研究。

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