徐 舶，高 霞，石鳳翎，崔 楠，烏日娜

(內蒙古農業(yè)大學草原與資源環(huán)境學院，內蒙古 呼和浩特 010019)

苜蓿(Medicagosativa)是世界上種植最廣泛的飼料作物之一，提高苜蓿飼草產(chǎn)量和營養(yǎng)價值是苜蓿育種的主要目標[1]。利用苜蓿雄性不育系配制雜交種，可以提高種子產(chǎn)量，同時可利用雜種優(yōu)勢提高抗性，選育新品種。雜種優(yōu)勢育種除了雙親遺傳組成的適當差異外，還要以純合品種為前提。要進一步選育苜蓿純合品種，僅靠常規(guī)的育種手段難以奏效，需借助花藥[2]與花粉組織培養(yǎng)得到單倍體植株[3]，單倍體加倍后培育出雙單倍體，利用雙單倍體(即純合品種)與雄性不育系配制雜交種，可獲得強優(yōu)勢的雜交種F1代。

黃花苜蓿(M.falcate)抗逆性強，適于我國寒冷草原地區(qū)種植，具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟價值[4]，適宜作為雜交組配的父本材料，因而借助花藥組織培養(yǎng)的方式獲得純合的黃花苜蓿材料具有重要的意義。目前雖有很多關于黃花苜蓿組培體系的研究[4-8]，但組織培養(yǎng)體系并不完善，國內也未見獲得單倍體以及雙單倍體黃花苜蓿的報道。因此，本研究以呼倫貝爾黃花苜蓿(Medicagofalcate‘Hulunbeier’)為材料，建立花藥組織培養(yǎng)的高效再生體系，鑒定出單倍體，以期為雙單倍體的培養(yǎng)奠定基礎[9]。

1 材料與方法

1.1 材料與藥品

試驗材料為呼倫貝爾黃花苜蓿，種子由呼倫貝爾草原站提供，于2015年種植在內蒙古農業(yè)大學新校區(qū)牧草試驗地。4-5月，選擇處于單核靠邊期(花蕾長至1～3 mm)的花蕾，將帶有枝條的花序剪下裝入紗網(wǎng)袋，帶回實驗室備用。

本試驗所用激素均由西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司提供，純度均在95%以上。培養(yǎng)基由Chembase公司提供，蔗糖為天津大茂公司提供的分析純試劑，瓊脂由Biosharp公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1誘導愈傷組織培養(yǎng)基的配比 采用固體及液體懸浮培養(yǎng)兩種培養(yǎng)方式。以B5為誘導花藥愈傷培養(yǎng)基，參考前人試驗結果[4,10]設置各培養(yǎng)基的激素配比，選用L16(44)正交表(表1)。其中固體培養(yǎng)加蔗糖30.0 g·L-1，瓊脂7.0 g·L-1，pH 5.8。液體懸浮培養(yǎng)加蔗糖30.0 g·L-1，0.01 g·L-1活性炭，pH 5.8。

1.2.2固體培養(yǎng)基花藥誘導愈傷組織方法 滅菌處理：將帶有枝條的花序裝入紗網(wǎng)袋，在流水下沖洗30 min，超凈工作臺中用70%酒精消毒30 s，然后用無菌水沖洗2次，0.1% HgCl2溶液消毒3 min，無菌水沖洗3次，置于無菌培養(yǎng)皿中待用。

表1 呼倫貝爾黃花苜?；ㄋ幷T導愈傷組織培養(yǎng)正交試驗的各因素水平Table 1 The level of various factors in the orthogonal test of induction callus culture of Medicago falcata ‘Hulunbeier’ anthers

接種：選擇單核靠邊期花蕾，消毒后用解剖針剝開花蕾，取出花藥分別接種到培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基上接種15個花藥，各8個重復。

1.2.3液體懸浮培養(yǎng)基花藥誘導愈傷方法 花序消毒后(消毒方法同前)，選擇單核靠邊期花蕾，用解剖針剝開小花蕾取出花藥，接種在液體培養(yǎng)基中。每個培養(yǎng)基上接種10個花藥，各6個重復。置轉速110 r·min-1、25 ℃的搖床中暗培養(yǎng)60 d。

