高丹丹 曹軍 徐遠(yuǎn)志 馮盡意 徐繼 周莉 劉定勝 樓美清 畢云科*

(1上海市浦東新區(qū)周浦醫(yī)院腫瘤血液科，上海 201318; 2日照市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，山東 日照 276826; 3上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科，上海 200080)

膠質(zhì)瘤是成人中最常見、惡性程度最高的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤[1]，多年來一直是廣大神經(jīng)外科醫(yī)師的研究熱點(diǎn)。雖然采取了包括手術(shù)、放化療在內(nèi)的綜合治療，但患者預(yù)后仍然不容樂觀[2]。榭皮素(quercetin, Quer)是一種存在于很多中藥中的黃酮類化合物[3]，對(duì)很多腫瘤包括膠質(zhì)瘤具有殺傷作用。Quer及其代謝物能夠透過血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，這是膠質(zhì)瘤化療的必要條件[4]。

自噬是依賴于溶酶體的一種代謝過程，與細(xì)胞的生存、死亡有很大關(guān)系[5-6]。在很多腫瘤中都有自噬的發(fā)生，包括膠質(zhì)瘤，但自噬對(duì)腫瘤生存或死亡的影響并不清楚。研究表明，自噬在腫瘤的起始階段起抑制作用，在腫瘤的發(fā)展階段起促進(jìn)作用[7]。報(bào)道顯示榭皮素能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬的發(fā)生，但在膠質(zhì)瘤方面的研究很少。由于自噬是一多步代謝過程，我們猜測(cè)干擾自噬不同階段會(huì)對(duì)榭皮素的毒性有不同影響。本研究采用藥物及基因敲除的方法分別抑制了自噬的不同階段，檢測(cè)了榭皮素作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的毒性，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

材料與方法

一、材料

人源膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251，鼠源膠質(zhì)瘤細(xì)胞系C6均來源于日本理化學(xué)研究所(Rikagaku Kenkyusho, RIKEN)細(xì)胞庫。

二、主要試劑與藥品

細(xì)胞培養(yǎng)試劑購自美國Gibco公司，轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；Western Blot試劑購自中國碧云天公司；(short hairpin RNA, shRNA)質(zhì)粒和陰性亂序?qū)φ召|(zhì)粒均購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。兔源微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated proteins light chain 3, LC3)抗體，兔源Beclin 1抗體和鼠源β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司，兔源capase-3抗體購于美國美國Cell Signaling Technology公司，二抗購于美國Bioworld公司。榭皮素、氯喹和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)購自美國Sigma公司。

三、主要實(shí)驗(yàn)方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：所有細(xì)胞均使用改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified essential medium, DMEM)高糖培養(yǎng)基、10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗在37 ℃的5% CO2細(xì)胞孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞長滿瓶底80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

2.噻唑藍(lán)比色法(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide assay, MTT)：選取對(duì)數(shù)期生長的U87和U251細(xì)胞，以5 000個(gè)/孔種植于96孔板，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)70%時(shí)給予相應(yīng)處置。之后每孔加入10 μL MTT，在37 ℃ 孵育4 h，終止培養(yǎng)。棄掉孔內(nèi)液體，避光條件下加入200 μL二甲基亞砜，放置搖床晃動(dòng)10 min使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測(cè)定各孔的吸光度，并記錄結(jié)果。

3.流式細(xì)胞技術(shù)：細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染和藥物處理后，用胰酶常規(guī)消化，計(jì)數(shù)后取1×106/mL個(gè)細(xì)胞，2 000 r/min、4 ℃離心5 min，棄上清。加入1 mL預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液 (phosphate buffer solution, PBS)，輕輕吹打細(xì)胞使之懸浮。再次2 000 r/min、4 ℃離心5 min，棄上清。將細(xì)胞重懸于190 μL磷脂結(jié)合蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶 (annexin V-fluorescein isothiocyanate/popidium iodide, Annexin V-FITC/PI)結(jié)合液，加入10 μL Annexin V-FITC輕輕混勻，避光4 ℃反應(yīng)10 min。2 000 r/min、4 ℃離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液，加入5 μL PI，300目濾網(wǎng)過濾，即刻流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

4.Western Blot：細(xì)胞經(jīng)藥物處理后加入蛋白裂解液(radio-immunoprecipitation assay, RIPA)。超聲細(xì)胞破碎儀處理并離心，收集所有細(xì)胞裂解物，通過蛋白定量分析評(píng)估蛋白濃度。通過10%～15% 的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS- PAGE)進(jìn)行分離，將分離的蛋白在恒壓120 V的情況下轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上。將PVDF膜浸在5% 的牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)中封閉過夜。接著將一抗結(jié)合PVDF膜于4 ℃孵育過夜，然后附著相應(yīng)的二抗室溫孵育1 h。按照說明，通過標(biāo)準(zhǔn)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)標(biāo)記信號(hào)。

