朱明明,何鴻舉,*,樊明濤,冉軍艦,馬漢軍

(1.河南科技學院食品學院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院,陜西楊凌 712100)

沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.)是屬薔薇目胡頹子科沙棘屬的落葉灌木,主要分布于中國西北部,尤其是青海省[1]。沙棘果是其成熟果實,也稱為醋柳棗和沙棗。近年來,由于沙棘果富含油脂、維生素C、蛋白質(zhì)(球蛋白和白蛋白)、類胡蘿卜素、飽和及不飽和脂肪酸、游離氨基酸、多酚和維生素E等[2-3]而受到廣泛關(guān)注。因而很多文獻報道了沙棘果的藥理學作用,包括抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗動脈粥樣硬化、抗應(yīng)力、護肝、防輻射和修復組織等[4-5]。但是,沙棘果儲存期很短,而且受到物理損傷或微生物污染而腐敗[6]。因此,研究沙棘果的采后加工具有重要的實際意義。

目前沙棘果的加工產(chǎn)品主要有沙棘果汁和沙棘果酒,其中沙棘果酒較沙棘果汁的加工而言,無需高溫處理,可保留大部分的香氣物質(zhì)而備受加工工廠的青睞[7-8]。沙棘果酒最大的問題是香味寡淡。類胡蘿卜素是一類重要的香味前體物質(zhì),可衍生成具有較低香氣閾值的香氣物質(zhì),是評價食品質(zhì)量的重要指標,尤其是降異戊二烯類物質(zhì),如β-紫羅蘭酮、β-大馬酮等,可有效改善沙棘果酒香味不足的問題[9]。沙棘果汁中類胡蘿卜素的含量可達4.075 mg/L[10-11],而沙棘果酒釀造過程中,由類胡蘿卜素自發(fā)降解產(chǎn)生的香氣物質(zhì)類型及含量都非常少。因此如何有效地利用其中的類胡蘿卜素降解產(chǎn)香,并達到改善沙棘果酒風味的目的是目前果酒釀造中的一項重要研究內(nèi)容。

課題組在前期實驗中,首次在沙棘酒前期發(fā)酵過程中分離得到一株可高效催化類胡蘿卜素降解的菌株TS-82,經(jīng)鑒定為巴氏葡萄球菌(GenBank Accession No. KP171185)[12],無致病性,結(jié)果表明其不具備致病性,可安全用于食品生產(chǎn)中[13-14],并優(yōu)化其培養(yǎng)條件[15-17],對其所產(chǎn)類胡蘿卜素降解酶進行分離純化及其酶學特性[13,18-20]和催化類胡蘿卜素降解的作用機理研究[21-23]。然而,還未見到巴氏葡萄球菌TS-82應(yīng)用于沙棘果酒釀造的相關(guān)報道。本實驗采用巴氏葡萄球菌TS-82和釀酒酵母聯(lián)合發(fā)酵沙棘果酒,利用巴氏葡萄球菌TS-82可產(chǎn)類胡蘿卜素降解酶的特性改善沙棘果酒風味,與傳統(tǒng)釀造的沙棘果酒比較香氣物質(zhì)種類和含量的變化,并研究了類胡蘿卜素和多酚類等營養(yǎng)物質(zhì)種類和含量的差異,以期改善傳統(tǒng)釀造工藝,研制出香醇可口、營養(yǎng)豐富、適于消費者飲用的新型沙棘果酒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巴氏葡萄球菌菌株TS-82 西北農(nóng)林科技大學食品發(fā)酵與生物技術(shù)實驗室分離保存;酵母菌種EXCE-SP 西北農(nóng)林科技大學食品發(fā)酵與生物技術(shù)實驗室保藏菌種;沙棘汁 采自青海的沙棘果(中國沙棘)新鮮壓榨而成;β-胡蘿卜素、、β-環(huán)檸檬醛、β-紫羅蘭酮、沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、蘆丁、金絲桃苷、鞣花酸和槲皮素標準品 購自Sigma-Aldrich;色譜級甲醇 購自美國Tedia;色譜級乙酸 購自天津科密歐;色譜級水 購自杭州娃哈哈;其他分析純試劑 均購自天津科密歐。

