王 芳，廖勤儉，安明哲，練順才，李楊華，郭 艷

(宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓644007)

乳酸、乙酸、丁酸、己酸是濃香型白酒中四大主體酸酯，即乳酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯的前體物質(zhì)，也是白酒香味成分。因乳酸為高沸點不揮發(fā)性酸，長期以來，此四大酸均參考國標(biāo)芐基溴酯化氣相色譜檢測方法[1]，此方法前處理時間長，影響檢測效率。另有離子色譜法測此4種酸[2]，該方法的應(yīng)用常出現(xiàn)乳酸和乙酸難以分離的問題，所以，針對白酒樣品，常常會進(jìn)行上百倍的稀釋，從而加大了檢測誤差，出現(xiàn)樣品檢測結(jié)果不穩(wěn)定的情況;也有以硫酸銅水溶液作為水相流動相，利用高效液相色譜法測定白酒中乳酸和乙酸的方法[3]。白酒企業(yè)中，常規(guī)的酸酯醇檢測大多采用氣相色譜法，因此，為緩解氣相色譜的檢測壓力，以及離子色譜針對高酸濃度樣品的檢測不穩(wěn)定性，筆者利用高效液相色譜進(jìn)行了乳酸、乙酸、丁酸、己酸的檢測方法研究，并驗證了方法在白酒酒尾樣品、己酸發(fā)酵液樣品檢測中的準(zhǔn)確性，特別是己酸發(fā)酵液中4種酸的檢測，可以監(jiān)控發(fā)酵的穩(wěn)定性及發(fā)酵過程的原料轉(zhuǎn)化率及己酸產(chǎn)率。研究結(jié)果表明，該方法簡便適用，精確度高，重復(fù)性好。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：白酒酒尾及己酸發(fā)酵液由本實驗室自備。

乳酸、乙酸、丁酸、己酸標(biāo)準(zhǔn)品的配制：準(zhǔn)確稱取色譜級乳酸、乙酸、丁酸、己酸，以70%的甲醇水溶液分別配制成50 mL濃度為10 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液放置于4℃中冷藏。

試劑：優(yōu)級純磷酸、超純水、HPLC級甲醇。

儀器設(shè)備：美國Agilent公司1100高效液相色譜儀，DAD檢測器。

1.2 實驗方法

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱：Agela公司VenusilASB C184.6×250 mm，5 μm。

柱溫：30℃。

紫外線檢測波長：214 nm。

流動相：A：甲醇；B：0.1%的磷酸水溶液。

梯度洗脫：0 min：100 B；8 min：100 B；25 min：10 B；28.5 min：10 B；29 min：100 B；35 min：100 B；停止：35 min；流速：1.0 mL/min。

1.2.2 樣品前處理

白酒酒尾樣品：取0.5 mL白酒樣品以0.1%的磷酸水溶液稀釋至1 mL，于2 mL離心管中，振蕩均勻，0.2 μm的膜過濾后作為待測樣品。

己酸發(fā)酵液：取0.1 mL己酸發(fā)酵液，以0.1%的磷酸水溶液稀釋至1 mL，于2 mL離心管中，振蕩均勻，0.2 μm的膜過濾后作為待測樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)樣的檢測

分別取10 g/L的4種酸單標(biāo)準(zhǔn)溶液，以0.1%的磷酸水溶液稀釋至1000 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行定性檢測。標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖見圖1，4種酸的出峰時間見表1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖

表1 4種酸的出峰時間

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

分別取10 mg/L的4種酸單標(biāo)準(zhǔn)溶液，以0.1%的磷酸水溶液稀釋至100 mg/L、500 mg/L、1000 mg/L、1500 mg/L、2000 mg/L，5個濃度梯度，作為定量分析校正。以峰面積Y為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度（mg/L）為X橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，檢測結(jié)果見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

2.3 白酒酒尾樣品中4種酸的精密度、回收率

取白酒酒尾樣品，其中一份經(jīng)1.2.2中方法處理后，作為空白樣品；另兩份分別加入已知量的4種酸單標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)1.2.2中方法處理后，進(jìn)行回收率測定；同時對空白樣品進(jìn)行精密度測定，檢測結(jié)果見表3。白酒酒尾空白樣品色譜圖見圖2。

圖2 白酒酒尾空白樣品色譜圖

2.4 己酸發(fā)酵液樣品中4種酸的精密度、回收率

取己酸發(fā)酵液樣品，其中一份經(jīng)1.2.2中方法處理后，作為空白樣品；另兩份分別加入已知量的4種酸單標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)1.2.2中方法處理后，進(jìn)行回收率測定；同時對一加標(biāo)樣品進(jìn)行精密度測定，檢測結(jié)果見表4。

表3 白酒酒尾樣品中4種酸檢測結(jié)果

表4 己酸發(fā)酵液樣品中4種酸檢測結(jié)果

3 結(jié)果與討論

該方法中水相流動相中加入適量的磷酸有助于乳酸和乙酸的分離和保證樣品檢測的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性。方法中白酒酒尾樣品，酒精度在15%vol左右，樣品中乙醇的濃度對乙酸和乳酸的分離有影響，經(jīng)磷酸水溶液稀釋后，能保證樣品中乳酸峰和乙酸峰的有效分離。己酸發(fā)酵液樣品中乙酸、丁酸、己酸濃度相對較高，且含有一定的鈣鹽、鈉鹽，經(jīng)磷酸水溶液進(jìn)行十分之一的稀釋，可以將溶液中的有機(jī)酸鹽轉(zhuǎn)化成酸，保證樣品檢測的準(zhǔn)確性。

方法采用214 nm的DAD檢測波長，梯度洗脫的方式,隨著流動相中有機(jī)相濃度的增高，基線有一定的向上漂移，但對樣品中4種酸的定性定量檢測沒有影響。

方法中，4種酸的定量檢測限均為10 mg/L，線性相關(guān)系數(shù)R2值為0.9996～0.9999，白酒酒尾樣品中的回收率為94.3%～100.5%，檢測結(jié)果的RSD為1.29%～3.67%。己酸發(fā)酵液樣品中的回收率為96.6%～101.9%，檢測結(jié)果的RSD為1.28%～3.02%，滿足分析要求。

該方法簡單、適用，可以緩解白酒企業(yè)氣相色譜和離子色譜的檢測壓力。

[1]中國輕工業(yè)聯(lián)合會.食品添加劑乳酸：GB 2023—2003[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2003.

[2]郭逸臻,石敏.離子色譜法測定白酒中乳酸含量的方法研究[J].釀酒科技,2008(9)：108-110.

[3]馮向東.高效液相色譜法測定白酒中乳酸和乙酸含量[J].釀酒科技,2009(5)：115-116.