5.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將細(xì)胞消化后接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到40%～70%時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染，每個(gè)轉(zhuǎn)染樣品制備DNA-Lipofectamine 2 000復(fù)合物。因質(zhì)粒中帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)熒光基團(tuán)，轉(zhuǎn)染成功后可在熒光顯微鏡下檢測(cè)到熒光。

結(jié) 果

一、Quer抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及自噬發(fā)生

分別用特定濃度的Quer處理U87及U251細(xì)胞系24 h、48 h，MTT檢測(cè)Quer的毒性。如圖1A所示，Quer可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，呈濃度依賴趨勢(shì)；且藥物處理48 h較24 h的毒性作用明顯。為了探討Quer誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡與凋亡的關(guān)系，通過Western Blot檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白cleaved Caspase-3的表達(dá)。如圖1B所示，隨著Quer濃度的增加，cleaved Caspase-3的表達(dá)也越高。

為了研究Quer能否誘導(dǎo)自噬發(fā)生，以及其誘導(dǎo)的凋亡是否與自噬有關(guān)，通過透射電鏡(transmission electron microscope, TEM)及Western Blot檢測(cè)細(xì)胞的自噬水平。如圖1C所示，Quer組的胞漿內(nèi)可見很多雙層膜結(jié)構(gòu)的存在，表明細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成，而對(duì)照組沒有類似發(fā)現(xiàn)。接下來，用不同濃度的Quer分別處理細(xì)胞系16 h，Western Blot檢測(cè)LC3-II的表達(dá)。如圖1D，隨著Quer濃度的增加，LC3-II表達(dá)逐漸增加。

二、3-MA降低Quer對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的毒性作用

3-MA可以通過抑制III型PI3K來抑制早期自噬。為了研究Quer誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡與自噬的關(guān)系，我們觀察聯(lián)合3-MA后Quer對(duì)細(xì)胞的毒性。首先，MTT檢測(cè)3-MA對(duì)細(xì)胞增殖的影響，如圖2A，3-MA單藥可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，且該抑制作用呈劑量依賴。隨后，我們聯(lián)用了有效濃度的3-MA(1 mM/L)及Quer(50 μM)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用比單藥Quer的毒性反而要小(圖2B)，即3-MA降低了Quer對(duì)細(xì)胞的毒性作用。

三、CQ通過阻斷晚期自噬增強(qiáng)Quer的毒性作用

為了進(jìn)一步驗(yàn)證自噬在Quer誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用，我們選用了自噬晚期抑制劑CQ。首先，經(jīng)MTT檢測(cè)CQ單藥及聯(lián)合Quer對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的毒性。圖3A顯示，CQ單藥對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)殺傷作用。5 μM/L為實(shí)驗(yàn)組中的最小濃度，對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞毒性作用較小。然而，當(dāng)與50 μM/L Quer聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，顯著增強(qiáng)了Quer對(duì)細(xì)胞的毒性作用(圖3B)。

接下來，通過Western Blot及流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，初步探討聯(lián)合用藥導(dǎo)致細(xì)胞死亡的機(jī)制。如前，Quer可以增強(qiáng)cleaved Caspase 3的表達(dá)，且呈劑量依賴性，表明Quer單藥可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Western Blot顯示，與單藥組相比，聯(lián)合組cleaved Caspase-3的表達(dá)明顯增多(圖3C)，即CQ聯(lián)合Quer誘導(dǎo)了更多的細(xì)胞凋亡。流式結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證CQ增強(qiáng)了Quer誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

TEM結(jié)果顯示，單獨(dú)應(yīng)用50 μM/L Quer或5 μM/L CQ處理細(xì)胞時(shí)，都能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量的自噬體，Quer與CQ聯(lián)合用藥則誘導(dǎo)了更多的自噬體累積(圖3E)。累積的自噬體大部分為單層膜結(jié)構(gòu)，這是晚期自噬體的特征。以上結(jié)果表明自噬體的大量累積可能是自噬降解過程被CQ阻斷所致，而自噬體的大量積累將誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

四、敲除Beclin 1基因?qū)uer細(xì)胞毒性的影響

1.敲除Beclin 1抑制Quer誘導(dǎo)的自噬：鑒于化學(xué)性自噬抑制劑的非特異性，我們利用Beclin 1 shRNA敲除了兩種細(xì)胞系中的自噬關(guān)鍵基因Beclin 1。隨后，50 μM/L Quer分別處理轉(zhuǎn)染了shBeclin 1質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞。結(jié)果顯示，與vector+Quer組相比，shBeclin 1+Quer組的LC3-II蛋白表達(dá)下降明顯(圖4B、C)。以上結(jié)果表明沉默Beclin 1能有效抑制Quer誘導(dǎo)的自噬。