LC-20A型高效液相色譜儀 島津(日本)公司;UV-2000型紫外-可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;GC-MS Trace Dsq GC-MS-Finnigan(美國)公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、手動SPME進樣器 Supelco(美國)公司;DB-WAX彈性石英毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm) Agilent(美國)公司;cp2245型分析天平 Sartorius(德國)公司;HH恒溫水浴鍋 科偉永興(北京)儀器有限公司;恒溫振蕩培養(yǎng)箱 ?，?上海)實驗設(shè)備有限公司;立式壓力蒸汽滅菌鍋 博訊實業(yè)(上海)有限公司;R-120型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 BüCHI(瑞士)公司;低溫離心機 中科中佳(安徽)科學儀器有限公司;pH計 精密科學儀器(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 巴氏葡萄球菌TS-82培養(yǎng)液的制備 改良查氏液體培養(yǎng)基:K2HPO41 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,FeSO4·7H2O 0.01 g/L,KCl 0.5 g/L,NaNO33 g/L,蔗糖30 g/L,番茄汁20 g/L,酵母浸粉3 g/L。121 ℃下滅菌20 min后備用。將TS-82菌株接種于上述滅菌培養(yǎng)基中,在37 ℃、130 r/min條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長末期,于4 ℃冰箱待用。

1.2.2 釀酒酵母培養(yǎng)液的制備 YPD液體培養(yǎng)基:蛋白胨:20 g/L,酵母膏:10 g/L,葡萄糖:20 g/L。121 ℃下滅菌20 min后備用。將酵母菌菌落接種于YPD滅菌培養(yǎng)基中,在28 ℃條件下培養(yǎng)24 h,制備酵母培養(yǎng)液,于4 ℃冰箱待用。

1.2.3 沙棘果酒的釀造工藝 在實驗過程中釀造兩種不同類型的沙棘果酒:釀酒酵母發(fā)酵沙棘果酒,釀酒酵母和巴氏葡萄球菌聯(lián)合發(fā)酵沙棘果酒。

1.2.4 類胡蘿卜素含量的測定 采用皂化法[24]提取類胡蘿卜素。具體操作如下:取20 mL沙棘果汁或果酒,加入固體NaOH至溶液飽和,均勻攪拌,在90 ℃水浴鍋中恒溫皂化30 min后,取出迅速冷卻至室溫,將pH調(diào)至3.0,加入乙酸乙酯(20 mL/次)多次萃取,直至有機相無色,將所有有機相合并、濃縮得類胡蘿卜素提取液,利用無水硫酸鈉避光處理1 h,除去有機相中的水分,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后用丙酮定容至10 mL,在460 nm下測定其吸光度值,計算含量。

類胡蘿卜素標準曲線的繪制:以β-胡蘿卜素為標準品,用丙酮溶解,濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L。以丙酮作為空白,在460 nm下測定其吸光度值,用所得數(shù)據(jù)作圖可得到β-胡蘿卜素濃度與吸光度值的線性關(guān)系。β-胡蘿卜素濃度與吸光度值的線性關(guān)系式:y=0.0844x+0.0653(R2=0.991),其中x為β-胡蘿卜素濃度,y為460 nm下的吸光度值。

1.2.5 十種多酚含量的變化 取10 mL酒樣,用NaOH(1.0 mol/L)調(diào)節(jié)pH至7.0左右,加入乙酸乙酯(20 mL/次)萃取三次,混合上清,剩余溶液利用HCl調(diào)pH至2.0,加入乙酸乙酯(20 mL/次)萃取三次,混合上清,4 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),殘渣溶于10 mL甲醇中,4 ℃避光待用。采用高效液相色譜法[25]分析十種多酚含量的變化。色譜柱:C18反相柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,)。流動相A:1%乙酸水溶液,流動相B:甲醇,梯度洗脫,時間程序:0～10 min,5%～30% B;10～25 min,30%～50% B;25～35 min,50%～70% B;35～40 min,70%～5% B。柱溫30 ℃;流速1.0 mL/min;進樣量20 μL,二極管陣列檢測器檢測,檢測波長:280 nm。

標準溶液的制備和測定:分別精確稱取十種多酚標準品,溶于10 mL甲醇中作為標準品儲備液。將不同標準品分別稀釋不同濃度,采用上述HPLC方法測定各個多酚標準品的標準曲線?；鞓藙t是將所有標準品混合,使各標準品濃度均為1.0 mg/mL,采用上述條件測定混標曲線。

1.2.6 香氣物質(zhì)種類和含量的變化 參考Wang等[8]的頂空-固相微萃取方法(HS-SPME)萃取沙棘果酒中的揮發(fā)性成分。吸附完全后將萃取頭拔出并迅速插入氣相色譜儀進樣口中,250 ℃熱解析處理5 min。柱溫箱升溫程序如下:40 ℃,5 min;5 ℃/min升溫至200 ℃;10 ℃/min升溫至240 ℃;240 ℃,5 min。傳輸線230 ℃;離子源250 ℃;電離方式EI,離子能量70 eV;發(fā)射電流100 μA,檢測電壓1.4 kV;質(zhì)量掃描范圍:35～400 m/z。

