畢丹丹，林娟，郭耀湘，葉秀云

（福州大學(xué)福建省海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350116）

隨著我國水產(chǎn)品總體產(chǎn)量的不斷提高[1]，水產(chǎn)品加工下腳料大量累積，據(jù)統(tǒng)計(jì)每年我國魚類加工中有近百萬噸蒸煮液亟待開發(fā)。由于缺乏有效的技術(shù)手段，目前企業(yè)對富含蛋白質(zhì)的水產(chǎn)品加工蒸煮液利用很少，多數(shù)采用直接排放，這不僅造成資源的浪費(fèi)，同時(shí)也對海洋和陸地環(huán)境造成污染[2-3]。因此對水產(chǎn)品加工廢棄液進(jìn)行綜合開發(fā)利用，變廢為寶，生產(chǎn)出各種農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品等行業(yè)所需的新產(chǎn)品，將大大降低主導(dǎo)產(chǎn)品的成本，產(chǎn)生較高的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會效益[4-6]。

魚罐頭加工蒸煮液中蛋白的回收和加工能給企業(yè)帶來很高的直接經(jīng)濟(jì)收益。研究表明，金槍魚蒸煮液中蛋白含量達(dá)4%，每年臺灣省光金槍魚罐頭加工所產(chǎn)生的蒸煮液中就至少含有400 t優(yōu)質(zhì)蛋白[7-10]。魚類加工蒸煮液中的蛋白是生物活性肽的優(yōu)質(zhì)來源，水產(chǎn)蛋白源生物活性肽具有多種生理功能。因此回收蒸煮液蛋白，酶解蛋白制備生物活性肽，有助于魚類加工企業(yè)實(shí)現(xiàn)廢棄液的環(huán)?；?、高值化開發(fā)，延長魚類加工企業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈，提升企業(yè)的競爭力，促進(jìn)產(chǎn)業(yè)升級，為低碳經(jīng)濟(jì)發(fā)展作貢獻(xiàn)[11-13]。

1 材料與方法

1.1 原料

鯖魚罐頭蒸煮液由福州百洋海味食品有限公司提供。

1.2 主要試劑

風(fēng)味蛋白酶（26 806 U/g，60℃，pH6）、胰蛋白酶（125 305 U/g，45 ℃，pH7）、堿性蛋白酶（121 847 U/g，50 ℃，pH9）、中性蛋白酶（52 043 U/g，45 ℃，pH7）：南寧龐博生物科技有限公司；BSA牛血清蛋白：Sigma公司；其余常用試劑均為分析純。

1.3 溶液配制

硼酸吸收液：將0.1 g甲基紅溶于100 mL無水乙醇，將0.1 g溴甲酚綠溶于100 mL無水乙醇。將二者以7∶10比例（體積比）混勻后，取出8.5 mL與500 mL 2%硼酸溶液混勻。

Lowry法試劑：

a試劑甲：取10 g碳酸鈉，2 g氫氧化鈉和0.25 g酒石酸鉀鈉，溶解于500 mL蒸餾水中，即為A液；取0.5 g硫酸銅溶解于100mL蒸餾水中，即為B液。每次使用前，將A液與B液按50∶1（體積比）混合，即為試劑甲。

b試劑乙：市售Folin-酚試劑，使用時(shí)稀釋3倍；

1.4 主要儀器設(shè)備

KDN-103F型全自動(dòng)凱氏定氮儀、HYP-3型高溫加熱爐：上海纖檢儀器有限公司；AE-6111型垂直電泳槽、AE-8150型電泳儀：日本ATTO公司；TP-114型分析天平：Denver instrument公司；MSC-300型中空纖維柱：上海摩速科學(xué)器材公司；CF16RXⅡ型高速冷凍離心機(jī)：日本HITACHI公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司。

1.5 方法

1.5.1 鯖魚罐頭蒸煮液的濃縮處理

將鯖魚罐頭蒸煮液采用10 kDa中空纖維膜進(jìn)行超濾濃縮，蛋白濃縮倍數(shù)為2.5倍。

1.5.2 鯖魚罐頭蒸煮濃縮液基本成分的測定

1.5.2.1 水分和灰分的測定

水分和灰分的測定采用恒溫干燥法[14]。

1.5.2.2 總蛋白質(zhì)的測定

總蛋白質(zhì)的測定采用凱氏定氮法[15]。

1.5.2.3 可溶性蛋白含量測定

可溶性蛋白含量測定采用Lowry法（Folin-酚）。

1）Folin-酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

往各試管中分別加入 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL250 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用蒸餾水補(bǔ)足1.0 mL；然后每支試管加入5 mL試劑甲，迅速混合，室溫放置10 min后逐管加入0.5 mL試劑乙（folin-酚試劑），迅速混勻（快速混合，以免造成試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確）；室溫放置30 min，以未加入蛋白質(zhì)溶液的試管為空白對照，在700 nm處測定各管中的吸光值OD700。以BSA濃度為橫坐標(biāo)，以O(shè)D700為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of BSA

