趙羅樂， 黃文祥， 李佳俊， 秦圓圓， 徐雅姝

萬古霉素一直作為治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的首選藥物，但近年來有報道萬古霉素對金黃色葡萄球菌的MIC值逐年上升，異質(zhì)性萬古霉素中介金黃色葡萄球菌（hVISA）的存在可能是其原因之一[1-2]。1997年，日本發(fā)現(xiàn)了第1株hVISA[3]。雖然萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌（VRSA）仍鮮見報道[4-5]，但萬古霉素中介金黃色葡萄球菌（VISA）和hVISA卻越來越常見，給糖肽類藥物的臨床應(yīng)用帶來了巨大挑戰(zhàn)。如今大量對于hVISA的研究都認(rèn)為hVISA引起的菌血癥持續(xù)時間長于普通MRSA感染，且更容易發(fā)生心內(nèi)膜炎和骨髓炎，從而致患者住院時間延長、萬古霉素治療失敗等問題[6-7]。但是否hVISA感染會使病死率增加還存在異議。本研究目的在于了解重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院hVISA流行狀況，并分析其流行與臨床特征之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 本研究105株金黃色葡萄球菌均來自我院2012－2015年臨床標(biāo)本，按照保存菌種順序編號。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 29213由本實驗室保存，hVISA標(biāo)準(zhǔn)菌株Mu3和VISA標(biāo)準(zhǔn)菌株Mu50由王輝教授饋贈。

1.1.2 主要試劑和儀器 腦心浸液肉湯（BHI）和腦心浸液瓊脂粉（BHIA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）購于青島日水生物技術(shù)有限公司。鹽酸萬古霉素購于美侖生物技術(shù)有限公司，均于有效期內(nèi)使用。儀器為法國生物梅里埃公司生產(chǎn)的螺旋涂布儀。

1.2 方法

采用回顧性分析研究方法，收集105例確認(rèn)為金黃色葡萄球菌感染患者的臨床資料，對其臨床特征進(jìn)行調(diào)查分析。

1.2.1 菌株鑒定 所有實驗菌株觸酶（+），血漿凝固酶（+），并采用VITEK 2-Compact全自動細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行生化鑒定并保存。根據(jù)美國臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）2016年版采用瓊脂稀釋法將對青霉素及頭孢西丁耐藥的金黃色葡萄球菌定義為MRSA。

1.2.2 VISA及hVISA初篩 采用瓊脂稀釋法對金黃色葡萄球菌進(jìn)行初篩，以CLSI 2016年版規(guī)定判讀：金黃色葡萄球菌對萬古霉素MIC≤2 mg/L為敏感（VSSA），≥16 mg/L為耐藥（VRSA），4～8 mg/L為中介（VISA）。

1.2.3 hVISA確認(rèn)試驗 采用目前國際上公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)菌群曲線下面積（PAP-AUC）法對所有菌株進(jìn)行篩檢，將濃度為0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木哼B續(xù)稀釋為10-3和10-6濃度，并用螺旋涂布儀將3種濃度的菌液均接種于含不同濃度萬古霉素（0.5、1、2、2.5、4和8 mg/L）的腦心浸液瓊脂平皿上，在35 ℃孵箱中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)。用Graphpad Prism軟件繪制菌落log對數(shù)值對萬古霉素濃度曲線并計算曲線下面積（AUC）。將同一批次中待測菌株AUC與陽性標(biāo)準(zhǔn)株Mu3的AUC進(jìn)行比較，AUC待測菌株/AUCMu3＜0.9判讀為VSSA，0.9≤AUC待測菌株/AUCMu3＜1.3則判讀為 hVISA，AUC待測菌株/AUCMu3≥1.3 判讀為 VISA[8]。

1.2.4 統(tǒng)計方法 年齡、住院時間等非正態(tài)分布資料采用秩和檢驗；臨床轉(zhuǎn)歸、流行病學(xué)等計數(shù)資料采用卡方檢驗，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 篩檢結(jié)果

