杜芳玲， 梅艷芳， 萬(wàn)臘根， 魏丹丹， 張 偉， 向天新， 劉 洋

肺炎克雷伯菌是醫(yī)院感染和社區(qū)獲得性感染的重要病原體，其可造成肺部感染、尿路感染、軟組織感染及血流感染等多種感染[1]。高黏液表型肺炎克雷伯菌（HMKP）一直作為高毒力肺炎克雷伯菌的重要特征而被廣泛關(guān)注[2]。自20世紀(jì)80年代首次從肝膿腫患者中分離到碳青霉烯類耐藥-HMKP（CR-HMKP）以來(lái)，因其可發(fā)生遷徙性播散感染，已經(jīng)成為了一個(gè)威脅全球公共健康問(wèn)題的病原體[3]。HMKP常在瓊脂平皿上表現(xiàn)出高黏液表型，常與rmpA、氣桿菌素等多種毒力基因相關(guān)[3]。越來(lái)越多的研究表明HMKP表現(xiàn)耐藥給臨床治療帶來(lái)了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[4]。一直以來(lái)，碳青霉烯類抗生素作為抗擊革蘭陰性桿菌感染的最后一道防線，但隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛使用以及質(zhì)粒介導(dǎo)的碳青霉烯酶的流行，導(dǎo)致CR-HMKP逐漸在全球范圍內(nèi)被報(bào)道[5]。雖然Zhan等[6]首次闡述了溫州地區(qū)ST11型CR-HMKP菌株的暴發(fā)流行，但對(duì)其產(chǎn)生原因及莢膜血清分型等方面的內(nèi)容未作深入的分析。本研究主要通過(guò)對(duì)CR-HMKP的篩選，分析CR-HMKP的莢膜血清分型及毒力基因攜帶，并對(duì)細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類耐藥機(jī)制可能產(chǎn)生的原因進(jìn)行深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 收集南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院2012－2016年碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌675株，其中CR-HMKP 18株（2.7%）。所有菌株采用VITEK 2-Compact 全自動(dòng)微生物鑒定儀進(jìn)行鑒定。

1.1.2 主要儀器和試劑 ExTaq酶和DNA Marker購(gòu)自大連TaKaRa公司；VITEK 2-Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀（法國(guó)生物梅里埃有限公司）、 PCR儀及電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）、凝膠成像儀（北京六一公司）。

1.2 方法

1.2.1 抗菌藥物敏感性試驗(yàn)及表型試驗(yàn) 抗菌藥物敏感性試驗(yàn)采用VITEK 2-Compact全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)，結(jié)果根據(jù)2016年美國(guó)CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。用改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)（mCIM）方法初步篩查碳青霉烯酶[7]。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922和肺炎克雷伯菌ATCC 700603（由本實(shí)驗(yàn)室保存），疊氮鈉耐藥大腸埃希菌J53為接合試驗(yàn)受體菌。

1.2.2 拉絲試驗(yàn) 將受試肺炎克雷伯菌菌株接種于5%羊血瓊脂平皿，于37℃孵育過(guò)夜，用細(xì)菌接種環(huán)輕柔向上挑起菌落，如不能挑起黏液絲或黏液絲長(zhǎng)度小于5 mm，判為黏液絲試驗(yàn)陰性；如挑起的黏液絲長(zhǎng)度大于或等于5 mm，判為黏液絲試驗(yàn)陽(yáng)性。

1.2.3 耐藥基因及毒力基因的檢測(cè) 參照文獻(xiàn) [5，8-9]，采用PCR法檢測(cè)所有碳青霉烯酶基因（blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaOXA-48）、ESBL基因（blaTEM、blaSHV、blaCTX-M）、質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥（PMQR）基因（qnrA、qnrB、qnrC、qnrS、acc(6')-Ib-cr）、16S rRNA甲基化酶基因（rmtB、rmtC、armA、armB）、毒力基因（aerobactin、iroN、magA、rmpA、rmpA2、alls、mrkD）。陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物回收后由上海生物工程公司完成測(cè)序，與GenBank序列進(jìn)行比對(duì)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）.