2）樣品測定

將樣品溶液適當(dāng)稀釋后，在相同條件下按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟測定OD700，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品溶液中的可溶性蛋白含量。

1.5.2.4 脂肪的測定

脂肪的測定采用索式抽提法。

1.5.3 羥自由基清除能力的測定

羥自由基清除能力的測定參考李春美等[16]的方法，略有修改。

在試管中，依次加入0.5 mL不同濃度的樣品，2.0 mmol/L FeSO41.5 mL，6 mmol/L H2O21.5 mL 和6.0 mmol/L水楊酸1.5 mL，搖勻。于37℃反應(yīng)30 min后取出，流水冷卻，于波長510 nm下測定吸光值，以蒸餾水為空白對照，同時(shí)以抗壞血酸（VC）為陽性對照，所有試驗(yàn)設(shè)置3組平行。其對羥自由基清除率按以下公式計(jì)算：

羥自由基清除率/%=[1－（H1－H2）/H0]×100

式中：H0為未加清除劑的吸光值；H1為加入清除劑的吸光值；H2為試劑空白的吸光值。

1.5.4 各蛋白酶水解效果比較

由于不同蛋白酶水解作用的位點(diǎn)不同，其水解產(chǎn)物的抗氧化活性也不同。在相同的蛋白酶添加量5 000 U/g下，在酶各自的最適作用條件下反應(yīng)，以羥自由基清除率為指標(biāo)，比較不同蛋白酶的水解效果，選擇出用于酶解蒸煮液的蛋白酶。

1.5.5 蛋白酶對蒸煮液的酶解條件單因素試驗(yàn)

以羥自由基清除率為指標(biāo)，對選擇的兩種蛋白酶進(jìn)行添加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH值、反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，優(yōu)化酶解條件。

1.5.6 蒸煮液酶解條件響應(yīng)面試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)的結(jié)果為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)酶添加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH值的響應(yīng)面試驗(yàn)，以羥自由基清除率為指標(biāo)，分析各因素的顯著性，并建立數(shù)學(xué)模型，預(yù)測選擇的兩種蛋白酶酶解蒸煮液的最優(yōu)條件。

1.5.7 復(fù)合蛋白酶酶解工藝比較

由于蛋白酶對肽鍵作用具有專一性，不同酶的酶切位點(diǎn)不同，可以互補(bǔ)，進(jìn)而有效增大底物的水解程度，同時(shí)暴露出更多的活性氨基酸殘基[8]。根據(jù)選擇的兩種蛋白酶酶解蒸煮液的最優(yōu)條件，分別根據(jù)復(fù)配酶解（即把兩種需要的蛋白酶以一定配比混合在一起進(jìn)行酶解）和分段酶解（即把兩種需要的蛋白酶以分段形式按時(shí)間先后添加進(jìn)行酶解）設(shè)計(jì)4種復(fù)合蛋白酶酶解方案。以羥自由基清除率為指標(biāo)，比較各方案的水解效果，獲得最優(yōu)的復(fù)合酶解工藝。

2 結(jié)果與討論

2.1 鯖魚罐頭蒸煮液蛋白分子量分布及濃縮液基本成分測定

利用SDS-PAGE分析鯖魚罐頭蒸煮液中蛋白質(zhì)分子量分布，結(jié)果如圖2所示。

圖2 鯖魚罐頭蒸煮液蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-Page of the cooking liquid of canned of mackerel

可以看出，鯖魚罐頭蒸煮液中蛋白質(zhì)分子量主要分布在20.1 kDa以上，因此可以采用10 kDa中空纖維膜進(jìn)行蒸煮液蛋白的濃縮制備。

對濃縮后的蒸煮液進(jìn)行成分分析，結(jié)果如下：水分含量91%，粗蛋白質(zhì)含量0.16%，脂肪含量0.16%，灰分1.17%。

2.2 蛋白酶的選擇

各蛋白酶酶解蒸煮液產(chǎn)物的羥自由基清除率如圖3所示。

圖3 4種蛋白酶的羥自由基清除率隨反應(yīng)時(shí)間的變化曲線Fig.3 Curves of hydroxyl radical scavenging activity of different reaction time by four proteases

