郭文燕,周勝男,余雅琦,伍金娥,2,常 超,2,*

(1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖北武漢 430023;2.武漢輕工大學(xué)教育部大宗糧油精深加工省部共建重點實驗室,湖北武漢 430023)

溶菌酶(Lysozyme,LYS),又稱胞壁質(zhì)酶或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶,是一種能水解肽聚糖的堿性酶,作用靶點是連接N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺間的β-1,4糖苷鍵[1-3]。肽聚糖存在于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中,溶菌酶對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有殺滅效果[4-6]。另有報道,溶菌酶能與許多外源和內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合,從而發(fā)揮其抗菌消炎、抗病毒等作用[7-9],因此溶菌酶被廣泛應(yīng)用于多個行業(yè),如食品[10-11]、醫(yī)藥[12]等,特別用于食品防腐保鮮。目前有大量的文獻(xiàn)報道溶菌酶用于水產(chǎn)品[13-14]、肉類[15-16]、果蔬[17-18]、乳品[19]儲藏和保鮮,絕大多數(shù)是復(fù)合配方并且配方種類繁多,如何高效合理的運用溶菌酶是很多學(xué)者研究的熱點。目前有關(guān)于溶菌酶對有機(jī)溶劑、pH和溫度穩(wěn)定性的研究報道[20-25],其評價指標(biāo)大多采用酶的活性指標(biāo),較少采用對活菌的抑制率來評價,乙醇對溶菌酶活性無顯著影響[26],但溫度和pH對溶菌酶的活性有較大影響[27]。不同食品的加工條件和貯藏環(huán)境是不一樣的,因此了解溶菌酶在不同的加工條件與環(huán)境下是否保持抗菌活性對指導(dǎo)溶菌酶的使用顯得非常有意義。本文以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157∶H7為受試菌,采用溶菌酶的活菌抑制率為評價指標(biāo),系統(tǒng)評價不同溫度、pH與金屬離子對溶菌酶抗菌活性的影響,旨在闡明溶菌酶在不同條件下對病原菌抗菌活性的影響,從而為在不同食品中溶菌酶的合理利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品(20萬 U/g)、胰蛋白胨、酵母粉、硫酸鋅、氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、氯化鉀、硫酸錳 南京建成生物科技有限公司;金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)、大腸桿菌O157∶H7(EscherichiacoliO157∶H7,E.coliO157∶H7) 武漢輕工大學(xué)教育部大宗糧油精深加工省部共建重點實驗室保藏;LysogenyBroth(LB)液體培養(yǎng)基 胰蛋白胨10 g,酵母粉5 g,NaCl 10 g,蒸餾水,1000 mL,按常規(guī)制備培養(yǎng)基的方法制備,121 ℃滅菌15 min,備用;LB固體培養(yǎng)基 在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入2%左右的瓊脂。

Enspire酶標(biāo)儀 美國Enspire公司;Milli-Q超純水器 美國Millipore公司;SW-CJ-2FD雙人超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;GHP-9050隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;YXQ-LS-70A自動高壓滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶菌酶最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)的測定 精確稱取適量的溶菌酶干粉,溶于無菌水中。采用微量稀釋法測定溶菌酶MIC[28],取兩個無菌的96微孔板置于超凈臺上,將溶菌酶溶液用無菌水倍比稀釋,分別將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157∶H7兩種菌懸液調(diào)制相同濃度(106～107CFU/mL),加入對應(yīng)的96微孔板中,使溶菌酶終濃度為0.17、0.33、0.65、1.3、2.6、5.2、11、21 mg/mL,混勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,于酶標(biāo)儀600 nm測定其光密度值(OD值)[29]。利用肉眼觀察溶液的渾濁變化與OD值相結(jié)合的方法,判定MIC值。