1.2.4 質(zhì)粒接合試驗(yàn) 臨床分離的CR-HMKP作為供體菌，大腸埃希菌J53為受體菌。供體菌和受體菌接種中國(guó)藍(lán)平皿，37 ℃孵育過(guò)夜。挑取單個(gè)菌落接種至5 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃搖床孵育4 h。取供體菌菌液10 μL和受體菌菌液20 μL混合，接種于4 mL LB肉湯，35℃孵育18 h。吸取100 μL上述過(guò)夜培養(yǎng)的混合菌液均勻涂布到篩選平皿（0.5 mg/ L亞胺培南+200 mg/L疊氮鈉），37℃孵育過(guò)夜。挑取篩選平皿上的單菌落轉(zhuǎn)至另一個(gè)篩選平皿，37℃孵育過(guò)夜，對(duì)轉(zhuǎn)移接合子采用VITEK 2-Compact 全自動(dòng)微生物鑒定儀進(jìn)行生化鑒定和藥敏試驗(yàn)，對(duì)接合子做mCIM試驗(yàn)以篩查是否產(chǎn)碳青霉烯酶，并通過(guò)PCR及測(cè)序予以證實(shí)。

1.2.5 莢膜血清分型 參照文獻(xiàn) [8]，采用PCR檢測(cè)K1、K2、K5、K20、K54、K57等常見(jiàn)莢膜血清分型，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后BLAST比對(duì)確認(rèn)；同時(shí)采用PCR方法擴(kuò)增肺炎克雷伯菌的wzi基因[10]并測(cè)序，再與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，分析菌株的wzi分型（http：//bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/）。

1.2.6 脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE） 取單個(gè)細(xì)菌菌落接種于LB培養(yǎng)基中，震蕩過(guò)夜。用菌液與低熔點(diǎn)膠混勻后灌模，蛋白酶K消化4 h，TE緩沖液清洗后使用Xba I內(nèi)切酶消化過(guò)夜。配制1%瓊脂糖凝膠，在CHEF-DR III（美國(guó)Bio-Rad公司）上進(jìn)行PFGE。電泳參數(shù)：6 V/cm，脈沖間隔時(shí)間3～40 s，0.5×TBE電泳緩沖液，電場(chǎng)角度120°，電泳時(shí)間24 h。

1.2.7 多位點(diǎn)序列分型（MLST）[11]采用PCR方法擴(kuò)增肺炎克雷伯菌的7個(gè)管家基因（rpoB、phoE、gapA、infB、mdh、tonB、pgi）并進(jìn)行測(cè)序，再與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，分析菌株的序列型，標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程參見(jiàn)MLST網(wǎng)站（http：//bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/）。

2 結(jié)果

2.1 CR-HMKP流行病學(xué)資料

2012年1月－2016年12月本院住院患者分離CR-HMKP 18株，其中11株分離自痰液標(biāo)本，3株分離自血液，2株分離自分泌物標(biāo)本，分離自尿液和導(dǎo)管標(biāo)本各1株?；颊咧?0例為男性，8例為女性， 13例來(lái)自ICU。如表1所示。治療中11例患者使用過(guò)碳青霉烯類藥物，8例使用過(guò)頭孢哌酮-舒巴坦。從預(yù)后情況看出，從血液中分離出CR-HMKP的3例患者最終死亡，其他患者中經(jīng)抗生素治療感染好轉(zhuǎn)11例，多數(shù)采用的是聯(lián)合抗菌藥物治療。見(jiàn)表1。

表1 18例感染CR-HMKP菌株患者的臨床資料Table 1 Clinical data of 18 patients infected with carbapenem resistant hypermucoviscous Klebsiella pneumoniae

表1（續(xù)）Table 1（continued）

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

18株菌對(duì)抗菌藥物呈現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重。其中對(duì)β內(nèi)酰胺類藥物和喹諾酮類藥物的耐藥率最高，對(duì)頭孢噻肟、哌拉西林-他唑巴坦、頭孢曲松、頭孢唑林、亞胺培南、美羅培南、厄他培南、頭孢吡肟的耐藥率均為100%（18/18）；而對(duì)阿米卡星耐藥率為72.2%（13/18）。見(jiàn)表2。

2.3 莢膜血清分型及毒力基因檢測(cè)