2.1.1 瓊脂稀釋法檢測結(jié)果 在所有實驗菌株中，MRSA61株（占58.1%）。萬古霉素對61株MRSA MIC值分布統(tǒng)計情況見圖1。

2.1.2 hVISA篩檢結(jié)果 PAP-AUC法從105株金黃色葡萄球菌中總共篩檢出hVISA19株，占18.1%，其MIC值均在敏感范圍（MIC≤2 mg/L，其中12株為1 mg/L，7株為2 mg/L）；61株MRSA中hVISA的檢出率為18.0%。PAP-AUC法從105株菌株中共檢出VISA10株，檢出率為9.5%。

圖1 萬古霉素對61株MRSA MIC值分布圖Figure 1 Distribution of vancomycin MIC values against 61 MRSA strains

2.2 臨床特點

2.2.1 hVISA的臨床特征 19例hVISA感染的患者中位年齡為61歲，其中13例（68.4%）為男性；9例（47.4%）有基礎(chǔ)疾?。?1例（57.9%）有合并癥。菌株大多來自血培養(yǎng)（6株31.6%）和傷口分泌物（6株31.6%）；19株hVISA中MRSA 11株（57.9%）；19例hVISA感染的患者中來自社區(qū)感染的有11例（57.9%），來自醫(yī)院感染的8例（42.1%）。19株hVISA菌株對應(yīng)的患者臨床特征見表1。

2.2.2 VISA的臨床特征 10例VISA感染的患者中位年齡為62歲，其中7例（70.0%）為男性；5例（50.0%）有基礎(chǔ)疾病；8例（80.0%）有合并癥；1例死亡。標(biāo)本來自血培養(yǎng)3份（30.0%）和痰液4份（40.0%）；10株VISA中MRSA 8株（80.0%）。10例VISA感染患者中來自社區(qū)感染4例（40.0%），來自醫(yī)院感染6例（60.0%）。10株VISA對應(yīng)的患者臨床特征見表1。

表1 105例金黃色葡萄球菌感染患者的臨床資料Table 1 Clinical characteristics of 105 cases of Staphylococcus aureus infection

表1（續(xù)）Table 1（continued）

2.2.3 菌株流行特征 105例金黃色葡萄球菌感染患者中46例來自于重慶主城區(qū)，59例來自于周邊區(qū)縣。105例中醫(yī)院感染52例，其中MRSA感染36例，醫(yī)院感染中MRSA檢出率為69.2%；社區(qū)感染53例，其中MRSA感染25例，社區(qū)感染中MRSA檢出率為47.2%；醫(yī)院感染中MRSA檢出率大于社區(qū)感染中MRSA的檢出率，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。社區(qū)感染中hVISA 11株，檢出率為20.8%，醫(yī)院感染中hVISA 8株，檢出率為15.4%，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。61株MRSA中hVISA 11株，檢出率為18.0%，44株MSSA中hVISA 8株，檢出率為18.2%，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2.4 臨床轉(zhuǎn)歸及住院時間 采用卡方檢驗分析發(fā)現(xiàn)hVISA與非hVISA感染患者臨床轉(zhuǎn)歸差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；VISA與非VISA感染患者臨床轉(zhuǎn)歸差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。采用秩和檢驗分析發(fā)現(xiàn)hVISA與非hVISA感染患者住院時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；VISA與非VISA感染患者住院時間差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

