王 珂,馬海樂,李 景,熊 建,劉 瀟

(江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

玉米胚芽粕是玉米胚芽經過壓榨法或浸出法提取油脂后得到的殘渣,其主要營養(yǎng)成分為玉米胚芽蛋白,是一種優(yōu)質的蛋白質資源[1]。目前,玉米胚芽粕主要用作動物飼料,未能實現資源高值化利用。研究表明,玉米胚芽蛋白經蛋白酶酶解的產物玉米胚芽肽,具有抗氧化、降血壓等功效[2-4],其中對抗氧化功能的研究較為充分,而降血壓功能還處于初步探索階段,故本實驗主要研究玉米胚芽肽的降血壓活性。傳統酶解法制備生物活性肽存在一些弊端,如酶解效率低、酶解時間長、酶的利用率低等[5]。近年來,超聲波技術在蛋白酶解領域有較好的應用前景,具有提高蛋白轉化率、提高產物活性、縮短蛋白質的酶解時間[6-10]等優(yōu)勢。但由于實驗條件的限制,超聲波設備常局限于超聲波洗槽和超聲細胞破碎儀等,工作模式較為單一,無法在優(yōu)化超聲工作模式的基礎上再進行超聲參數的選擇,從而難以達到理想的效果。

本研究使用的是自主研發(fā)的雙頻逆流聚能式和三頻發(fā)散式超聲設備,有多種頻率組合可供選擇,雙頻逆流聚能式超聲屬于探頭式超聲,超聲能量比較集中;三頻發(fā)散式超聲屬于平板式超聲,超聲能量平均分散分布。雙頻或三頻組合預處理原料蛋白后,能促進蛋白的酶解,有利于ACE抑制肽的制備。

目前,酶解法制備ACE抑制肽的指標大多為上清液多肽的ACE抑制率和水解度,而超聲預處理對許多原料蛋白的水解度沒有顯著影響,如玉米醇溶蛋白[7]、谷朊蛋白[11]、麥胚蛋白[12-13]、大米蛋白[14]等,且ACE抑制率主要與上清液多肽濃度和多肽ACE抑制活性有關,多肽ACE抑制活性又與肽的分子量區(qū)間密切相關,所以本研究選取蛋白轉化率與高活性肽占比為指標,能更好的反映出酶解效果,即酶解的產量和產物活性,若擴大到工業(yè)生產中,也更加符合企業(yè)的生產要求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米胚芽粕(自測,蛋白含量18.93%) 山東三星玉米產業(yè)科技有限公司;血管緊張素轉化酶(ACE) 自提[15];呋喃丙烯酰三肽(FAPGG)、HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸) Sigma公司;色譜純甲醇、乙腈 Tedia公司;堿性蛋白酶(酶活1.89×105U/mL) 南京誠納化工有限公司;其他試劑 均為國產分析純。

雙頻逆流聚能式超聲設備逆流超聲波設備、發(fā)散三頻超聲設備 江蘇大學自主研發(fā);對振雙頻超聲設備 美國先聲科技有限公司;Pellicon小型超濾系統 美國Millipore公司;Card-Waters1525型高效液相色譜系統 美國Waters公司;Infinite 200 PRO多功能酶標儀 瑞士Tecan公司;PHS-3C酸度計 海鴻蓋儀器有限公司;BT600S型蠕動泵 保定雷弗流體科技有限公司;SPX-250B生化培養(yǎng)箱 常州國華電器有限公司;DL-5臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;T6新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;HH-S2數顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白轉化率的測定

上清液多肽含量:福林酚法[16]。標準曲線的繪制:取1 mL濃度為0～250 μg/mL的牛血清白蛋白于試管,加入5 mL堿性銅試劑(A液含2%Na2CO3,0.1 mol/L NaOH;B液含0.5% CuSO4·5H2O,1%酒石酸鉀鈉;A液與B液按50∶1的比例混合即為堿性銅試劑),混勻,于30 ℃水浴10 min;再在每支試管中加入0.5 mL福林酚試劑,立即振蕩混勻,在30 ℃下水浴30 min;以不加標準蛋白的溶液為空白對照,在680 nm下測定各試管溶液的吸光值。以蛋白濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制標準曲線y=2.5835x+0.016,R2=0.9993。以1 mL稀釋后的酶解上清液代替牛血清白蛋白,測定樣品的吸光值,代入標準曲線后,即可求得上清液肽含量。

