牛 翠，黃紅革，馬 芳，薛 云，董月穩(wěn)，時東彥△

(1.河北省邢臺市第三醫(yī)院檢驗科 054000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科，石家莊 050000)

多重耐藥鮑曼不動桿菌，特別是耐碳青霉烯類的鮑曼不動桿菌的報道越來越多，其在院內(nèi)導(dǎo)致致死性感染，如呼吸機相關(guān)肺炎、敗血癥、腦膜炎等[1-2]。為指導(dǎo)臨床及時對感染多重耐藥的鮑曼不動桿菌患者選擇有效的抗菌藥物，現(xiàn)探討應(yīng)用CarbAcineto NP方法(改良CarbaAcineto NP實驗)，檢測耐碳青霉烯酶的不動桿菌屬。

1 材料與方法

1.1一般材料 選擇邢臺市第三醫(yī)院2015年1月至2016年1月從臨床標(biāo)本分離所得的非重復(fù)鮑曼不動桿菌株，共80株，所有菌株用無菌紙片―20 ℃低溫保存，采用VITEK COMPACT全自動細(xì)菌藥敏鑒定儀進行鑒定。質(zhì)控菌株為肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705和ATCC BAA-17056，大腸埃希菌ATCC 25922，均來源于原衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.2儀器與試劑 VITEK COMPACT全自動細(xì)菌鑒定儀(法國生物梅里埃公司)；Gene Amp PCR System 2400熱循環(huán)儀(美國Applied Biosystems Inc.)； ID Scientific 自動凝膠成像系統(tǒng)(美國 Kodak Inc.)。Premix Taq酶(大連Takara公司)；DNA Marker DL 2000(大連Takara公司)；瓊脂糖(美國Hydra Gene公司)；Goldviw顯影液(北京賽百盛生物技術(shù)公司)；氯化鈉(純度：≥99.5%)(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)；硫酸鋅(ZnSO4·7H2O≥99.5%)，苯酚紅 (天津永大化學(xué)試劑有限公司)；亞胺培南西司他丁鈉(杭州默沙東制藥有限公司)。

1.3菌株鑒定和藥敏試驗 80株鮑曼不動桿菌進行純培養(yǎng)，運用VITEK COMPACT全自動細(xì)菌鑒定儀進行藥敏試驗，按照2015年美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)判定細(xì)菌的耐藥情況。

1.4碳青霉烯酶OXA-23基因檢測 采用煮沸法在滅菌蒸餾水中加入數(shù)個菌落，100 ℃水中煮沸10 min，4 ℃，12 000 r/min離心5 min，上清液作為PCR模板。引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，OXA-23-F：5′GAT CGG ATT GGA GAA CCA GA；OXA-23-R：5′ATT TCT GAC CGC ATT TCC AT。目的片段501 bp，反應(yīng)體系25 μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性 95 ℃ 2 min,循環(huán)參數(shù)：變性95 ℃ 30 s;退火溫度52 ℃ 30 s;延伸72 ℃ 1 min;延伸72 ℃ 10 min,共循環(huán)30次 。 取5 μL PCR產(chǎn)物用1.5%含Goldview染料的瓊脂糖凝膠電泳，然后在紫外成像儀上成像并記錄結(jié)果。

1.5CarbAcineto NP方法 參照CLSI M100-S25，采用5 mol/L NaCl替代Tris-HCL[3]。取1環(huán)(10 μL)在血瓊脂平板上過夜培養(yǎng)的細(xì)菌，加入含100 μL 5 mol/L NaCl管中振蕩混勻。每株菌分別加入2個EP管中，分別設(shè)置為A管(對照管)和B管(試驗管)。A管中加入100 μL酚紅硫酸鋅溶液(pH值7.8);B管中加入100 μL含12 mg/mL亞胺培南西司他丁鈉的酚紅硫酸鋅溶液(pH值7.8)，35 ℃溫育2 h后觀察結(jié)果。CarbAcineto NP結(jié)果判讀:(1)A管和B管都為紅色或紅-橙色，結(jié)果為陰性(非碳青霉烯酶產(chǎn)生株)。(2)A管為紅色或紅-橙色，B管為黃色、深黃色或淺橙色，結(jié)果為陽性(碳青霉烯酶產(chǎn)生株)。(3)若A管為深黃色、黃色、淺橙色或橙色，B管為任何顏色，則結(jié)果判為無效。肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706和ATCC BAA-1705分別作為陰性和陽性對照。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，使用配對χ2檢驗中McNemar檢驗對OXA-23和CarbAcineto NP的陽性率進行比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1鮑曼不動桿菌的耐藥性分析 80株鮑曼不動桿菌中49株細(xì)菌對碳青霉烯類藥物耐藥，31株對碳青霉烯類藥物敏感。

