（江蘇省張家港市金港鎮(zhèn)動(dòng)物防疫站，江蘇張家港 215600）

對(duì)于奶業(yè)的發(fā)展來(lái)說(shuō)，乳腺炎可以說(shuō)是危害極為嚴(yán)重的，而且是在全球范圍廣泛存在的，很容易導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。究其原因的話(huà)，主要就是由于病原菌導(dǎo)致乳腺組織遭受感染，進(jìn)而出現(xiàn)一定程度的損傷，最終對(duì)奶的產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生不良的影響，有時(shí)候也會(huì)導(dǎo)致一些臨床癥狀的出現(xiàn)。

1 奶牛乳腺炎常見(jiàn)致病菌多重PCR檢測(cè)方法的研究與分析

對(duì)于臨床標(biāo)本病原菌的檢驗(yàn)方式，目前所采用的檢驗(yàn)方法依然是培養(yǎng)法，也就是說(shuō)等到標(biāo)本的采集完成了以后，先通過(guò)增菌培養(yǎng)液達(dá)到增菌的目的，等到有陽(yáng)性結(jié)果呈現(xiàn)的時(shí)候，再進(jìn)行單個(gè)菌落的分離，結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)等進(jìn)行確診。這種方法準(zhǔn)確度比較高，但是時(shí)間消耗是比較長(zhǎng)的，所以從臨床的需求來(lái)看，是無(wú)法很好滿(mǎn)足實(shí)際要求的。還有一個(gè)問(wèn)題就是，病原菌在剛剛侵襲的時(shí)候，細(xì)菌的數(shù)量是比較少的，或者說(shuō)只有當(dāng)乳中有大量淋巴細(xì)胞或者體細(xì)胞出現(xiàn)的時(shí)候，能夠引起臨床感染癥狀，這樣的話(huà)，傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)可能呈現(xiàn)陰性。PCR方法的出現(xiàn)可以說(shuō)是恰好能夠彌補(bǔ)細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)的不足，也逐漸成為乳腺炎病原菌鑒定的一種有效方法。這種檢測(cè)方法最為典型的特點(diǎn)是樣品劑量少，檢測(cè)時(shí)間比較短，這也是能夠在臨床上廣泛應(yīng)用與推廣的重要原因。

2 關(guān)于奶牛乳腺炎常見(jiàn)致病菌多重PCR檢測(cè)方法建立的研究與分析

2.1 研究的材料與方法

在實(shí)驗(yàn)中會(huì)用到菌株、培養(yǎng)基以及相關(guān)的試劑，其中各類(lèi)對(duì)照菌種是由某大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室所提供的，所用到的試劑盒主要就是DNA回收試劑盒以及質(zhì)粒DNA提取試劑盒，是由上海某公司所提供的；另外，還需要用到PCR試劑盒，實(shí)驗(yàn)中的增強(qiáng)劑是從北京某公司所購(gòu)買(mǎi)的，載體等均是從某生物工程公司購(gòu)買(mǎi)的。

在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，需要做好三種主要致病病原菌種的分離與鑒定，步驟基本是相同的，首先需要做好的培養(yǎng)基的分離工作，然后進(jìn)行生化性鑒定，最終完成分離與鑒定，確定是否就是這種菌種。

2.2 樣本的采集

樣品主要是源于當(dāng)?shù)氐牧鶄€(gè)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)，進(jìn)行了臨床乳腺炎奶樣的采集，樣本的總數(shù)量是34份。乳腺炎一旦有了臨床的癥狀表現(xiàn)，往往就是擠奶的工作人員在工作過(guò)程中所發(fā)現(xiàn)的，在進(jìn)行樣本的采集之前，需要首先做好清潔工作，采樣后立即送實(shí)驗(yàn)室檢查，注意時(shí)間的間隔不能夠超過(guò)24h。

2.3 引物的設(shè)計(jì)