2.敲除Beclin 1減弱Quer和CQ的協(xié)同殺傷作用：為了確定Quer和CQ的協(xié)同殺傷作用是否依賴于自噬，我們分單藥及聯(lián)合處理了轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒和shBeclin 1質(zhì)粒的細(xì)胞系。如圖4A所示，敲除Beclin 1組的膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)聯(lián)合處理后，細(xì)胞活性優(yōu)于轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒組，這表明Beclin 1聯(lián)合殺傷中起關(guān)鍵作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Beclin 1的關(guān)鍵地位，我們進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。如圖4C所示，相比于轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒組，敲除Beclin 1組的LC3-II蛋白及Caspase 3蛋白表達(dá)明顯降低，表明Beclin 1在聯(lián)合用藥中自噬及凋亡的發(fā)生至關(guān)重要。

圖1 Quer對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251的作用

Fig 1 Effect of Quer treatment on glioma cell lines

A: Cell viability was determined by MTT; B: Effect of Quer on caspase 3 protein level in U87 and U251 cells; C: TEM photomicrographs of U87 and U251 cells (Arrows indicated autophagic vacuoles); D: Total cell lysates were blotted with anti-LC3 antibodies.

aP<0.05,bP<0.01,cP<0.001, NS: not significant,vscontrol group. Scale bars=2 μm.

圖2 Quer聯(lián)合3-MA對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的作用

Fig 2 Effects of Quer and 3-MA on glioma cell lines

A: Cell viability incubated with different concentrations of 3-MA was measured by MTT; B: U87 and U251 cells were treated with Quer (50 μM), with or without 3-MA (1 mM) for 24 h.

aP<0.05,bP<0.01,cP<0.001, NS: not significant,vscontrol group.

圖3 CQ聯(lián)合Quer對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的作用

Fig 3 Effects of Quer and CQ on glioma cell lines

A: Cell viability was measured by MTT; B: Cells were treated with Quer (50 μM), with or without CQ (5 μM) for 24 h; C: Total cell lysates were blotted with anti-caspase 3 antibodies; D: Cell death was assessed by flow cytometry; E: TEM photomicrographs of U87 cells (Arrows indicated AVs).

aP<0.05,bP<0.01,cP<0.001, NS: not significant,vscontrol group. Scale bars=2 μm.

圖4 敲除Beclin 1對(duì)Quer聯(lián)合CQ效果的影響

Fig 4 Effect of Beclin 1 knockdown on combination treatment of Quer and CQ

A: Cell viability was evaluated by MTT; B: Effect of Beclin 1 knockdown on Beclin 1 and LC3 protein level expression. Cell lysates were blotted with anti-Beclin 1 and anti-LC3 antibodies; C: Cell lysates were blotted with anti-Beclin 1, anti-LC3, and anti-caspase 3 antibodies.

aP<0.05,bP<0.01,cP<0.001, NS: not significant,vscontrol group.

討 論

我們揭示了榭皮素能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的增殖并誘導(dǎo)凋亡，且促進(jìn)自噬的發(fā)生。凋亡和自噬有著密切的聯(lián)系：凋亡可以起始于自噬，自噬也通常能誘導(dǎo)凋亡。比如，自噬體的形成是激活凋亡相關(guān)蛋白Caspase 3的一個(gè)因素[8]。此外，自噬體的大量累積會(huì)產(chǎn)生毒性并且激活凋亡[9]。我們假設(shè)聯(lián)用自噬誘導(dǎo)劑與自噬抑制劑導(dǎo)致的凋亡很可能與自噬體的大量累積有關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)聯(lián)合3-MA及Quer時(shí)，Quer的毒性作用有所減弱，這可能與3-MA抑制了早期自噬，自嗜體不能形成及累積有關(guān)；當(dāng)聯(lián)合CQ與Quer時(shí)，Quer的毒性作用明顯增強(qiáng)，這可能與CQ阻斷了自嗜體與溶酶體結(jié)合，導(dǎo)致大量自嗜體積累有關(guān)。簡(jiǎn)單講，大量凋亡的發(fā)生往往伴隨著待降解自噬體的累積，這與我們的假設(shè)一致。

Beclin 1是一種自噬關(guān)鍵基因。為了進(jìn)一步探討Quer誘導(dǎo)的自噬與凋亡的關(guān)系，我們利用shBeclin 1敲除了膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中Beclin 1的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨(dú)應(yīng)用Quer或者聯(lián)合應(yīng)用CQ處理細(xì)胞后，凋亡明顯減少。這表明CQ以依賴Beclin 1的方式增強(qiáng)Quer對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的毒性作用。

總之，我們的研究表明，Quer能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡及自噬的發(fā)生。并且，抑制自噬的早期階段減弱了Quer的細(xì)胞毒性，而抑制自噬的晚期階段增強(qiáng)了Quer的細(xì)胞毒性。因此，聯(lián)合應(yīng)用Quer及自噬晚期抑制劑是膠質(zhì)瘤治療的一種新策略。

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