近年來，由于萬古霉素的大量使用致金黃色葡萄球菌對萬古霉素的敏感率逐漸下降，hVISA的檢出率逐年增多。hVISA和VISA已在多個國家廣泛流行，但各個國家各種標(biāo)本的檢出率不盡相同。美國hVISA檢出率0.3%～15.0%[9-10]，日本一項報告表明MRSA中hVISA的檢出率為16.5%[11]。中國局部地區(qū)也有過相關(guān)報道，但各個地區(qū)報道差異也較大。2004年一項報告中國某地hVISA檢出率為14.3%[12]，我國臺灣研究顯示在MRSA中hVISA的檢出率為10.0%，VISA的檢出率為2.7%[13]。本研究共納入105株菌株，通過PAP-AUC法檢出hVISA19株，陽性率為18.1%；檢出VISA10株，檢出率為9.5%。另外，標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂稀釋法檢出MRSA 61株，檢出率58.1%；MRSA中hVISA的檢出率為18.0%，VISA的檢出率為13.1%，均略高于中國其他地區(qū)檢出水平。且以往報道的hVISA多來自于醫(yī)院感染中的MRSA，而本次研究發(fā)現(xiàn)我院社區(qū)感染中hVISA的檢出率以及MSSA中的檢出率也同樣較高，這使得本院萬古霉素的臨床應(yīng)用面臨更大的挑戰(zhàn)。

本次研究發(fā)現(xiàn)萬古霉素對MRSA的MIC值大多仍處于敏感范圍。雖然近年并沒有進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)萬古霉素MIC值漂移的報道，但萬古霉素MIC值與VISA和hVISA流行情況的關(guān)系還沒有完全闡明。一項研究發(fā)現(xiàn)在51歲以上年齡組中hVISA檢出率逐年下降，而該組萬古霉素血藥峰谷水平較hVISA高檢出率組均有上升，這表明菌株暴露在低水平的萬古霉素濃度下會產(chǎn)生耐藥亞群[14]。老年患者更容易產(chǎn)生hVISA感染和萬古霉素MIC值≥2 mg/L，可能是因為老年患者存在更多暴露于醫(yī)療機(jī)構(gòu)的次數(shù)，以及先前的萬古霉素治療使得暴露于低水平的萬古霉素的機(jī)會較多。在一項體外模型中也發(fā)現(xiàn)給予MRSA菌株的MIC值同等濃度的萬古霉素和略高濃度的萬古霉素時會誘導(dǎo)hVISA和VISA的產(chǎn)生，并導(dǎo)致萬古霉素MIC值增高[15]。因此，如果在治療時加大萬古霉素劑量，使得萬古霉素血藥濃度升高，可能會減少萬古霉素治療失敗的可能性，也可能會進(jìn)一步減少hVISA的產(chǎn)生。但這還需更多相關(guān)研究加以說明。

Horne等[16]研究結(jié)果顯示hVISA組與MRSA組治愈率無統(tǒng)計學(xué)差異。我國臺灣一項研究通過比較MRSA中低萬古霉素MIC值的VSSA（＜1.5 mg/ L）、高萬古霉素MIC值的VSSA（＞1.5 mg/ L）和高萬古霉素MIC值的hVISA三組患者的臨床轉(zhuǎn)歸，發(fā)現(xiàn)在對萬古霉素敏感的患者中，萬古霉素MIC值較高的患者有更高的30 d病死率。因此，雖然hVISA可以引起菌血癥持續(xù)時間延長等，但并不能解釋高萬古霉素MIC值的患者擁有高死亡率的原因[17]。本研究通過對臨床資料分析發(fā)現(xiàn)hVISA和VISA組與普通陰性株組在住院時間和臨床轉(zhuǎn)歸上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。一些研究表明金黃色葡萄球菌在獲得萬古霉素耐藥的同時會伴隨其適應(yīng)性、傳染性及毒力的下降，這或許可以解釋hVISA感染并未引起患者病死率增加的原因[18]。但這個結(jié)果僅用于解釋本研究，這可能是由于研究規(guī)模較小，標(biāo)本來源于血流感染的例數(shù)較少，且患者感染情況大多較輕，如果加大樣本量不排除可能發(fā)現(xiàn)病死率增加等問題。因此，將來的研究需要考慮大量的PAP-AUC分析來說明。

