李磊，易有金，*，夏菠，柏連陽，李高陽

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南長沙410128；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖南長沙410128；3.湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南長沙410128）

葡萄在運輸過程中會發(fā)生腐爛、失水、果實軟化等。防治葡萄腐爛的方法主要由物理方法、化學(xué)方法、涂膜保鮮法以及氣調(diào)保鮮法[1]。目前市場上使用較多的是化學(xué)保鮮劑和冷凍貯藏方法，但是化學(xué)保鮮劑引發(fā)了一系列的安全問題，而冷凍貯藏保鮮則在耗能上造成的經(jīng)濟損失較大，因此，尋求新的貯藏保鮮方法更加符合綠色發(fā)展的主流趨勢。

丁香酚在果蔬采后保鮮應(yīng)用十分廣泛，陳楚明[2]等就報道了丁香酚提取液可食膜對蜜桔采后保鮮的研究，證實了丁香酚對果實品質(zhì)無不良影響且能誘導(dǎo)多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和苯丙氨酸酶（phenylalaninammo-nialyase，PAL）的活性上升的優(yōu)點；郭艷峰[3]的研究表明，丁香酚對圣女果采后保鮮也有延遲腐爛的影響；陸漓[4]發(fā)現(xiàn)了丁香精油改性聚乙烯（polyethylene，PE）膜能夠有效延長草莓的貨架期。丁香酚對植物致病真菌有廣譜抑菌效果和較強的抗氧化性[5]，但是丁香酚改性產(chǎn)物在果蔬采后保鮮方面應(yīng)用較少。

國內(nèi)外通過對丁香酚進行結(jié)構(gòu)修飾，改性丁香酚生成新的產(chǎn)物研究廣泛[6]。本試驗采用丁香酚改性產(chǎn)物制備成復(fù)合保鮮劑，浸泡巨峰葡萄，研究對葡萄保鮮的效果，為丁香酚改性保鮮劑保鮮采后葡萄提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄采自于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗基地，品種為巨峰，采后立即存放至實驗室并選取大小一致、顏色一致、無病蟲害、無機械損傷、成熟度一致的葡萄果實；漆酶、阿拉伯半乳糖、丁香酚（純度99.26%）：成都曼思特生物科技有限公司；保鮮劑NW20（生化級）、吐溫20、無水乙醇、氯化鋇、酚酞、抗壞血酸、2，6-二氯酚靛酚、愈創(chuàng)木酚（均為分析純）、草酸、冰醋酸：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-250智能生化培養(yǎng)箱：上海飛躍實驗儀器有限公司；WFJ7200可見分光光度計：尤尼柯儀器公司；PAL-1手持糖度計：ATAGO（愛拓）中國分公司；GF16RX冷凍離心機：日本日立公司；DK-S28水浴鍋：上海驚宏實驗設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 丁香酚改性產(chǎn)物的制備

采用響應(yīng)面試驗法優(yōu)化改性試驗條件，以最佳試驗條件進行改性。先配制乙酸/乙酸鈉緩沖液（pH 6.8）8 mL，加入1 mL丁香酚、1 mL乙醇混合充分溶解，再加入1 g阿拉伯半乳糖與漆酶（10 U/mL）100 mg混合均勻，將體系于35℃水浴中反應(yīng)，整個反應(yīng)過程中需通入無菌空氣，反應(yīng)時間為4.5 d，反應(yīng)結(jié)束后冷凍離心取上清液為改性產(chǎn)物。改性反應(yīng)體系為乙酸/乙酸鈉緩沖液（pH6.8）8 mL，吐溫-20 1 mL，乙醇 1 mL，阿拉伯半乳糖1 g。

1.3.2 保鮮劑的制備

改性產(chǎn)物保鮮劑：取50 mL改性產(chǎn)物融入2 mL 50%乙醇中，加入2.25 g普魯蘭多糖，5.5 g CaCl2，定容至500 mL，冷藏備用，使用時加入0.1%的吐溫。