18株CR-HMKP菌株中僅檢出1株K1型菌株，2株K2型菌株， 1株K57型菌株，1株K20型菌株。經(jīng)wzi分型測(cè)序確認(rèn)發(fā)現(xiàn)13株wzi64-K14.64型菌株，1株wzi20-K20，2株wzi2-K2，1株wzi128-K1，1株wzi206-K57。所有菌株均攜帶有毒力相關(guān)基因，其中有rmpA（88.9%， 16/18）、magA（5.6%， 1/18）、iroN（83.3%， 15/18）、aerobactin（27.8%， 5/18）、rmpA2（66.7%，12/18）及mrkD（100%， 18/18）。見(jiàn)表3。

2.4 耐藥表型和耐藥基因檢測(cè)

17株CR-HMKP菌株mCIM試驗(yàn)陽(yáng)性，并PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序證實(shí)全部攜帶碳青霉烯酶，包括17株攜帶blaKPC-2基因，2株攜帶blaNDM-l基因。也存在部分β內(nèi)酰胺酶、PMQR的16S rRNA甲基化酶基因：3株攜帶blaCTX-M-3，18株攜帶blaCTX-M-14，16株攜帶blaTEM-1，17株攜帶blaSHV-12，18株攜帶qnrS1基因，5株攜帶rmtB基因。見(jiàn)表3。

2.5 質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)結(jié)果

17株CR-HMKP菌株中有5株可以通過(guò)轉(zhuǎn)移接合將blaKPC-2基因轉(zhuǎn)移給大腸埃希菌J53菌株，轉(zhuǎn)移頻率多在105～107。所有接合子均通過(guò)VITEK 2-Compact鑒定，并與大腸埃希菌J53進(jìn)行同源性確認(rèn)一致。部分菌株接合試驗(yàn)可使碳青霉烯類抗生素對(duì)受體菌大腸埃希菌J53的MIC值從≤0.062 5或0.125 mg/L上升到16或32 mg/L，其他β內(nèi)酰胺類藥物MIC也有較大幅度的升高，見(jiàn)表4。

2.6 PFGE及MLST分析菌株同源性

MLST結(jié)果顯示18株CR-HMKP菌株共分為3個(gè)ST分型，其中ST11型15株，ST86型2株，ST412型1株。而PFGE將18株CR-HMKP菌株分為3種PFGE型，其中A型15株，包括A1型10株、A2型5株；B型2株；C型1株（圖1）。

表2 18株CR-HMKP對(duì)抗菌藥物敏感率和耐藥率Table 2 Susceptibility of 18 strains of carbapenem resistant hypermucoviscous Klebsiella pneumoniae to antimicrobial agents[ n (%) ]

3 討論

HMKP因其毒力強(qiáng)、可引起肝膿腫及播散性感染而被廣泛報(bào)道[12]，目前已在中國(guó)各大醫(yī)院中均有報(bào)道。然而，關(guān)于CR-HMKP菌株的耐藥機(jī)制及分子流行病學(xué)研究卻較為少見(jiàn)。本研究通過(guò)對(duì)肺炎克雷伯菌高黏型的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)CR-HMKP在CRKP菌株檢出率達(dá)2.7%（18/675），高于之前的散發(fā)報(bào)道[13]。

