（山東省食品藥品檢驗研究院，山東濟南250101）

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，各種美食豐富了人們的餐桌，潛伏的食品安全問題也隨之出現。其中，最值得關注的問題就是肉摻假問題，市場上許多不法商家以未經檢驗的貂肉冒充羊肉、牛肉摻入肉卷等事件層出不窮[1]，對日常監(jiān)管和檢測能力都提出了新的挑戰(zhàn)。當前，分子生物學是檢測動物源性成分的重要手段[2]，聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術是通過熱循環(huán)對目的基因進行擴增，經過瓊脂糖凝膠電泳分析，肉眼估算產物大小的一種檢測方法，這種檢測手段耗時較長，且溴化乙錠作為熒光染色劑具有一定的致癌性[3]，容易造成人為操作的誤差和環(huán)境污染。因此，熒光PCR技術憑借其省時、特異性強、靈敏度高、無污染等特點，被質檢部門廣泛的運用到日常檢驗工作當中，成為打擊不法商販，進而維護消費者合法權益的強有力手段[4]。

在利用熒光PCR技術對樣品進行檢測時，通常需要選取含有目的基因的陽性物質作為試驗對照，以確保試驗結果的準確性，由于有些陽性材料難獲取且有證標準物質具有價格昂貴、制作工藝復雜、有效期短等問題，影響了日常檢驗工作的開展[5]。為了解決陽性物質匱乏這一問題，眾多檢測機構都在研究用陽性質粒分子代替基體標準物質，用于動物源性成分的檢測。2002年，日本科學家Kuribara等首次提出陽性質粒分子這一概念[6]，陽性質粒分子就是重組質粒分子，具有易構建、純度高、繁殖快、成本低等優(yōu)點，這種新型標準物質陽性質粒分子的出現，為動物源性成分的安全監(jiān)管提供了陽性材料，緩解了由于標準物質缺乏造成的監(jiān)管壓力。

為了解決摻假問題對食品業(yè)的影響，商品化食品檢測試劑盒作為一種新型快檢方法被廣泛應用到PCR分析當中，具有操作簡便、方法可靠、成本可控等特點，適合現場的快速檢測[7]。越來越多的機構投入到試劑盒的研發(fā)與生產中，也造成試劑盒質量良莠不齊的現象越來越明顯，使得試劑盒的檢驗質量得不到保證。針對以上問題，本研究構建了水貂、紫貂兩種成分的陽性質粒分子，并對其靈敏度和特異性進行了驗證，同時對比了3家公司引物、探針對熒光PCR反應效率的影響，擬研究出一種經濟、高效的實時熒光PCR反應體系，對于食品中動物源性成分準確可靠的鑒定具有重要意義和應用前景。

1 材料與方法

1.1 質粒的構建

根據設計的PCR引物，選擇水貂線粒體細胞色素b基因、紫貂16s rRNA基因引物對基因組DNA進行擴增，得到擴增序列，鏈接pUC57載體，構建相應陽性質粒DNA分子，序列合成由濟南博尚生物技術有限公司完成。

1.2 主要試劑

Premix Ex Taq HS 酶（0.05 U/μL）：Trkara公司；水貂、紫貂的引物和探針（見表1）分別由生工生物工程（上海）股份有限公司（Sangon）、濟南博尚生物技術有限公司（Biosune）、寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司（Trkara）三家公司合成。

表1 實時熒光PCR檢測引物、探針Table 1 Specific primers and probes sequences in RT-PCR

1.3 主要儀器

QuantStudio7 Flex實時熒光PCR儀：美國ABI公司；NanoDrop 2000c生物紫外可見分光光度計：美國Thermo公司；5424R高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；UV3 HEPA PCR反應工作臺：美國思博明科學器材公司。

1.4 實時熒光PCR檢測

實時熒光PCR反應體系：Premix Ex Taq HS酶12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，探針（5μmol/L）1 μL，樣品 DNA（10 μg/mL～100 μg/mL）2.0 μL，加蒸餾水補足至25μL。實時熒光PCR反應參數為：95℃/10 s，1個循環(huán)；95℃/5 s，52℃/10 s，72℃/34 s，40個循環(huán)。試驗結果用QuantStudio7Flex實時熒光PCR儀進行分析，根據SN/T 3730.1-2013《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法第1部分：貂成分檢測實時熒光PCR法》[8]對結果的表述，當Ct值≤35時判定擴增結果為陽性。