引物設(shè)計(jì)的主要原理就是金黃色葡萄球菌和無(wú)乳鏈球菌的序列位于16SrRNA和23sRNA之間，同時(shí)進(jìn)行了片段的擴(kuò)增，針對(duì)兩對(duì)引物，片段分別擴(kuò)增了420bp和270bp，而酵母菌的片段擴(kuò)增長(zhǎng)度則是730bp左右。

首先，關(guān)于金黃色葡萄球菌

其次，關(guān)于無(wú)乳鏈球菌

第三，關(guān)于酵母真菌

2.4 PCR的特異性檢測(cè)

關(guān)于PCR的特異性檢測(cè)，主要就是通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的3對(duì)引物，對(duì)于不同類(lèi)型的細(xì)菌分別進(jìn)行PCR的擴(kuò)增，除了無(wú)乳鏈球菌、酵母菌以及金黃色葡萄球菌有擴(kuò)增出目的條帶，其余都沒(méi)有，這樣的話(huà)，就可以表明這種方法的特異性表現(xiàn)是比較理想的。

圖 不同種類(lèi)對(duì)照細(xì)菌的PCR擴(kuò)增

2.5 多重PCR牛乳腺炎檢測(cè)方法的建立

由于受到退火溫度、退火的具體時(shí)間以及反應(yīng)條件等多重因素的影響，最終對(duì)于多重PCR反應(yīng)而言，最佳的反應(yīng)條件應(yīng)該是這樣的：首先預(yù)變性應(yīng)該是在94℃條件下發(fā)生的，時(shí)間應(yīng)該是三分鐘，然后變性同樣是在94℃的條件下進(jìn)行的，只是時(shí)間僅僅是1min，然后等到溫度降低到57.5℃的時(shí)候，開(kāi)始退火，時(shí)間是40s，在溫度是72℃的條件下進(jìn)行延伸，時(shí)間是40s，這樣的循環(huán)在進(jìn)行36次之后，在72℃的溫度條件下進(jìn)行反應(yīng)，時(shí)間是10min。

2.6 多重PCR的敏感性檢測(cè)

從多重PCR的敏感性檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，在經(jīng)過(guò)了生理鹽水稀釋處理之后，無(wú)論是對(duì)于金黃色葡萄球菌，抑或是無(wú)乳鏈球菌，以及酵母真菌來(lái)說(shuō)，多重PCR的最小檢測(cè)濃度都是相同的，但是對(duì)于牛奶中不同菌種檢測(cè)的最小濃度是有所差異的。

圖PCR的擴(kuò)增分析

2.7 多重PCR對(duì)乳腺炎臨床樣品的檢測(cè)

通過(guò)已經(jīng)建立的多重PCR檢測(cè)體系，對(duì)于34份樣本進(jìn)行了檢測(cè)，從檢測(cè)的結(jié)果來(lái)看，這種檢測(cè)方法是高效快速的，是能夠有效檢測(cè)出致病菌種的。

3 討論

文章主要就是通過(guò)試驗(yàn)建立了多重PCR的方法，主要目的就在于希望能夠?qū)τ趯?dǎo)致奶牛感染乳腺炎的三種致病病菌進(jìn)行檢測(cè)，分別是金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌以及酵母菌，在實(shí)驗(yàn)的具體過(guò)程中，對(duì)于PCR模板的制備主要是運(yùn)用了兩種方法，在運(yùn)用CTAB方法對(duì)其進(jìn)行抽提的時(shí)候，如果是從奶樣中進(jìn)行抽提的話(huà)，為了保證預(yù)期的良好效果，需要首先對(duì)樣品進(jìn)行洗滌，而且洗滌最好要充分一些，主要目的是為了將鈣離子去除，盡量避免其可能導(dǎo)致的影響。