可以看出，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的羥自由基清除效果最好，反應(yīng)3 h后產(chǎn)物的羥自由基清除率可達(dá)31%；胰蛋白酶次之，反應(yīng)時(shí)間4 h后產(chǎn)物的羥自由基清除率為16%。所以后續(xù)選擇堿性蛋白酶和胰蛋白酶的酶解工藝進(jìn)行深入研究。

2.3 酶解蒸煮液條件的單因素分析

2.3.1 堿性蛋白酶酶解蒸煮液條件

在反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)pH值為9，反應(yīng)時(shí)間為3 h的條件下，酶添加量對于酶解產(chǎn)物的羥自由基清除率影響如圖4所示。

圖4 堿性蛋白酶添加量對羥自由基清除率的影響Fig.4 Effects of alcalase addition on hydroxyl radical scavenging activity

可以看出，隨著酶添加量的增加，羥自由基清除率先增加后減小。羥自由基清除率在酶添加量為7 000 U/g時(shí)達(dá)到最大。

在酶添加量為7 000 U/g，反應(yīng)pH值為9，反應(yīng)時(shí)間為3 h的條件下，反應(yīng)溫度對于酶解產(chǎn)物的羥自由基清除率影響如圖5所示。

圖5 反應(yīng)溫度對羥自由基清除率的影響Fig.5 Effects of reaction temperature on hydroxyl radical scavenging activity

可以看出，在一定的范圍內(nèi)，隨著溫度的增加，酶解液的羥自由基清除率呈現(xiàn)增長的趨勢，在60℃達(dá)到最大值。

在酶添加量為7 000 U/g，反應(yīng)溫度為60℃，反應(yīng)時(shí)間為3 h的條件下，不同反應(yīng)pH值對酶解產(chǎn)物羥自由基清除率的影響如圖6所示。

圖6 反應(yīng)pH值對羥自由基清除率的影響Fig.6 Effects of reaction pH on hydroxyl radical scavenging activity

可以看出，羥自由基清除率隨著反應(yīng)pH值的增大呈現(xiàn)先增后減的趨勢，在pH 8.5時(shí)達(dá)到最大值。

在酶添加量為7 000 U/g，反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)pH值為8.5，不同反應(yīng)時(shí)間對酶解產(chǎn)物羥自由基清除率的影響如圖7所示。

可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，羥自由基清除率呈現(xiàn)出一個(gè)緩慢的增長再下降的趨勢。在反應(yīng)3 h，對應(yīng)水解液羥自由基清除率達(dá)到最高，與圖3測定的結(jié)果一致，所以取3 h為堿性蛋白酶酶解反應(yīng)時(shí)間。

2.3.2 胰蛋白酶酶解蒸煮液條件

在反應(yīng)溫度為45℃，反應(yīng)pH值為7，反應(yīng)時(shí)間為4 h條件下，不同酶添加量對酶解產(chǎn)物羥自由基清除率的影響如圖8所示。

圖7 反應(yīng)時(shí)間對羥自由基清除率的影響Fig.7 Effects of reaction time on hydroxyl radical scavenging activity

圖8 胰蛋白酶酶添加量對羥自由基清除率的影響Fig.8 Effects of trypsin addition on hydroxyl radical scavenging activity

可以看出，羥自由基清除率先隨著酶添加量的增加而增大，在酶添加量為7 000 U/g時(shí)達(dá)到最大。

在酶添加量為7 000 U/g，反應(yīng)pH值為7，反應(yīng)時(shí)間為4 h條件下，不同反應(yīng)溫度對酶解產(chǎn)物羥自由基清除率的影響如圖9所示。

圖9 反應(yīng)溫度對羥自由基清除率的影響Fig.9 Effects of reaction temperature on hydroxyl radical scavenging activity

可以看出，羥自由基清除率隨著溫度的增加先增大后減小，在55℃時(shí)達(dá)到了最大。

在酶添加量為7 000 U/g，反應(yīng)溫度為45℃，反應(yīng)時(shí)間為4 h條件下，不同反應(yīng)pH值對酶解產(chǎn)物羥自由基清除率的影響如圖10所示。

圖10 反應(yīng)pH值對羥自由基清除率的影響Fig.10 Effects of reaction pH on hydroxyl radical scavenging activity

可以看出，羥自由基清除率隨著反應(yīng)pH值的增加而增大，在pH7.0時(shí)達(dá)到最大值，而后緩慢下降。

在酶添加量為7 000 U/g，反應(yīng)溫度為45℃，反應(yīng)pH值為7，不同反應(yīng)時(shí)間對酶解產(chǎn)物羥自由基清除率的影響如圖11所示。