2 結果與分析

2.1 陽性質粒分子檢測體系的驗證

2.1.1 特異性檢測

按照1.4的PCR反應體系，分別以水貂、紫貂陽性質粒分子為模板進行熒光PCR擴增，同時以水貂、紫貂提取的DNA作為陽性對照，以豬肉提取的DNA作為陰性對照，以滅菌水作為空白對照，對所構建的水貂、紫貂陽性質粒分子的PCR反應體系進行特異性驗證。檢測結果表明，兩種質粒分子和陽性對照均在40個循環(huán)內出現顯著擴增，陰性對照沒有信號，表明構建的兩種質粒具有良好的特異性，可以代替基因組作為陽性對照來使用（圖1）。

圖1 陽性質粒分子實時熒光PCR特異性檢測結果Fig.1 Real-time fluoresce quantitative specificity curve of positive plasmid molecule

2.1.2 靈敏度驗證

將水貂、紫貂陽性質粒分子進行10倍濃度梯度稀釋，從 100 ng/μL 稀釋至 10-5ng/μL，用梯度稀釋后的質粒做模板進行熒光PCR擴增，分別對靈敏度進行驗證，結果見圖2。

圖2 陽性質粒分子實時熒光PCR特異性檢測結果Fig.2 Real-time fluoresce quantitative sensitivity curve of positive plasmid molecule

通常認為，當Ct值≤35時，可判定被檢樣品為陽性，以能夠檢出樣品的最低濃度作為相應的檢出下限，由此可見，水貂、紫貂質粒分子的靈敏度檢出下限分別為10-4、10-3ng/μL，均具有較高的檢測靈敏度。

2.1.3 標準曲線的繪制

以X軸代表質粒拷貝數的對數，Y軸代表Ct值，繪制標準曲線（見圖3）[9]。

圖3 陽性質粒分子實時熒光PCR標準曲線Fig.3 Real-time fluoresce quantitative standard curve of positive plasmid molecule

根據圖3標準曲線可知，當質粒濃度從100 ng/μL～10-2ng/μL時，隨質粒稀釋度的增加，對應的Ct值也逐漸增大，且具有一定的梯度關系。兩個標準曲線的擴增效率分別為103.211%、98.834%，且相關系數R2均大于0.99，說明在模板濃度范圍內都具有很好的線性關系，可以用于樣品的定量分析。

2.2 不同公司引物探針對實時熒光PCR反應的影響

將水貂、紫貂陽性質粒分子進行10倍梯度稀釋，從 100 ng/μL 稀釋至 10-5ng/μL，選取 Sangon、Biosune、Trkara三家公司合成的引物、探針對各濃度模板分別進行實時熒光PCR反應，對其反應效果進行比較分析，結果見圖4～圖5。

檢測結果表明，使用3家公司合成的引物、探針對各濃度模板進行擴增時均可得到標準的S型擴增曲線，所有擴增曲線拐點清楚，指數增長期明顯，基線平穩(wěn)無上揚[10]，且擴增曲線的重復性比較好，基線起峰范圍適當，Ct值隨模板濃度下降而下降[11]，不同的引物、探針所得到的檢出限略有不同。

如圖4 所示，利用 Sangon、Biosune、Trkara合成的引物、探針分別進行實時熒光PCR反應，水貂陽性質粒的靈敏度檢出限分別為 10-4、10-4、10-3ng/μL。顯然，Sangon與Biosune合成引物、探針的靈敏度檢出限與Trkara相比要高一個濃度梯度，且重復性和反應效率都略優(yōu)于Trkara公司的DNA聚合酶。

由圖5 可知，利用 Sangon、Biosune、Trkara合成的引物、探針分別進行實時熒光PCR反應，紫貂陽性質粒的靈敏度檢出限分別為 10-3、10-2、10-1ng/μL?？梢?，Sangon公司合成引物、探針的靈敏度最高，且反應效率高于其他兩家公司。

圖4 3家公司引物、探針實時熒光PCR反應效果比較（水貂）Fig.4 Comparation of the effective of real-time fluorescence PCR reaction of primers and probes of three companies（mink）

圖5 3家公司引物、探針實時熒光PCR反應效果比較（紫貂）Fig.5 Comparation of the effective of real-time fluorescence PCR reaction of primers and probes of three companies（Martes zibellina）

3 結論

引物、探針的正確選擇是PCR反應成功的前提，高質量的引物、探針對PCR擴增效率具有很大的影響[12]。完成水貂、紫貂兩種陽性質粒分子的構建，發(fā)現這兩種質粒分子均具有靈敏度高、特異性強等特點，同時對PCR反應的關鍵技術指標-引物、探針進行驗證，發(fā)現Sangon公司合成的引物、探針的靈敏度略優(yōu)于Biosune與TaKaRa公司。為進行熒光PCR反應時引物、探針的選擇提供一定的技術依據，為廣大食品企業(yè)及有關監(jiān)管部門監(jiān)測評價和控制動物制品的品質提供新的思路和有效手段，對于食品中動物源性成分日常鑒定和風險評估具有重要的應用價值。

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