莢膜一直以來(lái)作為肺炎克雷伯菌的主要毒力因子，而根據(jù)莢膜多糖建立的分型方法可將肺炎克雷伯菌分為不同的莢膜血清分型。到目前為止，肺炎克雷伯菌至少包含78個(gè)莢膜血清型，其中K1、K2、K5、K16、K20、K54、K57和KN1被認(rèn)為是高毒力肺炎克雷伯菌的主要莢膜血清分型[14]。Zhan等[6]曾發(fā)現(xiàn)溫州地區(qū)暴發(fā)流行的ST11型CR-HMKP菌株主要為K20莢膜血清型。Zhang等[15]曾從5株CR-HMKP菌株中發(fā)現(xiàn)僅1株為K2型，而不同的是，Yao等[4]從7株CR-HMKP菌株中發(fā)現(xiàn)6株均為K2莢膜血清型，也有研究發(fā)現(xiàn)5株致死性感染的CR-HMKP菌株均為K1。而本課題組之前研究也發(fā)現(xiàn)1株產(chǎn)KPC酶的K1型CR-HMKP菌株[5]。本研究從CR-HMKP菌株中檢出4種高毒力的莢膜血清型（K1、K2、K20、K57），并通過(guò)wzi分型發(fā)現(xiàn)分別為wzi128-K1、wzi2-K2、wzi20-K20及wzi206-K57型，其他CR-HMKP菌株的莢膜血清型均為wzi64-K14.64型，這表明本地區(qū)CR-HMKP菌株除存在于常見(jiàn)的高毒力莢膜血清型CR-HMKP菌株外，大部分菌株還是屬于常見(jiàn)“經(jīng)典”肺炎克雷伯菌（cKP）菌株轉(zhuǎn)化而來(lái)。此外，單純采用PCR進(jìn)行莢膜血清型分型對(duì)CR-HMKP的毒力判斷或存在一定的不確定性，或可通過(guò)聯(lián)合wzi分型等CPS檢測(cè)方法綜合評(píng)估，然而其具體毒力需要通過(guò)相關(guān)毒力學(xué)試驗(yàn)進(jìn)一步研究。

表3 18株CR-HMKP菌株的表型特征、分子流行及耐藥毒力分子特征Table 3 Phenotypic and genotypic profiles of 18 strains of carbapenem resistant hypermucoviscous Klebsiella pneumoniae

表3（續(xù)）Table 3（continued）

表4 受體菌J53、CR-HMKP供體菌及其接合子Table 4 Susceptibility of the carbapenem resistant hypermucoviscous Klebsiella pneumoniae donor strain，recipient J53 and the conjugant

圖1 CR-HMKP菌株P(guān)FGE電泳圖Figure 1 Pulsed field gel electrophoresis patterns of carbapenem resistant hypermucoviscous Klebsiella pneumoniae strains

糖尿病一直是被看作為CR-HMKP的重要危險(xiǎn)因素[16]。本研究?jī)H發(fā)現(xiàn)16.7%（3/18）CRHMKP感染患者存在糖尿病基礎(chǔ)疾病，但有83.3%（15/18）的患者CR-HMKP感染時(shí)血糖升高，這表明血糖的控制或是影響CR-HMKP感染更為關(guān)鍵的因素。本研究中61.1%（11/18）的CR-HMKP感染患者在CR-HMKP菌分離前2周內(nèi)使用過(guò)碳青霉烯類抗生素。碳青霉烯類抗生素的使用或可對(duì)CR-HMKP菌產(chǎn)生選擇作用，促進(jìn)了CR-HMKP菌的流行。77.3%（13/18）的CR-HMKP菌株來(lái)自于各ICU，且CR-HMKP感染后病死率高達(dá)44.4%（8/18），這表明CR-HMKP菌更易對(duì)重癥及免疫力低下的患者發(fā)生感染。

Gu等[17]也曾從1株CR-HMKP菌株中同時(shí)發(fā)現(xiàn)了毒力質(zhì)粒和耐藥質(zhì)粒共存狀態(tài)，提示耐藥質(zhì)粒進(jìn)入HMKP菌株中或?qū)⑹荂R-HMKP形成的主要原因，提示攜帶KPC-2型碳青霉烯酶的質(zhì)粒傳遞是造成本地區(qū)CR-HMKP形成的主要原因。本組資料顯示，未見(jiàn)部分菌株的KPC質(zhì)粒發(fā)生接合試驗(yàn)傳遞；與此同時(shí)發(fā)現(xiàn)在發(fā)生轉(zhuǎn)移接合的菌株中，未檢測(cè)到毒力基因的轉(zhuǎn)移；推測(cè)KPC質(zhì)粒在進(jìn)入HMKP菌株中的難度或高于cKP菌株，而HMKP菌株中的毒力基因也不易轉(zhuǎn)移到敏感菌株中。這也直接反映在臨床CR-cKP菌株的流行程度明顯高于CR-HMKP菌株。

綜上所述，本研究闡述了CR-HMKP菌株在本地區(qū)的流行情況及碳青霉烯類耐藥產(chǎn)生的可能原因。有效的監(jiān)測(cè)和嚴(yán)格的感染控制策略或?qū)⒂兄柚笴R-HMKP菌株的感染擴(kuò)散，尤其是在ICU等重點(diǎn)科室的暴發(fā)流行。

[1] 魏丹丹，劉洋，萬(wàn)臘根，等. 高毒力肺炎克雷伯菌新型變種感染病例分析及耐藥機(jī)制研究[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2015，38（6）：392-396.