1.2.2 不同pH對溶菌酶抗菌活性的影響 考察溶菌酶在pH4～9范圍內(nèi)的抗菌活性變化,根據(jù)1.2.1確定的溶菌酶MIC設(shè)計4個溶菌酶的作用濃度(0.65、1.3、2.6、5.2 mg/mL)。將4個不同濃度溶菌酶的pH分別調(diào)至4～9,作用一段時間后,取兩個無菌的96微孔板置于超凈臺上,將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157∶H7兩種菌懸液(106～107CFU/mL)分別與上述處理后的溶菌酶等體積加入對應(yīng)的96微孔板中,使溶菌酶的終濃度分別為0.33、0.65、1.3、2.6 mg/mL,混勻后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察溶液的渾濁情況,于酶標(biāo)儀600 nm測定OD值[29],比較不同pH下溶菌酶的抑菌穩(wěn)定性。

1.2.3 不同溫度對溶菌酶抗菌活性的影響 考察溶菌酶在4～121 ℃溫度范圍內(nèi)的抗菌活性變化。將4個不同濃度的溶菌酶分別置于4、20、40、60、80、100、121 ℃條件下處理30 min,冷卻后,按照1.2.2步驟加樣、測OD值[29],比較不同溫度處理對溶菌酶抗菌活性的影響。

1.2.4 不同金屬離子對溶菌酶抗菌活性的影響 選擇食品基質(zhì)中具有代表性的6種金屬離子考察對溶菌酶抗菌活性的影響,設(shè)計3個溶菌酶濃度,5個金屬離子濃度。分別配制0.1 mol/L KCl、NaCl、ZnSO4、MnSO4、CaCl2、MgCl2母液并高溫滅菌,倍比稀釋至工作濃度。將系列濃度的金屬離子、不同濃度的溶菌酶以及菌液分別加入對應(yīng)的96微孔板中,使金屬離子終濃度分別為0.15、1.25、2.5、5、10 mmol/L,溶菌酶終濃度分別為0.33、0.65、1.3 mg/mL?；靹蚝蠓湃?7 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察微孔中溶液的渾濁度,測定OD值,計算抑制率[30],溶菌酶對照中金屬離子濃度為0。

抑制率(%)=[(溶菌酶對照吸光值-金屬離子溶菌酶聯(lián)用吸光值)/溶菌酶對照吸光值]×100

式(1)

1.2.5 Zn2+對溶菌酶協(xié)同抗菌的驗證 根據(jù)1.2.4的結(jié)果篩選出協(xié)同效果最強(qiáng)的Zn2+,將比較對象變?yōu)榭瞻讓φ战M,驗證Zn2+對溶菌酶協(xié)同抗菌效果。設(shè)計4個Zn2+濃度0.15、0.6、2.5、10 mmol/L,3個溶菌酶濃度0.33、0.65、1.3 mg/mL。具體操作同1.2.4所示。抑制率計算[30]公式如下,空白對照中Zn2+、溶菌酶濃度均為0。

抑制率(%)=[(空白對照吸光值-Zn2+溶菌酶聯(lián)用吸光值)/空白對照吸光值]×100

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 實驗均重復(fù)3次,用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用Excel 2010和SPSS 19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性測驗(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶菌酶最小抑菌濃度

不同濃度的溶菌酶對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157∶H7抑制趨勢見圖1,溶菌酶對金黃色葡萄球菌的抑制隨著濃度的增加而增強(qiáng),當(dāng)濃度超過1.3×10-3g/mL,OD值趨于平緩,并且培養(yǎng)液澄清透明,由此判斷溶菌酶對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度為1.3×10-3g/mL,同樣的方法判斷溶菌酶對大腸桿菌O157∶H7最小抑菌濃度為2.6×10-3g/mL。由圖1變化趨勢可知,相同濃度的溶菌酶對金黃色葡萄球菌的抑制效果強(qiáng)于大腸桿菌O157∶H7,這與溶菌酶水解肽聚糖的抑菌機(jī)制有關(guān),金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁中肽聚糖的含量比大腸桿菌O157∶H7細(xì)胞壁中含量高[31]。

圖1 不同濃度溶菌酶對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157∶H7生長的影響Fig.1 Effect of different concentrations of LYS against S. aureus and E. coli O157∶H7