現(xiàn)已有專家開始探索用于治療這類萬古霉素敏感性下降的金黃色葡萄球菌感染，如利奈唑胺、達(dá)托霉素、特地唑胺、特拉萬星等[19-20]，但臨床療效證據(jù)的不足、安全性的風(fēng)險、價格昂貴、國內(nèi)無藥等問題還有待解決，萬古霉素仍然是治療MRSA感染的“最終選擇”。采用適當(dāng)劑量萬古霉素聯(lián)合其他藥物治療仍然是相對經(jīng)濟(jì)、安全的選擇。而對萬古霉素敏感性下降的金黃色葡萄球菌尤其是hVISA的不斷出現(xiàn)將為臨床治療金黃色葡萄球菌感染帶來極大困擾。本地區(qū)hVISA和VISA檢出率均較高，更應(yīng)該加強(qiáng)臨床萬古霉素使用的管理，做好萬古霉素治療感染時血藥濃度監(jiān)測。

本研究仍存在一些不足，首先，本研究僅納入本院105株菌株，標(biāo)本量不夠大可能會影響結(jié)果。之后可以進(jìn)一步收集重慶各個地區(qū)三甲及基層醫(yī)院的各種標(biāo)本，擴(kuò)大標(biāo)本量和地區(qū)范圍。因PAPAUC法作為現(xiàn)在hVISA篩檢的“金標(biāo)準(zhǔn)”操作起來比較費時費力，很難在醫(yī)院常規(guī)實驗室展開，也急需找到一種能快速有效檢測hVISA和VISA的新方法。近期研究表明通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜的方法可以成功檢測hVISA和VISA，且準(zhǔn)確性相對較高[21]。但其特異度、靈敏度及是否能夠真正應(yīng)用于臨床還需大量數(shù)據(jù)和進(jìn)一步研究來說明。其次，本次收集的臨床資料中不包括對萬古霉素的血藥濃度監(jiān)測，因為臨床上并非每個應(yīng)用了萬古霉素的患者均進(jìn)行了該項監(jiān)測，但研究表明細(xì)菌撲滅的決定因素之一是萬古霉素的峰谷水平而并非MIC值[22]。所以監(jiān)測萬古霉素濃度對MRSA及hVISA臨床療效的研究有重大意義。

[1] KLEVENS RM， MORRISON MA， NADLE J， et al. Invasive methicillin resistantStaphylococcus aureusinfections in the United States[J]. JAMA， 2007， 298（15）：1763-1771.

[2] SAKOULAS G，MOELLERING RC JR. Incrasing antibiotic resistance among methicillin-resistantStaphylococcus aureusstrains[J]. Clin infect Dis， 2008， 46（Suppl 5）： s360-s367.

[3] HIRAMATSU K， ARITAKA N， HANAKI H， et al.Dissemination in Japanese hospitals of strains ofStaphylococcus aureusheterogeneously resistant to vancomycin[J]. Lancet，1997，350（9092）：1670-1673.

[4] LIMBAGO BM， KALLEN AJ， ZHU W，et al. Report of the 13th vancomycin-resistantStaphylococcus aureusisolate from the United States[J]. Clin Microbiol， 2014， 52（3）：998-1002.

[5] FRIAES A， RESINA C， MANUEL V， et al. Epidemiological survey of the first case of vancomycin-resistantStaphylococcus aureusinfection in Europe[J]. Epidemiol Infect， 2015， 143（4）：745-748.

[6] MAOR Y， HAGIN M， BELAUSOV N， et al. Clinical features of heteroresistant vancomycin-intermediateStaphylococcus aureusbacteremia versus those of methicillin-resistantS. aureusbacteremia[J]. J Infect Dis，2009，199（5）：619-624.

[7] HOWDEN BP， WARD PB， CHARLES PG， et al. Treatment outcomes for serious infections caused by methicillinresistantStaphylococcus aureuswith reduced vancomycin susceptibility[J]. Clin Infect Dis，2004，38（4）：521-528.

[8] WOOTTON M， HOWE RA， HILLMAN R， et al. Amodified population analysis profile （PAP） method to detect heteroresistance to vancomycin inStaphylococcus aureusin a UK hospital[J]. J Antimicrob Chemother，2001，47（4）：399-403.