相對(duì)于常規(guī)的方法來(lái)說(shuō)，多重PCR是同時(shí)涉及多個(gè)模塊和多對(duì)引物的，這樣的話(huà)，可能對(duì)其產(chǎn)生影響的因素也是比較多的。需要注意的是，在進(jìn)行多重PCR檢測(cè)方法建立的實(shí)際過(guò)程中，最為關(guān)鍵的就是引物的設(shè)計(jì)，總的來(lái)說(shuō)，引物不僅僅應(yīng)該具有較強(qiáng)的特異性，而且對(duì)于引物的含量應(yīng)該是大致相同的，解鏈的時(shí)候，對(duì)于溫度的要求基本是相同的，這樣的話(huà)，如果退火溫度相同的話(huà)，那么雖然基因的片段不同，但是擴(kuò)增的效果都是比較理想的。

還有一點(diǎn)必須認(rèn)識(shí)到，就是擴(kuò)增得到的產(chǎn)物如果經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳處理之后，分帶是清晰的，也就是說(shuō)，擴(kuò)增片段不僅僅存在大小的差異，而且是能夠清晰加以辨別的。

最后就是對(duì)于引物之間可能存在的關(guān)系，必須予以充分考慮，這樣的話(huà)能夠有效避免二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，否則就很容易導(dǎo)致多重?cái)U(kuò)增失敗或者是呈現(xiàn)出假陽(yáng)性，進(jìn)而導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。

對(duì)于多重PCR來(lái)說(shuō)，之所以需要對(duì)其反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，主要的原因就是為了尋求不同引物濃度在不同的反應(yīng)體系中的最佳配比，實(shí)現(xiàn)引物濃度的平衡，最終保證任意一個(gè)靶位點(diǎn)都能夠得到足夠的擴(kuò)增值。

還有一點(diǎn)就是要想實(shí)現(xiàn)多重PCR擴(kuò)增效率的提升，就要在適當(dāng)?shù)某潭确秶鷥?nèi)增加模板的濃度以及聚合酶的濃度，如果擴(kuò)增的效率并未因此得到改善的話(huà)，最好是能夠讓引物的濃度得以成倍增加，主要的舉措就是復(fù)性和延伸的溫度依次降低。

如果在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，出現(xiàn)了比較嚴(yán)重的非特異性擴(kuò)增，那么必須首先通過(guò)一些常規(guī)的方法對(duì)引物進(jìn)行確定，明確是由于哪一對(duì)引物的存在而導(dǎo)致的這種非特異性擴(kuò)增，然后對(duì)引物進(jìn)行重新設(shè)計(jì)。

事實(shí)上，在引物的選擇上，所選擇的三對(duì)引物在擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度方面，差異并非顯著，通過(guò)濃度為1.5%的瓊脂糖電泳就能夠加以區(qū)分。既然擴(kuò)增的片段補(bǔ)償，那么在進(jìn)行模板制備的時(shí)候，選擇水煮法就是可以的。另外，可以選擇適當(dāng)區(qū)間序列作為擴(kuò)增的目的片段，主要目的就是為了提升PCR的陽(yáng)性檢出率。

事實(shí)上，從臨床的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，如果是對(duì)于已經(jīng)采集到的34份奶樣同時(shí)使用傳統(tǒng)方法和二重以及三重檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)的話(huà)，會(huì)發(fā)現(xiàn)相對(duì)于傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)方法來(lái)說(shuō)，無(wú)論是二重，抑或是三重，檢出的符合率都要更高一些，而且通過(guò)PCR方法的檢出率明顯要高于細(xì)菌學(xué)的檢測(cè)方法。

另外，在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，如果是對(duì)多重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化的話(huà)，方法快速、準(zhǔn)確、科學(xué)，優(yōu)化的效率得到顯著提升。事實(shí)上，能夠?qū)Χ嘀氐腜CR反應(yīng)產(chǎn)生影響的因素有很多，例如引物的使用量等，研究表明，引物的使用量和產(chǎn)物的大小是成正比例的。