原料底物總蛋白:GB5009.5-2010,凱氏定氮法。

1.2.2 高活性肽占比 參考龔洋的方法[17],采用高效凝膠過濾色譜法測定多肽的分子量分布。

色譜柱:TSK gel G2000(300 mm×7.8 mm)流動相的組成為:乙腈∶水∶三氟乙酸45∶5∶0.1,洗脫流速:0.5 mL/min,檢測波長:220 nm,柱溫:30 ℃,進樣量:10 μL。液相系統的程序控制和數據處理采用軟件Breeze(Waters,MA,USA)。以保留時間(t)為橫坐標,分子量的對數值(lg Mr)為縱坐標,并采用以下已知分子量的標準品作標準曲線:牛血清白蛋白(67000 Da)、細胞色素 C(12500 Da)、桿菌肽(1450 Da)、L-色氨酸(204 Da)。標準曲線回歸方程:Y=-0.283X+7.981(R2=0.998,X為保留時間,Y為分子量的對數值lg Mr)對各樣品的色譜峰進行積分,并根據分子量大小分割成五個相對獨立的區(qū)域,即分子量大于5000、3000～5000、1000～3000、300～1000 Da和小于300 Da,每塊區(qū)域的相對峰面積大小即為各分子量大小范圍的相對含量。

1.2.3 樣品ACE抑制活性及IC50檢測 酶解上清液通過5000、3000、1000、300 Da的再生纖維素膜分離得到不同分子量區(qū)間的多肽液,測定其IC50值。

采用毛舒云[7]等酶標法測定ACE抑制肽活性。ACE底物為FAPGG,按表1添加各反應組分,用酶標儀來測定目標肽的ACE抑制活性。在340 nm波長下,分別測定空白孔和樣品孔的初始吸光度(a1和b1),和37 ℃反應30 min后的吸光度(a2和b2)。對照孔的吸光度減少值A=a1-a2,樣品孔的吸光度減少值B=b1-b2,抑制率(%)=(A-B)/A×100。

表1 ACE抑制活性的測定Table 1 Determination of ACE inhibiting activity

測定不同濃度下樣品的ACE抑制率,以濃度為橫坐標,ACE抑制率為縱坐標,繪制關系曲線,從中得出抑制率為50%時的樣品濃度,即為IC50值。

1.2.4 超聲模式的篩選 實驗使用雙頻逆流聚能式超聲設備、發(fā)散三頻超聲設備和美國進口的對振雙頻超聲設備,雙頻逆流聚能式超聲設備的工作組合為20/28、20/35、20/40、20/50(kHz/kHz),工作模式為同步工作和交替工作(共8種);發(fā)散三頻超聲工作組合為 20/28/40、20/35/50、20/40/60(kHz/kHz/kHz),工作模式為同步工作和交替工作(共6種);對振雙頻超聲工作組合為16/20(kHz/kHz)。

稱取玉米胚芽粕粉,配成底物濃度10%的料液,進行超聲預處理,處理條件為:單位體積超聲功率100 W/L、超聲溫度20 ℃(超聲過程控制溫度)、超聲同步工作脈沖/間歇時間比5 s/2 s、交替工作時間為每種頻率各5 s、超聲處理時間30 min。經超聲預處理的料液用堿性蛋白酶進行酶解,酶解條件如下:加酶量2000 U/g蛋白、pH9.0、溫度55 ℃,在酶解60 min后,沸水浴中滅酶10 min,冷卻至室溫后于4000 r/min離心15 min,取上清液,測定蛋白轉化率(主要指標)和高活性肽占比,篩選出最優(yōu)的超聲模式。以未經超聲預處理的料液為對照組。