丁香酚保鮮劑：取改性反應(yīng)體系45 mL，加入丁香酚5 mL，改性反應(yīng)體系中無漆酶，離心處理后取上清液50 mL，加入2 mL 50%乙醇、2.25 g普魯蘭多糖和5.5 g CaCl2，定容至500 mL，冷藏備用，使用時加入0.1%的吐溫。

空白保鮮劑：取改性反應(yīng)體系50 mL，加入2 mL 50%乙醇、2.25 g普魯蘭多糖和5.5 g CaCl2，冷藏備用，使用時加入0.1%的吐溫。

陽性對照組：保鮮劑NW20。

1.3.3 保鮮處理方法

用保鮮劑浸泡葡萄3 min，將其自然晾干，再裝入0.03 mm PE保鮮袋中，規(guī)格為25 cm×38 cm，于濕度為75%的人工氣候箱中貯存，貯存溫度為15℃。（1）單因素試驗和正交試驗每袋中放入30顆葡萄，每組重復(fù)3次，25天后測定失重率和腐爛率；（2）對葡萄采后保鮮效果試驗中每袋放入60顆葡萄，每組處理設(shè)3次重復(fù)，每5天取樣進行各指標的測定。

1.3.4 丁香酚改性保鮮劑對葡萄采后保鮮效果的影響

以丁香酚改性產(chǎn)物制備為丁香酚改性保鮮劑組；以空白保鮮劑處理為CK1組，以丁香酚保鮮劑處理為CK2組，以保鮮劑NW20處理為CK3組，每5天取樣對各指標進行測定，分析最佳丁香酚改性保鮮劑對葡萄采后保鮮效果的影響。

1.3.5 葡萄相關(guān)指標的測定方法

1.3.5.1 失重率測定方法

式中：W為處理第n天后的質(zhì)量損失率，%；m0為原始質(zhì)量，g；mn為貯藏第n天后的質(zhì)量，g。

1.3.5.2 腐爛率測定方法

腐爛率/%=腐爛果實數(shù)/總果實數(shù)×100

1.3.5.3 呼吸強度測定方法

采用靜置法[7]。

1.3.5.4 POD（過氧化物酶）活性測定方法

參照曹建康[8]的方法并改進。

1.3.5.5 PPO（多酚氧化酶）活性測定方法

參照曹建康[8]的方法并改進。

1.3.5.6 丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量測定方法

參照曹建康[8]的方法并改進。

1.3.5.7 可溶性固形物測定方法

手持折光儀測定方法[8]。

1.3.5.8 還原糖含量測定方法

采用斐林試劑法測定[8]。

1.3.5.9 VC的測定方法

采用2，6-二氯酚靚酚滴定法[8]。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理及分析

檢測數(shù)據(jù)采用Origin9軟件進行圖表處理，采用SPSS 11.0軟件進行LSD數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁香酚改性產(chǎn)物保鮮劑對葡萄失重率的影響

不同處理對葡萄失重率的影響見圖1。

圖1 不同處理對葡萄失重率的影響Fig.1 Effect of different treatments on weight loss rata of grape

失重率直接影響到葡萄果實的新鮮度和風(fēng)味[9]，由圖1可知，貯藏時間越長，葡萄的失重率越高，在葡萄采后保存的過程中，由于葡萄脫離了植株和土壤，缺少營養(yǎng)與水分的補給，葡萄的代謝作用仍在持續(xù)，使得水分消耗和果實內(nèi)物質(zhì)持續(xù)耗損，導(dǎo)致葡萄重量減輕，在果實貯藏后期，耗損現(xiàn)象尤為明顯，這于果實內(nèi)部組織衰老有關(guān)。在貯藏25 d時，CK1失重率達到16.24%，丁香酚改性保鮮劑處理組失重率達到6.08%，處理后的質(zhì)量損失率有降低，且顯著低于CK1（P<0.05），與 CK2和 CK3比較均有顯著性（P<0.05），說明丁香酚改性保鮮劑能有效延緩葡萄果實質(zhì)量損失。