2.2 不同pH對溶菌酶抗菌活性的影響

4個不同濃度的溶菌酶經(jīng)過不同pH處理后對兩種細(xì)菌的抑制結(jié)果見圖2,由圖2A可知,溶菌酶在高濃度(超過MIC)時,pH變化對溶菌酶抑制大腸桿菌O157∶H7的影響較小,濃度越高,影響越小。但溶菌酶在低濃度(小于MIC)時,pH變化對溶菌酶抑制大腸桿菌O157∶H7的影響較大,隨著pH升高,OD值升高,抑制效果減弱。當(dāng)pH小于7即酸性條件,溶菌酶對大腸桿菌O157∶H7抑制效果要強(qiáng)于堿性條件,說明溶菌酶在酸性條件穩(wěn)定性較好,抑菌效果較堿性條件下顯著,這可能是在堿性條件下,溶菌酶結(jié)構(gòu)易被破壞,酶活性降低使得溶菌酶抗菌效果降低,這與劉慧研究結(jié)果基本一致[32]。對比圖2A和圖2B可知,金黃色葡萄球菌與大腸桿菌O157∶H7具有類似的變化趨勢。綜合圖2可以看出,溶菌酶在pH4～6具有更好的穩(wěn)定性,對金黃色葡萄球菌與大腸桿菌O157∶H7均具有較好的抑菌效果。這些結(jié)果表明,溶菌酶優(yōu)先用于酸性食品的儲藏保鮮,用作堿性的食品保藏時,需提高溶菌酶的濃度。

圖2 不同pH對溶菌酶抑菌活性的影響Fig.2 Effect of pH values on antibacterial activity of LYS注：A：大腸桿菌O157∶H7;B：金黃色葡萄球菌。

2.3 不同溫度對溶菌酶抗菌活性的影響

4個不同濃度的溶菌酶經(jīng)過不同溫度處理后對兩種細(xì)菌的抑制結(jié)果見圖3,由圖3可知,溶菌酶在高濃度(超過MIC)和低濃度(小于MIC)時,溫度升高,OD值波動范圍較小,說明溫度變化對溶菌酶抑制大腸桿菌O157∶H7和金黃色葡萄球菌的影響甚微,抗菌活性不受影響。該結(jié)果與Cosentino等[33]報道一致,濃縮和殺菌處理不影響溶菌酶的濃度或抗菌活性。溫度實驗結(jié)果綜合表明,溶菌酶具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性,在食品加工的溫度范圍內(nèi),其抗菌活性幾乎不受影響,適合用于冷熱食品的保藏保鮮。

圖3 不同溫度對溶菌酶抑菌活性的影響Fig.3 Effect of thermal treatments on antibacterial activity of LYS注：A：大腸桿菌O157∶H7;B：金黃色葡萄球菌。

2.4 不同金屬離子對溶菌酶抗菌活性的影響

3個不同濃度的溶菌酶經(jīng)過不同金屬離子作用后對兩種細(xì)菌的抑制結(jié)果見圖4和圖5,由圖4可知,Zn2+與Mn2+可以增強(qiáng)溶菌酶對金黃色葡萄球菌的抑制作用,具有協(xié)同抑菌效應(yīng),其中以Zn2+最為顯著,并且Zn2+在低濃度(0.15 mmol/L)可以表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制作用,而Mn2+則需要在較高濃度(2.5 mmol/L)才能表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。Zn2+表現(xiàn)出較強(qiáng)的協(xié)同抑菌效應(yīng),其原因可能與Zn2+本身具有一定的抗菌能力有關(guān)。有文獻(xiàn)報道,大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞膜帶負(fù)電荷,Zn2+的正電荷在靜電作用下與細(xì)菌的細(xì)胞膜接觸,從而使細(xì)菌生長受阻或死亡[34],具有與溶菌酶不同的抗菌途徑,從而起到協(xié)同抑菌效應(yīng)。相反,Mg2+與K+可以抵消溶菌酶對金黃色葡萄球菌的抑制效果,具有拮抗抑菌效應(yīng),其中以Mg2+最為顯著,可以促進(jìn)金黃色葡萄球菌的生長,其原因可能是細(xì)菌在生長過程中需要Mg2+的參與,特別是激活細(xì)菌的有些酶系。而Na+與Ca2+僅表現(xiàn)出較弱的協(xié)同抑菌效應(yīng),對溶菌酶抑制金黃色葡萄球菌的效果影響較小。