香氣標準品的配制及測定:采用無水乙醇分別將3-辛醇內(nèi)標和β-環(huán)檸檬醛、β-紫羅蘭酮標準品稀釋至濃度為134、187、189 mg/L。隨后各取三種化合物4 μL混合均勻,溶解于10 mL的6%乙醇溶液中,HS-SPME法萃取揮發(fā)性物質(zhì)并利用GC-MS進行解析,從而計算得到標準化合物β-環(huán)檸檬醛和β-紫羅蘭酮與內(nèi)標間的響應(yīng)因子,其響應(yīng)因子為(標準品濃度/標準品峰面積)/(內(nèi)標濃度/內(nèi)標峰面積)[12]。

定性及定量分析:利用隨機Xcalibur工作站的標準譜庫自動檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù),并利用已有標準品的標準圖譜對機檢結(jié)果進行確認,最終確定香氣成分;根據(jù)所得響應(yīng)因子計算香氣化合物濃度,參考Hua等[26]的方法確立其計算公式為:香氣化合物濃度=(香氣物質(zhì)峰面積/內(nèi)標峰面積)×內(nèi)標濃度×響應(yīng)因子。而對于沒有對應(yīng)標準品的香氣物質(zhì)采用結(jié)構(gòu)相似的標準品進行計算[27]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

以上所有實驗均為三次平行,取平均值。使用DPS軟件(Version Rel.6.55,1997)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果與分析

沙棘果汁初始pH3.5,總糖為16%,滴定酸含量3.35 g/L;按照GB/T 4789.25-2003測定了金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌,無致病菌檢出;經(jīng)傳統(tǒng)釀造和巴氏葡萄球菌TS-82聯(lián)合酵母菌發(fā)酵后所得沙棘酒的pH在2.8～2.9范圍內(nèi),殘?zhí)橇慷荚?.5 g/L左右,酒精度也都達到6%vol,無致病菌,表明加入巴氏葡萄球菌TS-82可使沙棘果酒與傳統(tǒng)釀造的產(chǎn)品相一致,達到干酒的要求(殘?zhí)橇康陀? g/L)。

2.1 聯(lián)合發(fā)酵對釀造過程中類胡蘿卜素含量的影響

利用皂化法測定傳統(tǒng)釀造方法和巴氏葡萄球菌TS-82聯(lián)合酵母菌發(fā)酵對沙棘果酒釀造過程中類胡蘿卜素含量的影響,其變化結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,在沙棘果酒的主發(fā)酵過程中,類胡蘿卜素的含量都呈現(xiàn)出不同的下降趨勢,分析原因可能是類胡蘿卜素比較敏感,見光或遇熱都易降解。而在主發(fā)酵過程中添加巴氏葡萄球菌TS-82后,類胡蘿卜素含量與傳統(tǒng)方法相比有明顯的降低,主要是由于該菌可產(chǎn)生大量的胞外類胡蘿卜素降解酶,此酶比較適合酸性環(huán)境,耐酸性較好[18-19,21],在沙棘果酒的釀造過程中依然具有催化活性。在發(fā)酵后期,類胡蘿卜素含量變化較小,這是由于TS-82進入衰亡期,而且前期所產(chǎn)的類胡蘿卜素降解酶的活性逐漸喪失而造成的。因此巴氏葡萄球菌TS-82聯(lián)合酵母菌發(fā)酵既可催化部分類胡蘿卜素降解,又可保留一定量的類胡蘿卜素。

圖1 兩種沙棘果酒釀造過程中類胡蘿卜素含量的變化

2.2 聯(lián)合發(fā)酵對釀造過程中多酚種類和含量的影響

2.2.1 多酚混標分離及標準曲線繪制 在前期預實驗過程中發(fā)現(xiàn)沙棘果酒中主要存在沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、蘆丁、金絲桃苷、鞣花酸和槲皮素十種多酚,因此在實驗過程中選擇這十種多酚標準品檢測沙棘果酒中多酚含量的變化。在前期預實驗得到的十種多酚標準品的波長數(shù)據(jù),選用280 nm進行多酚檢測,得到混標的液相色譜圖如圖2所示。沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、蘆丁、金絲桃苷、鞣花酸和槲皮素的保留時間分別是3.898,5.372,9.218,12.927,15.474,18.623,24.104,27.871,29.351、35.139 min。