2.2 丁香酚改性產(chǎn)物保鮮劑對葡萄腐爛率的影響

不同處理對葡萄腐爛率的影響見圖2。

圖2 不同處理對葡萄腐爛率的影響Fig.2 Effect of different treatments on weight decay of grape

腐爛率是能夠最直觀得觀察出葡萄保鮮效果，腐爛率隨著貯藏時間的延長升高，致腐作用主要是由于葡萄果實真菌的生長，同時加快果實自身代謝，加速了腐敗速度[10]。由圖2可知，改性保鮮劑處理組的腐爛率增長緩慢，明顯低于CK1，差異極顯著（P<0.01），貯藏25 d時，CK1的腐爛率為18.42%，改性保鮮劑處理組腐爛率為6.14%，CK3腐爛率為14.26%，CK2腐爛率為10.98%，說明改性保鮮劑處理對葡萄采后貯藏腐爛率的抑制效果最佳。

2.3 丁香酚改性產(chǎn)物保鮮劑對葡萄呼吸強度的影響

不同處理對葡萄呼吸強度的影響見圖3。

圖3 不同處理對葡萄呼吸強度的影響Fig.3 Effect of different treatments on respiration intensity rata of grape

呼吸強度是新陳代謝的主要指標[11]，能夠看出果實衰老的程度，巨峰葡萄果粒為非躍變型，在采后成熟過程中呼吸作用變動率不形成呼吸高峰，變動平緩，隨著貯藏時間的延長，呼吸強度逐漸減弱，前期減弱趨勢大，貯藏后期減弱趨勢平緩[12]。由圖3可知，在貯藏25 d后，CK1的呼吸強度為17.31 mg·CO2/（g·h），低于改性保鮮劑處理組呼吸強度29.42 mg·CO2/（g·h），方差分析有顯著性差異（P<0.05），改性保鮮劑處理組的呼吸強度在整個貯藏過程中始終高于CK組，CK2呼吸強度為25.17 mg·CO2/（g·h），CK3呼吸強度為21.45 mg·CO2/（g·h），數(shù)據(jù)表明，丁香酚改性保鮮劑對呼吸強度的延緩作用最佳。

2.4 丁香酚改性產(chǎn)物保鮮劑對葡萄可溶性固形物的影響

不同處理對葡萄可溶性固形物含量的影響見圖4。

圖4 不同處理對葡萄可溶性固形物含量的影響Fig.4 Effect of different treatments on soluble solids content in grape

由圖4可知，巨峰葡萄在整個貯藏期間可溶性固形物含量呈降低趨勢，SANCHEZ-GONZALEZ L[13]的試驗中也有同樣的趨勢，VALERO D[14]也得到了相同的試驗趨勢，經(jīng)丁香酚改性保鮮劑處理后的葡萄其可溶性固形物的降低率低于CK1，在貯藏25天后，經(jīng)分析顯示，丁香酚改性保鮮劑處理組與CK1的可溶性固形物含量呈顯著性差異（P<0.05），其中，改性保鮮劑處理后的可溶性固形物含量為13.37%，與貯藏前比較降低了2.56%；CK1可溶性固形物含量為3.67%，與貯藏前比較降低了12.26%；CK2可溶性固形物含量為10.17%，與貯藏前比較降低了5.76%；CK3可溶性固形物含量為8.53%，與貯藏前比較降低了7.4%。由數(shù)據(jù)可知，丁香酚改性保鮮劑對巨峰葡萄可溶性固形物的降低率延緩效果最佳。

2.5 丁香酚改性產(chǎn)物保鮮劑對葡萄維生素C含量的影響

不同處理對葡萄VC含量的影響見圖5。

圖5 不同處理對葡萄VC含量的影響Fig.5 Effect of different treatments on vitamin C content in grape