對(duì)于奶牛的養(yǎng)殖來(lái)說(shuō)，乳腺炎可以說(shuō)是一種極為常見(jiàn)的疾病，而且其主要的致病原因就在于多重病原菌對(duì)于奶牛乳腺組織的侵襲所導(dǎo)致的，這其中金黃色葡萄球菌以及大腸桿菌等都是奶牛乳腺炎最為主要的致病菌種，通過(guò)對(duì)當(dāng)?shù)貛讉€(gè)規(guī)?；膛?chǎng)乳腺炎進(jìn)行細(xì)菌的分離與鑒定，明確這三種菌種在當(dāng)?shù)嘏?chǎng)的分布情況，再針對(duì)三種不同的菌種，依托軟件，立足實(shí)際，進(jìn)行了三對(duì)特異性引物的設(shè)計(jì)，在此基礎(chǔ)上，建立了多重的PCR反應(yīng)體系，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行科學(xué)和合理的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)多重PCR反應(yīng)體系效率的顯著改善與提升。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用傳統(tǒng)的方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離與鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種致病病原菌在奶牛場(chǎng)是廣泛的存在的，只是檢出率略有差異，其中無(wú)乳鏈球菌檢出率是最高的，金黃色葡萄球菌次之，而酵母菌的檢出率相對(duì)于其他兩種菌種而言，是比較低的。在感染的方式方面，金黃色葡萄球菌單獨(dú)感染率將近5%，無(wú)乳鏈球菌的單獨(dú)感染率將近18%，而酵母菌是不會(huì)單獨(dú)發(fā)生感染的，混合感染率則將近78%。

雖然隨著奶牛養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，當(dāng)?shù)匾?guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)的數(shù)量日趨增多，但是由于在飼養(yǎng)管理方面依然延續(xù)了傳統(tǒng)的、粗放式的手段，再加上長(zhǎng)期的擠奶等操作很容易導(dǎo)致乳腺組織處于高負(fù)荷的運(yùn)轉(zhuǎn)情況下，抵抗力不斷下降，感染的概率大大增加；再加上管理不夠科學(xué)，不夠規(guī)范，衛(wèi)生條件不理想，環(huán)境細(xì)菌超標(biāo)現(xiàn)象嚴(yán)重，可以說(shuō)都為各種奶牛乳腺炎主要致病菌的生長(zhǎng)和繁殖提供了生長(zhǎng)與繁殖的條件。

綜上所述，對(duì)于奶牛乳腺炎的發(fā)病機(jī)制以及主要的致病病原菌都有了更加深入、細(xì)致的認(rèn)識(shí)和了解，同時(shí)在此基礎(chǔ)上，在對(duì)各種病原菌進(jìn)行分離與鑒定的基礎(chǔ)上，針對(duì)多重PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化進(jìn)行了分析，可以說(shuō)為今后進(jìn)一步做好乳腺炎的檢測(cè)，提供了一定的依據(jù)和參考，為后期進(jìn)一步做好綜合性防控奠定了堅(jiān)實(shí)、有力的基礎(chǔ)。當(dāng)然，如果想要降低乳腺炎的發(fā)生概率，盡快實(shí)現(xiàn)飼養(yǎng)管理的科學(xué)化、合理化以及規(guī)范化是至關(guān)重要的。

[1]張善瑞，王長(zhǎng)法，高運(yùn)東，等.應(yīng)用PCR方法檢測(cè)奶牛乳腺炎主要病原菌[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，28（4）：78-80.

[2]布日額，郎景民，華育平，等.牛乳中無(wú)乳鏈球菌PCR快速檢測(cè)方法的建立[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2009，（19）：17-19.

[3]王麗君，陳偉，張利莉.奶牛乳腺炎相關(guān)鏈球菌PCR檢測(cè)方法的建立[J].畜牧與獸醫(yī)，2010，42（10）：7-10.