圖11 反應(yīng)時(shí)間對羥自由基清除率的影響Fig.11 Effects of reaction time on hydroxyl radical scavenging activity

可以看出，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為4 h時(shí)，羥自由基清除率達(dá)到最大值，與圖3測定結(jié)果一致，所以選取4 h為胰蛋白酶酶解反應(yīng)時(shí)間。

2.4 酶解蒸煮液條件的響應(yīng)曲面分析

2.4.1 堿性蛋白酶

在單因素試驗(yàn)結(jié)果（酶添加量7 000 U/g，反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)pH 8.5，反應(yīng)時(shí)間3 h）的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)曲面法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對堿性蛋白酶酶解條件進(jìn)一步優(yōu)化。響應(yīng)曲面試驗(yàn)各因素水平及編碼見表1。

設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表1 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of RSM experiments

表2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Design matrix and the corresponding results of RSM experiments

利用Design-Expert 8.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，得到二次多項(xiàng)式回歸方程：

對模型進(jìn)行方差分析，如表3所示。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

續(xù)表3 方差分析表Continue table 3 Analysis of variance table

模型P值小于0.000 1，說明模型效應(yīng)顯著；失擬項(xiàng)P=0.347 0大于0.05，表明方程對實(shí)驗(yàn)的擬合程度比較好。其中 X1，X3，X1X2，X1X3，X12，X22和 X32項(xiàng)對羥自由基抑制率有顯著影響；X2項(xiàng)（即pH值）對回歸方程的影響不顯著，而其對應(yīng)的平方項(xiàng)影響顯著，說明實(shí)驗(yàn)選取的pH值水平已經(jīng)較好地接近于最優(yōu)解附近的曲面中心區(qū)域。由各項(xiàng)的F值可知，各個(gè)因素對羥自由基清除率的影響程度依次為：反應(yīng)溫度＞酶添加量＞pH值。

為驗(yàn)證模型預(yù)測的可靠性，在最優(yōu)條件下進(jìn)行反應(yīng)，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到羥自由基清除率平均值為39.53%，與預(yù)期值（39.59%）的相對誤差很小，說明了優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

利用已建立的數(shù)學(xué)模型對反應(yīng)溫度、pH值、酶添加量等條件進(jìn)行優(yōu)化，得出：反應(yīng)溫度58.59℃，反應(yīng)pH8.45，酶添加量為6 752.46 U/g，在此條件下，羥自由基清除率為39.59%。

2.4.2 胰蛋白酶

在單因素試驗(yàn)結(jié)果（酶添加量7 000 U/g，反應(yīng)溫度45℃，反應(yīng)pH 7，反應(yīng)時(shí)間4 h）的基礎(chǔ)上通過響應(yīng)曲面法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對胰蛋白酶酶解條件進(jìn)一步優(yōu)化。響應(yīng)曲面試驗(yàn)各因素水平及編碼見表4。

表4 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平表Table 4 Factors and levels of RSM experiments

響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表5所示。

利用Design-Expert 8.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，得到二次多項(xiàng)式回歸方程：

表5 響應(yīng)曲面試驗(yàn)方案以及結(jié)果Table 5 Design matrix and corresponding results of RSM experiments

對模型進(jìn)行方差分析如下表6所示。

模型P值小于0.000 1，模型效應(yīng)顯著；失擬項(xiàng)P=0.203 6大于0.05，表明方程對試驗(yàn)的擬合程度比較好。其中 X1，X3，X12，X22，X32對羥自由基抑制率有顯著影響；一次項(xiàng)X2即為pH值對回歸方程的影響不顯著，但是其對應(yīng)的平方項(xiàng)則影響顯著，說明該因素所取的試驗(yàn)水平，整體已經(jīng)較好地接近最優(yōu)解附近的曲面中心區(qū)域。根據(jù)各項(xiàng)的F值可知，單因素影響程度分別是：酶添加量＞反應(yīng)溫度＞pH值。

為驗(yàn)證模型預(yù)測的可靠性，在最優(yōu)條件下進(jìn)行反應(yīng)，進(jìn)行了3次平行試驗(yàn)，得到的羥自由基清除率平均值為19.83%；與預(yù)期值（19.94%）的相對誤差很小，說明了優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

利用已建立的數(shù)學(xué)模型對反應(yīng)溫度、pH值、酶添加量等條件進(jìn)行優(yōu)化，得出：反應(yīng)溫度為54.48℃，反應(yīng)pH7.12，酶添加量為7 450.54 U/g，在此條件下，羥自由基清除率為19.94%。