新鮮的巨峰葡萄VC含量約為8 mg/100 g，隨著采摘后貯藏時間的延長，葡萄果實內(nèi)VC在貯藏階段逐漸被氧化分解，加上環(huán)境因素，如氧氣和溫度加速了果實內(nèi)VC的氧化，失去生理活性，VC含量是果實成熟程度的生理標志之一[15]。由圖5可知，整個貯藏過程中，貯藏前期VC的降低速度較快，貯藏后期VC下降速度相對平緩，其中，在貯藏25 d后，CK1的VC含量為0.93 mg/100 g，相較于貯藏前降低了88.82%；CK2的VC含量為3.04 mg/100 g，相較于貯藏前降低了63.46%；丁香酚改性保鮮劑處理組VC含量為3.64 mg/100 g，相較于貯藏前降低了56.25%；CK3處理后VC含量為2.93 mg/100 g，相較于貯藏前降低了64.78%。CK1的VC含量低于丁香改性保鮮劑組VC含量，經(jīng)方差分析由顯著性差異（P<0.05）。由數(shù)據(jù)可看出，丁香酚改性保鮮劑對VC含量的降低延緩效果最佳。

2.6 丁香酚改性產(chǎn)物保鮮劑對葡萄MDA的影響

不同處理對葡萄MDA含量的影響見圖6。

圖6 不同處理對葡萄MDA含量的影響Fig.6 Effect of different treatments on MDA content in grape

丙二醛是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，是葡萄果實組織衰老和膜脂過氧化強弱的重要標志之一，保鮮劑能夠一定程度減緩自由基的發(fā)生，通過減弱活性氧對膜脂的損害和減少丙二醛的增長率延緩果實衰老[16]。由圖6可知，葡萄果實在貯藏期間丙二醛含量隨貯藏時間的延長而增加，貯藏25d時，CK1的MDA含量為14.08 μmol/g，CK2 處理 MDA 含量為 10.32 μmol/g，丁香酚改性保鮮劑處理MDA含量為8.93 μmol/g，CK3的MDA含量為11.93 μmol/g。CK1處理后MDA含量低于丁香酚改性保鮮劑含量，方差分析顯著性（P＜0.05），且數(shù)據(jù)顯示，丁香酚改性保鮮劑處理對葡萄MDA的增加延緩效果最佳。

2.7 丁香酚改性產(chǎn)物保鮮劑對葡萄還原糖的影響

不同處理對葡萄還原糖含量的影響見圖7。

圖7 不同處理對葡萄還原糖含量的影響Fig.7 Effect of different treatments on reducing sugar content in grape

根據(jù)圖7顯示可知，整個貯藏過程中還原糖含量呈現(xiàn)降低趨勢，丁香酚改性保鮮劑處理組的降低趨勢相對低于CK1處理組，CK1在貯藏10 d后降低幅度有所增加，貯藏第25天時還原糖損失達到55.24%，而CK2在25 d時還原糖損失達到29.81%。CK1還原糖含量低于丁香酚，有顯著性差異（P＜0.05）。

2.8 丁香酚改性產(chǎn)物保鮮劑對葡萄過氧化物酶POD活性的影響

不同處理對葡萄過氧化物酶活性的影響見圖8。

圖8 不同處理對葡萄過氧化物酶活性的影響Fig.8 Effect of different treatments on peroxidase activity in grape

POD在葡萄果實內(nèi)有延緩衰老和促進果實褐變的作用，對果實保鮮的作用比較復(fù)雜，一般作為果實衰老的指標[17]。由圖8可知，不同處理對葡萄POD的影響有所不同，在貯藏第10天時，CK1的POD含量上升到峰值，之后開始下降；其他處理組在貯藏第15天達到峰值，再趨于下降。第25 d時，CK1處理的葡萄POD含量為8.93 U/（g·min），CK2為10.13 U/（g·min），丁香酚改性保鮮劑處理為10.64 U/（g·min），CK3為12.78 U/（g·min），CK3高于其他3組，差異顯著（P＜0.05）。隨著貯藏時間的延長，保鮮劑處理組POD含量均高于CK1，保鮮劑中可能含有促進POD活性的物質(zhì)，在貯藏過程中，通過促進POD的活性來消除果實中H2O2以達到保護果實效果。