1.2.5 超聲預處理參數的篩選 在最優(yōu)的超聲模式條件下,對超聲預處理條件進行單因素逐步優(yōu)化實驗,考察超聲功率密度、底物濃度、超聲處理時間、超聲初始溫度對酶解的影響,確定最佳的超聲預處理工藝,酶解條件同1.2.4。具體步驟如下:底物濃度10%、超聲處理時間30 min,超聲初始溫度20 ℃,超聲功率密度取值為40、60、80、100、120 W/L;超聲功率密度為前組單因素實驗優(yōu)化值,超聲溫度20 ℃、超聲處理時間為30 min,底物濃度取值為4%、6%、8%、10%、12%、14%;超聲功率密度和底物濃度為前組實驗優(yōu)化值,超聲處理時間取值為10、20、30、40、50 min;超聲功率密度、底物濃度和處理時間為前組實驗優(yōu)化值,超聲溫度取值為20、30、40、50、60 ℃。

1.2.6 超聲處理后酶解參數的優(yōu)化 在最優(yōu)的超聲模式和預處理參數的條件下,進行酶解參數的優(yōu)化,酶解溫度55 ℃、pH9.0、酶解時間1 h,加酶量取值為1000、1500、2000、2500、3000 U/g蛋白;酶解溫度55 ℃、pH9.0、加酶量為前組實驗優(yōu)化值,酶解時間取值為1、1.5、2、2.5、3 h。

1.2.7 未超聲處理直接酶解的效果 未進行超聲預處理,直接酶解玉米胚芽蛋白,酶解溫度55 ℃、pH9.0,加酶量和酶解時間取1.2.6的最優(yōu)值,測定蛋白轉化率和高活性肽占比。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 不同分子量區(qū)間的多肽ACE抑制活性

由表2可知,在300～1000 Da分子量區(qū)間的多肽ACE抑制活性最高,IC50值為0.78 mg/mL,1000～3000 Da的多肽次之,IC50值為0.85 mg/mL,兩者無顯著性差異。小于300 Da和3000～5000 Da的多肽活性較低,IC50分別為1.69和1.93 mg/mL,而分子量大于5000 Da的多肽活性最低。因此,通過膜分離去掉大分子低活性多肽后,富集的小分子多肽與未過膜的原液相比,活性顯著提高。本研究旨在通過超聲預處理,提高底物蛋白的轉化率和產物多肽的ACE抑制活性,所以選取酶解液中活性高的300～3000 Da多肽占總肽的比值作為一個考察指標。

2.2 最優(yōu)超聲模式的篩選

由圖1可知,不同的超聲模式預處理原料蛋白后酶解,與未超聲的對照組相比,均能明顯提高蛋白轉化率與高活性肽占比?？偟膩碚f,雙頻超聲組合的效果高于三頻組合和對振雙頻,而三頻組合的作用與對振雙頻差異不大。在雙頻超聲組合中,20/40 kHz組合效果最突出,同步和交替組合的蛋白轉化率分別達到69.80%和70.08%,與對照比較分別提高了17.78%和18.23%,高活性肽占比分別達到26.39%和29.67%。超聲波作用原料蛋白主要是空化效應,從而改變蛋白結構[9,18],使其疏水基團暴露,從而有利于蛋白酶解制備ACE抑制肽。不同頻率下的超聲波的空化效應強弱不同,多頻超聲作用時,不同波之間存在交互影響,在本實驗中20/40 kHz組合對原料蛋白的預處理存在協同作用,由于雙頻超聲組合輻射提供了一個更寬的頻譜作用范圍,對聲化學反應產額的提高具有明顯的增強效應,導致雙頻超聲同時輻射的合效應均明顯大于各頻率超聲單獨輻射效應之和[19],使蛋白轉化率最高。而在20/40 kHz組合中,交替雙頻與同步雙頻作用后的蛋白轉化率差異不大,但高活性多肽占比顯著高于同步雙頻,這可能是20/40 kHz的超聲波交替作用,克服了同步超聲瞬間空化效應差的問題,使酶解產生更多的高活性肽[11]。故選擇20/40 kHz交替雙頻進行后續(xù)實驗。

圖1 不同超聲處理模式對玉米胚芽蛋白酶解效果的影響Fig.1 Effects of ultrasonic frequency on enzymatic hydrolysis of corn germ meal注:不同字母a、b、c、d、e,A、B、C、D、E 表示組間具有顯著性差異(p<0.05)；表2～表7同。