2.2PCR檢測OXA-23基因結(jié)果分析 耐碳青霉烯類的49株鮑曼不動桿菌中，有47株攜帶OXA-23基因，攜帶率為95.9%。見圖1。

注：N表示陰性對照；P表示陽性對照；M表示標(biāo)記物

圖1 OXA-23基因的PCR檢測

2.3CarbAcineto NP檢測結(jié)果分析 耐碳青霉烯類的49株鮑曼不動桿菌中，43株菌CarbAcineto NP方法檢測為陽性。31株對碳青霉烯類敏感株中有30株菌CarbAcineto NP檢測為陰性。見表1。

表1 OXA-23和CarbAcineto NP的檢測結(jié)果和耐藥性

2.4CarbAcineto NP與PCR的檢測結(jié)果比較 與PCR比較，CarbAcineto NP方法的陽性預(yù)測值為87.8%(43/49)，陰性預(yù)測值為96.7%(30/31)。見表2。

表2 CarbAcineto NP和PCR的檢測結(jié)果比較(n)

3 討 論

本研究結(jié)果表明，80株鮑曼不動桿菌中49株菌對碳青霉烯類耐藥，耐藥率為61.3%，47株攜帶OXA-23基因，攜帶率為95.9%，該院耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的主要基因型為OXA-23型。較多研究報道此類鮑曼不動桿菌的基因型為OXA-23[4-6]。本研究2株鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類敏感且攜帶OXA-23基因，可能原因為這2株細(xì)菌無ISAbal提供的強啟動子，無法使OXA-23表達(dá)量增加，但需進一步的實驗證實[7-8]。

Carba NP方法原理是細(xì)菌可水解亞胺培南藥物的β-內(nèi)酰胺環(huán)，然后通過酚紅的顏色變化進行驗證[9]。腸桿菌和綠膿桿菌所產(chǎn)生的金屬β-內(nèi)酰胺酶和KPC酶通過實驗表明有較高的敏感性(>90%)和特異性(>90%)，然而傳統(tǒng)的CarbaAcineto NP方法很難檢測出不動桿菌屬的碳青霉烯酶，是由于不動桿菌屬產(chǎn)生了較弱的OXA型D類碳青霉烯酶。因此，DORTET等[9]建立一種CarbAcineto NP方法(改良的Carba NP實驗)檢測不動桿菌屬的碳青霉烯酶。CarbAcineto NP方法由于挑取的菌株量較CarbaAcineto NP方法增加2倍，因此增加了酶的釋放量，且使用5 mol/L NaCl高滲溶液不會像蛋白抽提液(Tris-HCl)會對溶液導(dǎo)致輕微的pH值的改變，更容易使細(xì)菌蛋白得到完全釋放。 本研究有2株耐碳青霉稀類藥物的菌株在CarbAcineto NP和PCR方法檢測為陰性，由于鮑曼不動桿菌耐碳青霉烯類藥物的機制有很多(如細(xì)菌外膜通透性)下降；外排泵高表達(dá)；產(chǎn)碳青霉烯酶A類(KPC、GES型)、B類(IMP、VIM、SIM、NDM型)、D類(OXA-24、OXA-51、OXA-58、OXA-143、OXA-235型)[10-12]。由于本實驗檢測方法有限，這2株細(xì)菌的耐藥機制還需進一步檢測。