2.9 丁香酚改性產(chǎn)物保鮮劑對多酚氧化酶PPO活性的影響

不同處理對葡萄多酚氧化酶活性的影響見圖9。

圖9 不同處理對葡萄多酚氧化酶活性的影響Fig.9 Effects of different treatments on polyphenol oxidase activity in grape

PPO可將葡萄果實內(nèi)的酚類物質(zhì)氧化成為醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)進一步聚合形成褐色素，最終將導(dǎo)致果實發(fā)生褐變，由圖9可知，貯藏過程中，PPO活性持續(xù)上升，丁香酚改性保鮮劑處理在貯藏前期上升幅度最大，在第15天時開始減緩；在第25天時，CK2的PPO含量為3.13 U/（g·min），與丁香酚改性保鮮劑處理組的PPO含量為3.17 U/（g·min）比較無顯著性差異（P＞0.05），與CK1的4.37 U/（g·min）相比有顯著性差異（P＜0.05），可知丁香酚改性保鮮劑能夠抑制PPO的活性，一定程度上延緩果實褐變。

3 結(jié)論

葡萄果實經(jīng)過丁香酚改性保鮮劑處理貯藏25天后，能夠顯著降低葡萄果實的營養(yǎng)損失。葡萄果粒在采后生理具有呼吸作用旺盛、蒸騰失水較快、易感染真菌病害導(dǎo)致腐敗的特點，果實在采后仍然進行著一系列的生理生化活動，如VC、可溶性固形物、還原糖等都在進行著消耗和轉(zhuǎn)化。果實內(nèi)部分防御酶的活性反映出果實細胞對外界病害抗性的能力，丙二醛（MDA）是細胞過氧化的產(chǎn)物之一，隨著細胞的衰老會逐漸積累，丁香酚保鮮劑復(fù)合膜在貯藏期間能夠有效地抑制貯藏期間丙二醛（MDA）的積累，這與于艷梅[18]的結(jié)果相似。

經(jīng)過對比后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過改性保鮮劑處理后的葡萄經(jīng)過25 d的貯藏后風(fēng)味品質(zhì)最佳，失重率僅為6.08%，腐爛率為6.14%，呼吸強度為29.42 mg·CO2/（g·h），可溶性固形物含量為13.37%，VC含量為3.64 mg/100 g，MDA含量為8.93 μmol/g，還原糖含量為9.63 g/100 g，POD酶活性為10.13 U/（g·min），PPO酶活性為3.17 U/（g·min）。其中與相同貯藏條件下的胡曉亮[19]的研究失重率9.34%對比要低3.26%，說明可有效延緩果粒呼吸內(nèi)耗、抑制蒸騰作用、阻止貯藏過程中真菌的侵染，并能夠一定程度上防止機械損傷，丙二醛含量比曾順德[20]的試驗結(jié)果比較在25 d時要低3.16 mg/g，說明丁香酚改性保鮮劑能夠有效延緩MDA的增加，一定程度上抑制果實內(nèi)部自由基的發(fā)生，延緩衰老。POD酶和PPO酶的活性能夠反映出果實衰老的程度，貯藏25天后，丁香酚改性保鮮劑處理后POD酶活性高于CK1和CK2，但低于陽性對照組，PPO酶活性低于CK1和CK3，高于CK2，說明丁香酚改性保鮮劑處理葡萄后對葡萄防御酶的降低有一定的延緩作用。

試驗結(jié)果表明：用3 min、貯藏溫度10℃、丁香酚改性產(chǎn)物保鮮劑濃度5%、乳化劑濃度0.1%的試驗條件對葡萄進行貯藏保鮮，能較好地維持葡萄的營養(yǎng)價值和商業(yè)價值，提高巨峰葡萄的貯藏效果，丁香酚改性產(chǎn)物的保鮮效果優(yōu)于丁香酚和NW20保鮮劑。

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