2.5 復(fù)合蛋白酶酶解工藝研究

根據(jù)上述兩個(gè)單酶的響應(yīng)曲面試驗(yàn)可以確定，無論是堿性蛋白酶還是胰蛋白酶，在單酶酶解過程中影響作用都是反應(yīng)溫度＞反應(yīng)pH值；所以在設(shè)計(jì)復(fù)合酶酶解試驗(yàn)時(shí)，統(tǒng)一反應(yīng)pH值，而在不同的反應(yīng)階段，改變兩種蛋白酶的酶解反應(yīng)溫度。

根據(jù)單酶響應(yīng)曲面的優(yōu)化結(jié)果，堿性蛋白酶的反應(yīng)溫度設(shè)為59℃，而胰蛋白酶的反應(yīng)溫度設(shè)為55℃，反應(yīng)pH值統(tǒng)一設(shè)定為pH 8。

根據(jù)獲得堿性蛋白酶和胰蛋白酶解蒸煮液的最有條件，設(shè)計(jì)的4種復(fù)合酶反應(yīng)體系如表7所示。酶解產(chǎn)物的羥自由基清除率如圖12所示。

表7 不同復(fù)合酶酶解反應(yīng)體系Table 7 Experiments for different kinds of compound proteases

圖12 復(fù)合酶組合反應(yīng)對羥自由基抑制率的影響Fig.12 Effects of mixed proteases on hydroxyl radical scavenging activity

可以看出，試驗(yàn)方案4（先添加胰蛋白酶，反應(yīng)時(shí)間4 h，反應(yīng)pH8，反應(yīng)溫度55℃；再添加堿性蛋白酶，反應(yīng)時(shí)間3 h，反應(yīng)pH8，反應(yīng)溫度59℃。）的效果最好：即先添加胰蛋白酶進(jìn)行反應(yīng)，酶添加量7 450.54 U/g，溫度55℃，pH 8，反應(yīng)時(shí)間4 h；再添加堿性蛋白酶進(jìn)行反應(yīng)，酶添加量6 752.46 U/g，溫度59℃，pH 8，反應(yīng)時(shí)間3 h。其對應(yīng)的羥自由基清除率高達(dá)61%，比堿性蛋白酶單酶水解結(jié)果39.53%提高了21.47%，比胰蛋白酶單酶水解結(jié)果19.83%提高了40.17%，而且要高于堿性蛋白酶單酶）和胰蛋白酶單酶的測定結(jié)果疊加之和。由此可見，使用復(fù)合酶酶解能夠?qū)崿F(xiàn)酶切位點(diǎn)的互補(bǔ)，得到更多具有生物活性的肽段，進(jìn)一步提高水解液的抗氧化活性。

3 結(jié)論

1）采用SDS-PAGE方法測定鯖魚罐頭蒸煮液中的蛋白分子量主要分布在20.1 kDa以上，選擇10 kDa的中空纖維膜對蒸煮液蛋白進(jìn)行濃縮，相比于蒸煮原液的1%蛋白含量，濃縮后蛋白含量提高了4倍。

2）以羥自由基清除率為指標(biāo)，對風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶的酶解效果進(jìn)行比較，得出胰蛋白酶、堿性蛋白酶的水解效果較好。

3）以羥自由基清除率為指標(biāo)，對堿性蛋白酶的酶解工藝進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗(yàn)，再采用響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對堿性蛋白酶的酶解工藝進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，得出最佳條件為：反應(yīng)溫度58.59℃，反應(yīng)pH8.45，酶添加量為6 752.46 U/g，在此條件下，羥自由基清除率為39.59%。

4）以羥自由基清除率為指標(biāo)，對胰蛋白酶的酶解工藝進(jìn)行單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，再采用響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對胰蛋白酶的酶解工藝進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，得出最佳條件為：反應(yīng)溫度為54.48℃，反應(yīng)pH7.12，酶添加量為7 450.54 U/g，在此條件下，羥自由基清除率為19.94%。

5）根據(jù)響應(yīng)曲面的影響因素大小關(guān)系，設(shè)計(jì)出胰蛋白酶和堿性蛋白酶的復(fù)合酶解反應(yīng)條件，得出復(fù)合分段酶解的效果最好。最佳的工藝條件為：先添加胰蛋白酶進(jìn)行反應(yīng)，溫度為55℃，酶添加量為7 450.54 U/g，反應(yīng)pH為8，反應(yīng)時(shí)間為4 h；而后添加堿性蛋白酶進(jìn)行反應(yīng)，酶添加量為6 752.46 U/g，溫度為59℃，反應(yīng)pH為8，反應(yīng)時(shí)間為3 h。其對應(yīng)的羥自由基清除率達(dá)到了61%。

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