2.3 超聲預處理參數的篩選

2.3.1 超聲功率密度對玉米胚芽蛋白酶解效果的影響 由圖2可以看出,隨著超聲功率密度增加,高活性肽占比呈現小幅度波動的趨勢,占比在26.34%～27.68%之間,在60 W/L處達到最大值27.68%,100 W/L處次之,為27.67%。功率密度對蛋白轉化率影響較大,轉化率呈現先增后小幅下降再增的趨勢,在100 W/L處蛋白轉化率達到最大值72.85%,繼續(xù)增大功率,轉化率保持不變。這是因為功率越大,超聲的聲強越大,空化效應產生的空化泡破裂時產生的能量越大,攻擊玉米胚芽蛋白顆粒時,改變了蛋白的結構,使更多的疏水氨基酸基團暴露出來,由于含有疏水氨基酸的肽通常具有較高的ACE抑制率[20],從而有利于酶解產生更多的活性肽;但是,功率過高時,超聲產生的空化泡過多,形成聲波屏障,不利于超聲作用到全部物料[12]。功率密度120 W/L時蛋白轉化率沒有增加,可能是部分聲場能量與聲波屏障的效果相抵消導致的。所以,功率密度選擇100 W/L進行后續(xù)實驗。

圖2 超聲功率密度對玉米胚芽蛋白酶解效果的影響Fig.2 Effects of ultrasonic power density on enzymatic hydrolysis of corn germ meal注:不同字母a、b、c,A、B、C等表示組間 具有顯著性差異(p<0.05)。

2.3.2 底物濃度對玉米胚芽蛋白酶解效果的影響 由圖3可知,隨著底物濃度的增加,蛋白轉化率與高活性肽占比呈現出先增后降的趨勢,在底物濃度8%時,兩者均達到最大值,蛋白轉化率為74.17%,高活性肽占比為29.64%。底物濃度低時,原料蛋白能夠過量地受到超聲的空化作用;在底物濃度為8%時,蛋白顆粒能充分地受到空化作用,使酶解效果達到最好;底物濃度繼續(xù)增加,因料液黏度增加,超聲波的傳遞受阻,影響了空化作用[21]。因此,底物濃度選擇為8%進行后續(xù)實驗。

圖3 底物濃度對玉米胚芽蛋白酶解效果的影響Fig.3 Effects of substrate concentration on enzymatic hydrolysis of corn germ meal

2.3.3 超聲處理時間對玉米胚芽蛋白酶解效果的影響 從圖4可知,隨著超聲時間的延長,蛋白轉化率先增后降,在20 min時達到75.33%,在30 min時達到最大值,為75.97%。高活性肽占比呈現先增后降再增的趨勢,在20 min時達到最大值,為29.64%。短時間的超聲處理能使玉米胚芽蛋白的結構發(fā)生改變,蛋白顆粒變得疏松,疏水基團暴露出來。超聲時間延長,疏水基團暴露增多,有利于酶解產生ACE抑制肽。30 min時高活性肽占比急劇下降的原因可能是暴露出的疏水基團中缺少堿性蛋白酶的酶切位點,導致酶解后得到較多的大分子肽,使得高活性肽所占比例降低。40 min時高活性肽占比上升,可能是超聲繼續(xù)作用,蛋白結構持續(xù)變得疏松,更多的酶切位點暴露出來,堿性蛋白酶酶解后產生的小分子活性肽占比增加。但超聲時間過長,暴露的疏水基團會互相交聯,疏水性氨基酸被隱藏,不利于產生ACE抑制肽[11,22],這可能是30 min后蛋白轉化率下降的原因。在實驗中,超聲處理30 min時蛋白轉化率最高,但與超聲處理20 min無顯著性差異;而處理20 min的高活性肽占比29.64%是處理30 min占比26.64%的1.11倍。綜合考慮,選擇超聲處理時間為20 min。

圖4 超聲處理時間對玉米胚芽蛋白酶解效果的影響Fig.4 Effects of ultrasonic time on enzymatic hydrolysis of corn germ meal