[2] 沈定霞，李東冬，郭玲，等. 高黏液表型肺炎克雷伯菌的莢膜分型與毒力基因的檢測(cè)[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014，37（5）：374-386.

[3] 王蓮慧，魏丹丹，萬(wàn)臘根，等. 高毒力莢膜血清型肺炎克雷伯菌克隆株毒力和耐藥性的研究[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2016，39（4）：286-290.

[4] YAO B， XIAO X， WANG F， et al. Clinical and molecular characteristics of multi-clone carbapenem-resistant hypervirulent（hypermucoviscous）Klebsiella pneumoniaeisolates in a tertiary hospital in Beijing， China[J]. Int J Infect Dis， 2015， 37 ： 107-112.

[5] WEI DD， WAN LG， DENG Q， et al. Emergence of KPC-producingKlebsiella pneumoniaehypervirulent clone of capsular serotype K1 that belongs to sequence type 11 in Mainland China[J]. Diagn Microbiol Infect Dis， 2016， 85（2）：192-194.

[6] ZHAN L， WANG S， GUO Y， et al. Outbreak by HypermucoviscousKlebsiella pneumoniaeST11 isolates with carbapenem resistance in a Tertiary Hospital in China[J]. Front Cell Infect Microbiol， 2017， 7 ：182.

[7] CLSI. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[S]. 27th informational supplement （M100-S27）， 2017.

[8] TURTON JF， PERRY C， ELGOHARI S， et al. PCR characterization and typing ofKlebsiella pneumoniaeusing capsular type-specific， variable number tandem repeat and virulence gene targets[J]. J Med Microbiol， 2010， 59（Pt 5）：541-547.

[9] CANDAN ED， AKS?Z N.Klebsiella pneumoniae：characteristics of carbapenem resistance and virulence factors[J].Acta Biochim Pol， 2015， 62（4）：867-874.

[10] BRISSE S， PASSET V， HAUGAARD AB， et al.wziGene sequencing， a rapid method for determination of capsular type forKlebsiellastrains[J]. J Clin Microbiol， 2013， 51（12）：4073-4078.

[11] DIANCOURT L， PASSET V， VERHOEF J， et al. Multilocus sequence typing ofKlebsiella pneumoniaenosocomial isolates[J].J Clin Microbiol， 2005， 43（8）： 4178-4182.

[12] BIALEK-DAVENET S， CRISCUOLO A， AILLOUD F， et al. Genomic definition of hypervirulent and multidrug-resistantKlebsiella pneumoniaeclonal groups[J]. Emerg Infect Dis，2014， 20（11）： 1812-1820.

[13] 張嶸，王選，呂建新，等. 碳青霉烯類抗生素耐藥K1型肺炎克雷伯菌一株的分離及耐藥機(jī)制分析[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志，2014，94（46）：3666-3670.

[14] ZHANG Y， ZHAO C， WANG Q， et al. High prevalence of hypervirulentKlebsiella pneumoniaeinfection in China：geographic distribution， clinical characteristics and antimicrobial resistance[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2016， 60（10）：6115-6120.

[15] ZHANG R， LIN D， CHAN EW， et al. Emergence of Carbapenem-resistant serotype K1 hypervirulentKlebsiella pneumoniaestrains in China[J]. Antimicrob Agents Chemother，2015， 60（1）：709-711.

[16] 李瑩瑩，明亮，劉紅春，等. 2型糖尿病并發(fā)頜面部感染來(lái)源的肺炎克雷伯菌的分子分型、耐藥性及毒力研究[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014，37（2）：136-139.

[17] GU D， DONG N， ZHENG Z， et al. A fatal outbreak of ST11 carbapenem-resistant hypervirulentKlebsiella pneumoniaein a Chinese hospital： a molecular epidemiological study[J]. Lancet Infect Dis， 2018，18（1）：37-46.