圖2 十種多酚標準品在280 nm下的液相色譜圖

采用外標法對上述十種多酚標準品進行線性回歸分析。利用相關(guān)的標準品峰面積和對應(yīng)的濃度關(guān)系進行分析。標準品溶液采用七種不同的濃度梯度按上述方法進行分析,每個濃度做三次平行,取平均值。標準曲線如表1所示,在實驗范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 十種多酚標準品的標準曲線

2.2.2 不同釀造方法多酚含量的變化 從經(jīng)過低溫澄清、過濾后的沙棘果酒成品中提取多酚。對經(jīng)聯(lián)合發(fā)酵和傳統(tǒng)發(fā)酵的樣品中的多酚進行定性分析,結(jié)果如圖3、圖4所示,可知經(jīng)聯(lián)合發(fā)酵的樣品中的多酚種類與傳統(tǒng)方法釀造所得樣品中的多酚種類相同。

圖3 1#沙棘果酒在280 nm下的液相色譜圖

圖4 2#沙棘果酒在280 nm下的液相色譜圖

采用外標法進行定量分析,計算含量,比較其多酚含量的變化,結(jié)果如表2所示。由表2可知,聯(lián)合發(fā)酵釀造的沙棘果酒中沒食子酸、兒茶酸、阿魏酸、金絲桃苷和鞣花酸的含量顯著增加(p<0.05),總酚含量達到9.807 mg/mL,較傳統(tǒng)釀造的沙棘果酒(8.171 mg/mL)有明顯提高(p<0.05)。

表2 不同沙棘果酒中十種多酚的含量(mg/mL)

2.3 聯(lián)合發(fā)酵對釀造過程中降異戊二烯類香味物質(zhì)含量的影響

經(jīng)GC-MS測定,巴氏葡萄球菌TS-82聯(lián)合酵母菌發(fā)酵后所得沙棘果酒成品中的降異戊二烯類物質(zhì)如圖5所示,圖6表示傳統(tǒng)釀造所得沙棘果酒中的揮發(fā)性成分。由圖5和6可知,經(jīng)類胡蘿卜素降解生成的香味物質(zhì)主要有β-環(huán)檸檬醛、β-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮-5,6-環(huán)氧化物和二氫獼猴桃內(nèi)酯。經(jīng)兩種釀造方法所得香味物質(zhì)含量的比較如表3所示。

圖5 巴氏葡萄球菌TS-82聯(lián)合酵母菌發(fā)酵得沙棘果酒中降異戊二烯類物質(zhì)的GC-MS分析

圖6 酵母菌發(fā)酵得沙棘果酒中降異戊二烯類物質(zhì)的GC-MS分析

眾所周知,類胡蘿卜素降解衍生的降異戊二烯類物質(zhì),如β-紫羅蘭酮(有類似紫羅蘭香氣,具有果實底韻)[28]和β-大馬酮(具近似玫瑰的強烈芳香)[12],由于其極低的香氣閾值,成為評價酒的重要指標[9]。由表3結(jié)果可知,經(jīng)巴氏葡萄球菌TS-82聯(lián)合酵母菌發(fā)酵可顯著促進沙棘果酒中降異戊二烯類化合物的含量(p<0.05)。其中β-紫羅蘭酮和β-紫羅蘭酮-5,6-環(huán)氧化物含量增加最多,分別達到0.16和0.11 mg/mL,這與之前課題組得到的TS-82所產(chǎn)酶催化β-胡蘿卜素降解所產(chǎn)的香氣物質(zhì)相一致[21],表明巴氏葡萄球菌TS-82在沙棘果酒釀造過程中產(chǎn)生類胡蘿卜素降解酶,可有效改善沙棘果酒的風味。

表3 不同沙棘果酒中主要異戊二烯類香氣物質(zhì)的含量(mg/mL)

3 結(jié)論

利用巴氏葡萄球菌TS-82聯(lián)合釀酒酵母發(fā)酵沙棘果酒可催化部分類胡蘿卜素降解產(chǎn)生風味物質(zhì),同時也可保留一定量的類胡蘿卜素,確保沙棘果酒的營養(yǎng)和風味兼得。同樣地,GC-MS結(jié)果也表明聯(lián)合發(fā)酵的方法可有效改善沙棘果酒的風味。而在實驗過程中,發(fā)現(xiàn)釀酒酵母和巴氏葡萄球菌TS-82的共同添加也可提高沙棘果酒中游離酚的含量。綜上,利用巴氏葡萄球菌TS-82聯(lián)合酵母的發(fā)酵方法,可使沙棘果酒的風味得到明顯改善。

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