2.3.4 超聲溫度對玉米胚芽蛋白酶解效果的影響 根據圖5得出,超聲處理溫度越高,蛋白轉化率和高活性肽占比先增加后趨于穩(wěn)定,其中,超聲溫度40 ℃時蛋白轉化率最高,為75.74%;超聲溫度50 ℃時,高活性肽占比最大,為29.06%。溫度主要影響料液的濃度和超聲的空化作用。溫度升高,料液的黏度降低,有利于超聲波的傳遞。溫度過低時,超聲波的機械能量被底物料液大量吸收,空化效果減弱;溫度升高,空化作用達到飽和,繼續(xù)升高溫度會造成能源浪費。由于30 ℃時的蛋白轉化率73.89%與40 ℃時不存在顯著性差異,綜合考慮超聲效果和電量消耗,超聲溫度30 ℃較為理想。

圖5 超聲溫度對玉米胚芽蛋白酶解效果的影響Fig.5 Effects of ultrasonic temperature on enzymatic hydrolysis of corn germ meal

2.4 超聲后酶解條件的確定

2.4.1 加酶量對玉米胚芽蛋白酶解效果的影響 由圖6可知,隨著加酶量的增加,蛋白轉化率先大幅升高后趨于平緩,在加酶量為2000 U/g處有明顯的轉折點,此時蛋白轉化率為76.44%;增大加酶量為2500和3000 U/g時的蛋白轉化率為77.68%和78.62%。高活性肽占比隨著加酶量的增加先增大后降低:加酶量越多,酶與玉米胚芽蛋白結合越多,蛋白轉化率越高;而加酶量持續(xù)增加,酶與底物反應飽和,過量的酶轉而優(yōu)先酶解上清液的多肽,導致產物過度酶解,小于300 Da的多肽占比增大,高活性肽占比降低。蛋白轉化率在2500 U/g處達到最大值29.91%;2000 U/g次之,為28.51%。由于2000和2500 U/g的蛋白轉化率和高活性肽占比無顯著性差異,故選擇2000 U/g的加酶量進行后續(xù)實驗。

圖6 加酶量對玉米胚芽蛋白酶解效果的影響Fig.6 Effects of enzyme dosage on enzymatic hydrolysis of corn germ meal

2.4.2 酶解時間對玉米胚芽蛋白酶解效果的影響 根據圖7,酶解時間越長,蛋白轉化率越高,在3 h時達到最大值86.65%;2.5 h處次之,為85.00%。而高活性肽占比隨著酶解時間的延長,呈現先緩慢增加后急劇降低的趨勢,這是因為在酶解2.5 h前,原料蛋白還未充分酶解,酶解時間越長,蛋白的轉化率就越大。而2.5 h后,原料蛋白受到了較為充分的酶解,延長酶解時間,蛋白轉化率的增加無顯著性差異;高活性肽占比急劇下降的原因可能是堿性蛋白酶酶解上清液中的產物多肽,產物過度酶解[11]。所以,酶解時間選擇2.5 h較為合適。

圖7 酶解時間對玉米胚芽蛋白酶解效果的影響Fig.7 Effects of hydrolysis time on enzymatic hydrolysis of corn germ meal

2.5 未超聲處理直接酶解的效果

未進行超聲預處理,直接酶解玉米胚芽蛋白,加酶量2000 U/g蛋白,酶解時間2.5 h后,測定蛋白轉化率為73.01%±0.21%,高活性肽占比為26.00%。

3 結論

超聲波預處理能顯著提高玉米胚芽蛋白的轉化率和產物多肽的ACE抑制活性,最佳的超聲波工作模式是20/40 kHz交替雙頻逆流聚能式超聲。

超聲預處理的最優(yōu)條件為:單位體積超聲功率100 W/L,底物濃度8%,超聲處理時間20 min,超聲溫度30 ℃;超聲后酶解參數為:加酶量2000 U/g蛋白,酶解時間2.5 h。在最優(yōu)條件下,蛋白轉化率為85.00%,相比于未超聲組的73.01%提高了16.42%,300～3000 Da高活性肽占比為29.63%,相比于未超聲組的26.00%提高了13.96%,表明逆流雙頻超聲波輔助酶解法能有效提高玉米胚芽蛋白的轉化率和產物多肽的ACE抑制活性,有利于酶解制備玉米胚芽ACE抑制肽。

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