圖4 不同金屬離子對溶菌酶抑制金黃色葡萄球菌效果的影響Fig.4 Effect of metal ions on antibacterial activity of LYS against S. aureus注：A：溶菌酶濃度0.33 mg/L;B:溶菌酶濃度0.65 mg/L;C:溶菌酶濃度1.3 mg/L。

對比圖4和圖5,不同金屬離子對溶菌酶抑制大腸桿菌O157∶H7的效果與金黃色葡萄球菌類似,Zn2+與Mn2+同樣可以增強(qiáng)溶菌酶對大腸桿菌O157∶H7的抑制作用,Mn2+在溶菌酶高濃度時展現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用(圖5C)。Mg2+同樣

圖5 不同金屬離子對溶菌酶抑制大腸桿菌O157∶H7效果的影響Fig.5 Effect of metal ions on antibacterial activity of LYS against E. coli O157∶H7注：A：溶菌酶濃度0.33 mg/L； B：溶菌酶濃度0.65 mg/L;C：溶菌酶濃度1.3 mg/L。

可以抵消溶菌酶對大腸桿菌O157∶H7的抑制效果,但Ca2+則呈現(xiàn)與Mg2+類似的拮抗抑菌效應(yīng),可能原因是大腸桿菌O157∶H7生長過程中,需要Ca2+參與下合成蛋白酶[34]。綜合圖4、圖5結(jié)果表明,溶菌酶用于食品儲藏保鮮時,應(yīng)避免在基質(zhì)中含有較多Ca2+、Mg2+的食品中使用,優(yōu)先考慮富含Zn2+、Mn2+的食品中使用,必要時可以通過添加Zn2+提高溶菌酶的抗菌效果。

2.5 Zn2+對溶菌酶協(xié)同抗菌的驗證

Zn2+對溶菌酶協(xié)同抗菌的驗證結(jié)果見圖6,圖6結(jié)果表明,Zn2+與溶菌酶聯(lián)合使用的抑菌效果要強(qiáng)于單一的Zn2+,具有協(xié)同抗菌效應(yīng),但Zn2+在高濃度(10 mmol/L)時,與溶菌酶無協(xié)同抗菌效應(yīng),其原因是過高的Zn2+完全抑制了細(xì)菌生長[35]。而圖4、圖5結(jié)果顯示,Zn2+與溶菌酶聯(lián)合使用的抑菌效果要強(qiáng)于單一的溶菌酶,綜合圖4、圖5、圖6結(jié)果表明,Zn2+對溶菌酶具有協(xié)同抗菌效應(yīng)。

圖6 Zn2+對溶菌酶協(xié)同抗菌的驗證Fig.6 Validation of synergistic antibacterial activity of Zn2+ and LYS注：A:大腸桿菌O157∶H7；B:金黃色葡萄球菌。

3 結(jié)論

本研究以金黃色葡萄球菌為代表的革蘭氏陽性菌和以大腸桿菌O157∶H7為代表的革蘭氏陰性菌為受試菌,系統(tǒng)研究了溫度、pH、金屬離子對溶菌酶抗菌活性的影響。結(jié)果顯示,溶菌酶在pH4～6具有更好的穩(wěn)定性,適用于酸性食品的儲藏保鮮,在堿性環(huán)境下,需提高溶菌酶的劑量。在4～121 ℃下,溶菌酶具有良好的熱穩(wěn)定性。溶菌酶與Mn2+、Zn2+具有一定的協(xié)同抗菌效應(yīng),而與Ca2+、Mg2+具有一定的拮抗抗菌效應(yīng),抗菌效果會受到一定程度的減弱,協(xié)同或拮抗抗菌效應(yīng)的原因和機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究和分析。

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