2株對碳青霉烯類敏感的鮑曼不動桿菌經(jīng)CarbAcineto NP方法檢測呈陰性，OXA-23基因呈陽性，原因可能是OXA-23基因表達(dá)的碳青霉烯酶活性較弱，無ISAbal提供的強啟動子，致使未對碳青霉烯類耐藥，但仍需進一步實驗驗證。

DORTET等[9]應(yīng)用CarbAcineto NP方法對151株產(chǎn)碳青霉烯酶和69株不產(chǎn)碳青霉烯酶的不動桿菌屬進行檢測，除GES型外，所有為后天獲得的碳青霉烯酶基因型。如果由于OXA-51固有基因過度表達(dá)或由非碳青霉烯酶機制導(dǎo)致，這項實驗結(jié)果依然陰性，其敏感性和特異性分別達(dá)94.7%和100.0%。而本實驗CarbAcineto NP方法的敏感性和特異性分別達(dá)87.8%和96.2%，與PCR方法比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。CarbAcineto NP方法操作相對簡單，試劑易于配置，價格低廉，耗時較短，結(jié)果易于觀察，在臨床實驗室可很好地開展，是檢測產(chǎn)碳青霉烯酶的鮑曼不動桿菌的快速檢測方法。

參考文獻(xiàn)

[1]TORRES H A,VAZQUEEZ E G,YAGUE G,et al.Multidrug resistant Acinetobacter baumanii:clinical update and new highlights[J].Rev Esp Quimioter,2010,23(1)：12-15.

[2]THOM K A,JOHNSN J K,LEE M S,et al.Environmental contamination because of multidrug-resistant Acinetobacter baumanii surrounding colonized or infected patients[J].Am J Infect Control,2011,39(9):711-715.

[3]Clinical and Laboratory Standards Institute．Performance standards for antimicrobial susceptibility testing:twenty-fifth informational supplement:M100-S25[S]． CLSI，Wayne:PA，USA，2015．

[4]王輝，孫宏莉，廖康，等.北京和廣州地區(qū)四家醫(yī)院不動桿菌碳青霉烯酶基因型研究[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2005，28(6)：636-641.

[5]WOODFORD N,ELLINGTON M J,COELHO J M,et al.Multiplex PCR for genes encoding prevalent OXA carbapenemases in Acinetobacter spp[J].Int J Antimicrob Agents,2006,27(4):351-353.

[6] SUSAN B,SEBASTIAN A.OXA β-lactamases in Acinetobacter:the story so far[J].Antimicmbial Chernotherapy,2006,57(6):1-3.

[7]FIGUEIREDO S.Overexpression of the naturally occurring blaOXA-51 gene in Acinetobacter baumannii mediated by novel insertion sequence ISAba9[J].Antimicrob Agents Chemother，2009，53(9)：4045-4047．

[8]FU Y,ZHOU J,ZHOU H,et al.Wide dissemination of OXA-23-producing carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii clonal complex 22 in multiplecities of China[J].J Antimicrob Chemother,2010,65(4):644-650.

[9]DORTET L,POIREL L,NORDMANN P.Rapid identification of carbapenemase types in enterobacteriaceae and pseudomonas spp.by using a biochemical test[J].Antimicrob Agents Chemother,2012,56(12):6437-6440.

[10]DORTET L,POIREL L,ERRERA C,et al.CarbAcineto NP test for rapid detection of carbapenemase-producing Acinetobacter spp[J].J Clin Microbiol,2014,52(7):2359-2364.

[11]DIENE S M,ROLAIN J M.Carbapenemase genes and genetic platforms in Gram-negative bacilli:Enterobacteriaceae,Pseudomonas and Acinetobacter species[J].Clin Microbiol Infect,2014,20(9):831-838.

[12]RUMBO C，GATO E，LOPEZ M，et al.Contribution of efflux pumps，porins，and β-lactamases to multidrug resistance in clinical isolates of Acinetobacter baumannii[J].Antimicrob Agents Chemother，2013，57(11)：5247-5257.