[9] SATOLA SW，F(xiàn)ARLEY MM，ANDERSON KF，et al. Comparison of detection methods for heteroresistant vancomycin-intermediateStaphylococcus aureus， with the population analysis profile method as the reference method[J]. J Clin Microbiol，2011，49（1）：177-183.

[10] RICHTER SS，SATOLA SW，CRISPELL EK，et al.Detection ofStaphylococcus aureusisolates with heterogeneous intermediate-level resistance to vancomycin in the United States[J]. J Clin Microbiol，2011， 49（12）：4203-4207.

[11] HANAKI H， CUI L， IKEDA-DANTSUJI Y， et al. Antibiotic susceptibility survey of blood-borne MRSA isolates in Japan from 2008 through 2011[J]. J Infect Chemother， 2014， 20（9）：527-534.

[12] 馬筱玲，王敬華，李華，等. 異質(zhì)性萬古霉素耐藥葡萄球菌分離及生物學(xué)特征性觀察[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2004，24（7）：583-586

[13] HUANG SH， CHEN YC， CHUANG YC，et al. Prevalence of vancomycin-intermediateStaphylococcus aureus（VISA） and heterogenous VISA among methicillin-resistantS. aureuswith high vancomycin minimal inhibitory concentrations in Taiwan：A multicenter surveillance study，2012-2013[J]. J Microbiol Immunol Infect，2016，49（5）：701-707.

[14] KHATIB R，SHARMA M， JOHNSON LB， et al. Decreasing prevalence of isolates with vancomycin heteroresistance and vancomycin minimum inhibitory concentrations≥2mg/L in methicillin-resistantStaphylococcus aureusover 11 years：potential impact of vancomycin treatment guidelins[J]. Diagn Microbiol Infect Dis， 2015，82（3）：245-248

[15] KHATIB R， JOSE J， JOHNSON LB， et al. An optimal method for generating stable vancomycin heteroresistance and intermediate susceptibility in methicillin resistantStaphylococcus aureusblood isolates under in-vitro vancomycin pressure[J]. J Microbiol Infect Dis， 2015， 2（4）：129-134.

[16] HORNE KC， HOWDEN BP， GRABSCH EA， et al.Prospective comparison of the clinical impacts of heterogeneous vancomycin-intermediate methicillin-resistantStaphylococcus aureus（MRSA） and vancomycin-susceptible MRSA[J].Antimicrob Agents Chemother， 2009，53（8）：3447-3452.

[17] WANG JL，LAI CH，LIN HH， et al. High vancomycin minimum inhibitory concentrations with heteroresistant ancomycin-intermediateStaphylococcus aureusin meticillinresistantS. aureusbacteraemia patients[J]. Int J Antimicrob Agents， 2013， 42（5）：390-394.

[18] GAO W， CAMERON DR， DAVIES JK， et al. The RpoB H481Y rifampicin resistance mutation and an active stringent response reduce virulence and increase resistance to innate immune responses inStaphylococcus aureus[J]. J Infect Dis，2012， 207（6）：929-939.

[19] SZABó J. hVISA/VISA ： diagnostic and therapeutic problems[J]. Expert Rev Anti Infect Ther， 2009，7（1）：1-3.

[20] RODVOLD KA， MCCONEGHY KW. Methicillin-resistantStaphylococcus aureustherapy ： past， present， and future[J].Clin infec Dis，2014，58（Suppl 1）：s20-s27.

[21] MATHER CA， WERTH BJ， SIVAGNANAM S，et al. Rapid Detection of vancomycin-intermediateStaphylococcus aureusby matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry[J]. J Clin Microbiol，2016，54（4）：883-890.

[22] FORSTNER C， DUNGL C， TOBUDIC S， et al. Predictors of clinical and microbiological treatment failure in patients with methicillin-resistantStaphylococcus aureus（MRSA）bacteraemia： a retrospective cohort study in a region with low MRSA prevalence[J]. Clin Microbiol Infect， 2013， 19（7）：E291-E297.