（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南250101）

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，各種美食豐富了人們的餐桌，潛伏的食品安全問題也隨之出現(xiàn)。其中，最值得關(guān)注的問題就是肉摻假問題，市場上許多不法商家以未經(jīng)檢驗(yàn)的貂肉冒充羊肉、牛肉摻入肉卷等事件層出不窮[1]，對(duì)日常監(jiān)管和檢測能力都提出了新的挑戰(zhàn)。當(dāng)前，分子生物學(xué)是檢測動(dòng)物源性成分的重要手段[2]，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)是通過熱循環(huán)對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分析，肉眼估算產(chǎn)物大小的一種檢測方法，這種檢測手段耗時(shí)較長，且溴化乙錠作為熒光染色劑具有一定的致癌性[3]，容易造成人為操作的誤差和環(huán)境污染。因此，熒光PCR技術(shù)憑借其省時(shí)、特異性強(qiáng)、靈敏度高、無污染等特點(diǎn)，被質(zhì)檢部門廣泛的運(yùn)用到日常檢驗(yàn)工作當(dāng)中，成為打擊不法商販，進(jìn)而維護(hù)消費(fèi)者合法權(quán)益的強(qiáng)有力手段[4]。

在利用熒光PCR技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行檢測時(shí)，通常需要選取含有目的基因的陽性物質(zhì)作為試驗(yàn)對(duì)照，以確保試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，由于有些陽性材料難獲取且有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有價(jià)格昂貴、制作工藝復(fù)雜、有效期短等問題，影響了日常檢驗(yàn)工作的開展[5]。為了解決陽性物質(zhì)匱乏這一問題，眾多檢測機(jī)構(gòu)都在研究用陽性質(zhì)粒分子代替基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用于動(dòng)物源性成分的檢測。2002年，日本科學(xué)家Kuribara等首次提出陽性質(zhì)粒分子這一概念[6]，陽性質(zhì)粒分子就是重組質(zhì)粒分子，具有易構(gòu)建、純度高、繁殖快、成本低等優(yōu)點(diǎn)，這種新型標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)陽性質(zhì)粒分子的出現(xiàn)，為動(dòng)物源性成分的安全監(jiān)管提供了陽性材料，緩解了由于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺乏造成的監(jiān)管壓力。

為了解決摻假問題對(duì)食品業(yè)的影響，商品化食品檢測試劑盒作為一種新型快檢方法被廣泛應(yīng)用到PCR分析當(dāng)中，具有操作簡便、方法可靠、成本可控等特點(diǎn)，適合現(xiàn)場的快速檢測[7]。越來越多的機(jī)構(gòu)投入到試劑盒的研發(fā)與生產(chǎn)中，也造成試劑盒質(zhì)量良莠不齊的現(xiàn)象越來越明顯，使得試劑盒的檢驗(yàn)質(zhì)量得不到保證。針對(duì)以上問題，本研究構(gòu)建了水貂、紫貂兩種成分的陽性質(zhì)粒分子，并對(duì)其靈敏度和特異性進(jìn)行了驗(yàn)證，同時(shí)對(duì)比了3家公司引物、探針對(duì)熒光PCR反應(yīng)效率的影響，擬研究出一種經(jīng)濟(jì)、高效的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系，對(duì)于食品中動(dòng)物源性成分準(zhǔn)確可靠的鑒定具有重要意義和應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)設(shè)計(jì)的PCR引物，選擇水貂線粒體細(xì)胞色素b基因、紫貂16s rRNA基因引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增序列，鏈接pUC57載體，構(gòu)建相應(yīng)陽性質(zhì)粒DNA分子，序列合成由濟(jì)南博尚生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 主要試劑

Premix Ex Taq HS 酶（0.05 U/μL）：Trkara公司；水貂、紫貂的引物和探針（見表1）分別由生工生物工程（上海）股份有限公司（Sangon）、濟(jì)南博尚生物技術(shù)有限公司（Biosune）、寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司（Trkara）三家公司合成。

表1 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測引物、探針Table 1 Specific primers and probes sequences in RT-PCR

1.3 主要儀器

QuantStudio7 Flex實(shí)時(shí)熒光PCR儀：美國ABI公司；NanoDrop 2000c生物紫外可見分光光度計(jì)：美國Thermo公司；5424R高速冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；UV3 HEPA PCR反應(yīng)工作臺(tái)：美國思博明科學(xué)器材公司。

1.4 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測

實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系：Premix Ex Taq HS酶12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，探針（5μmol/L）1 μL，樣品 DNA（10 μg/mL～100 μg/mL）2.0 μL，加蒸餾水補(bǔ)足至25μL。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)為：95℃/10 s，1個(gè)循環(huán)；95℃/5 s，52℃/10 s，72℃/34 s，40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)結(jié)果用QuantStudio7Flex實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行分析，根據(jù)SN/T 3730.1-2013《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法第1部分：貂成分檢測實(shí)時(shí)熒光PCR法》[8]對(duì)結(jié)果的表述，當(dāng)Ct值≤35時(shí)判定擴(kuò)增結(jié)果為陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽性質(zhì)粒分子檢測體系的驗(yàn)證

2.1.1 特異性檢測

按照1.4的PCR反應(yīng)體系，分別以水貂、紫貂陽性質(zhì)粒分子為模板進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，同時(shí)以水貂、紫貂提取的DNA作為陽性對(duì)照，以豬肉提取的DNA作為陰性對(duì)照，以滅菌水作為空白對(duì)照，對(duì)所構(gòu)建的水貂、紫貂陽性質(zhì)粒分子的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行特異性驗(yàn)證。檢測結(jié)果表明，兩種質(zhì)粒分子和陽性對(duì)照均在40個(gè)循環(huán)內(nèi)出現(xiàn)顯著擴(kuò)增，陰性對(duì)照沒有信號(hào)，表明構(gòu)建的兩種質(zhì)粒具有良好的特異性，可以代替基因組作為陽性對(duì)照來使用（圖1）。

圖1 陽性質(zhì)粒分子實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測結(jié)果Fig.1 Real-time fluoresce quantitative specificity curve of positive plasmid molecule

2.1.2 靈敏度驗(yàn)證

將水貂、紫貂陽性質(zhì)粒分子進(jìn)行10倍濃度梯度稀釋，從 100 ng/μL 稀釋至 10-5ng/μL，用梯度稀釋后的質(zhì)粒做模板進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，分別對(duì)靈敏度進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見圖2。

圖2 陽性質(zhì)粒分子實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測結(jié)果Fig.2 Real-time fluoresce quantitative sensitivity curve of positive plasmid molecule

通常認(rèn)為，當(dāng)Ct值≤35時(shí)，可判定被檢樣品為陽性，以能夠檢出樣品的最低濃度作為相應(yīng)的檢出下限，由此可見，水貂、紫貂質(zhì)粒分子的靈敏度檢出下限分別為10-4、10-3ng/μL，均具有較高的檢測靈敏度。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以X軸代表質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)，Y軸代表Ct值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖3）[9]。

圖3 陽性質(zhì)粒分子實(shí)時(shí)熒光PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Real-time fluoresce quantitative standard curve of positive plasmid molecule

根據(jù)圖3標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，當(dāng)質(zhì)粒濃度從100 ng/μL～10-2ng/μL時(shí)，隨質(zhì)粒稀釋度的增加，對(duì)應(yīng)的Ct值也逐漸增大，且具有一定的梯度關(guān)系。兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率分別為103.211%、98.834%，且相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，說明在模板濃度范圍內(nèi)都具有很好的線性關(guān)系，可以用于樣品的定量分析。

2.2 不同公司引物探針對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的影響

將水貂、紫貂陽性質(zhì)粒分子進(jìn)行10倍梯度稀釋，從 100 ng/μL 稀釋至 10-5ng/μL，選取 Sangon、Biosune、Trkara三家公司合成的引物、探針對(duì)各濃度模板分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，對(duì)其反應(yīng)效果進(jìn)行比較分析，結(jié)果見圖4～圖5。

檢測結(jié)果表明，使用3家公司合成的引物、探針對(duì)各濃度模板進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)均可得到標(biāo)準(zhǔn)的S型擴(kuò)增曲線，所有擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)清楚，指數(shù)增長期明顯，基線平穩(wěn)無上揚(yáng)[10]，且擴(kuò)增曲線的重復(fù)性比較好，基線起峰范圍適當(dāng)，Ct值隨模板濃度下降而下降[11]，不同的引物、探針?biāo)玫降臋z出限略有不同。

如圖4 所示，利用 Sangon、Biosune、Trkara合成的引物、探針分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，水貂陽性質(zhì)粒的靈敏度檢出限分別為 10-4、10-4、10-3ng/μL。顯然，Sangon與Biosune合成引物、探針的靈敏度檢出限與Trkara相比要高一個(gè)濃度梯度，且重復(fù)性和反應(yīng)效率都略優(yōu)于Trkara公司的DNA聚合酶。

由圖5 可知，利用 Sangon、Biosune、Trkara合成的引物、探針分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，紫貂陽性質(zhì)粒的靈敏度檢出限分別為 10-3、10-2、10-1ng/μL?？梢姡琒angon公司合成引物、探針的靈敏度最高，且反應(yīng)效率高于其他兩家公司。

圖4 3家公司引物、探針實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)效果比較（水貂）Fig.4 Comparation of the effective of real-time fluorescence PCR reaction of primers and probes of three companies（mink）

圖5 3家公司引物、探針實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)效果比較（紫貂）Fig.5 Comparation of the effective of real-time fluorescence PCR reaction of primers and probes of three companies（Martes zibellina）

3 結(jié)論

引物、探針的正確選擇是PCR反應(yīng)成功的前提，高質(zhì)量的引物、探針對(duì)PCR擴(kuò)增效率具有很大的影響[12]。完成水貂、紫貂兩種陽性質(zhì)粒分子的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)這兩種質(zhì)粒分子均具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，同時(shí)對(duì)PCR反應(yīng)的關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)-引物、探針進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)Sangon公司合成的引物、探針的靈敏度略優(yōu)于Biosune與TaKaRa公司。為進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)時(shí)引物、探針的選擇提供一定的技術(shù)依據(jù)，為廣大食品企業(yè)及有關(guān)監(jiān)管部門監(jiān)測評(píng)價(jià)和控制動(dòng)物制品的品質(zhì)提供新的思路和有效手段，對(duì)于食品中動(dòng)物源性成分日常鑒定和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

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