1.2.4愈傷組織的分化培養(yǎng) 固體培養(yǎng)和液體懸浮培養(yǎng)出的愈傷組織，均轉入固體分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在崔楠[11]試驗的基礎上稍作改進，在分化培養(yǎng)基中添加了6-BA，分化培養(yǎng)基組成如表2所列，pH 5.8，蔗糖20.0 g·L-1，瓊脂7.0 g·L-1。每瓶接種5塊愈傷組織，各5個重復，20 d繼代一次。

表2 愈傷分化培養(yǎng)基Table 2 Medium for shoot development

1.2.5分化苗的生根培養(yǎng) 以誘導出的分化苗為材料進一步篩選適宜的生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組成如表3所列，pH 5.8，蔗糖20.0 g·L-1,瓊脂7.0 g·L-1。

1.2.6結果觀察與統(tǒng)計方法 固體培養(yǎng)從花藥接種30 d后，統(tǒng)計出愈率；液體懸浮培養(yǎng)從花藥接種60 d后，統(tǒng)計出愈率。愈傷組織增殖培養(yǎng)一次(30 d)后轉入分化培養(yǎng)基，分化出綠苗后統(tǒng)計分化率。

表3 苜?；ㄋ幣囵B(yǎng)植株的生根培養(yǎng)基Table 3 Rooting media for cultured alfalfa plants

出愈率=(產(chǎn)生愈傷組織塊數(shù)/接種花藥數(shù))×100%;

分化率=(分化出芽點的愈傷組織數(shù)/接種愈傷組織總數(shù))×100%;

生根率=(生根植株數(shù)/接種分化苗總數(shù))×100%。

利用Excel軟件處理基礎數(shù)據(jù)，SAS(9.0)軟件進行方差分析。

1.2.7倍性鑒定 通過貝克曼流式細胞儀(Beckman coulter cytoFLEX)對呼倫貝爾黃花苜?；ㄋ幣囵B(yǎng)再生植株進行倍性鑒定。對照材料為：已知倍性扁蓿豆(Medicagoruthenica)(2n=16)無菌苗,草原1號雜花苜蓿(Medicagovaria‘Caoyuan No.1’)(2n=32)無菌苗。

前處理方法參考高霞[12]的操作過程，略有改進。樣品破碎后，轉速1 000 r·min-1，離心5 min。PI染色15 min。

在488 nm熒光的激發(fā)下，測定PE通道待測樣的熒光強度，利用Cyt Expert軟件進行分析，根據(jù)峰值位置確定所測植株的倍性。

2 結果與分析

2.1 呼倫貝爾黃花苜?；ㄋ幗M織培養(yǎng)出愈情況

在16個激素配比組合中，花藥在液體培養(yǎng)條件下有56.3%的組合出愈率為0，而固體培養(yǎng)基下均表現(xiàn)出一定的出愈率(1.67%～26.67%)(表4)。A5液體懸浮培養(yǎng)條件下的出愈率(70.00%)明顯高于A14固體培養(yǎng)的出愈率(26.67%)，同時，花藥愈傷組織形成時間在液體培養(yǎng)中(60 d)較固體培養(yǎng)下的時間(20 d)長。

在液體懸浮培養(yǎng)條件下，由各激素的R值可知，對花藥的出愈率影響較大的激素是2,4-D(表5)。呼倫貝爾黃花苜蓿在0.5 mg·L-12,4-D濃度下懸浮培養(yǎng)花藥的出愈率均高于不同2,4-D濃度下固體培養(yǎng)花藥的出愈率。綜合考慮不同培養(yǎng)方式和激素配比的影響，呼倫貝爾黃花苜?；ㄋ帒腋∨囵B(yǎng)的適宜條件為B5培養(yǎng)基+0.5 mg·L-12,4-D+0.25 mg·L-16-BA+0.4 mg·L-1NAA+3.0 mg·L-1KT+3%蔗糖+0.01 g·L-1活性炭。

表4 不同培養(yǎng)方式和激素配比下呼倫貝爾黃花苜蓿花藥培養(yǎng)的出愈率Table 4 Callus induction rate in the anther tissue culture of different culture methods and hormone ratio on Medicago falcata ‘Hulunbeier’

同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Different lowercase letters within the same column indicate significant differences at the 0.05 level; similarly for the following tables.

表5 呼倫貝爾黃花苜?；ㄋ幰后w懸浮培養(yǎng)出愈率的極差Table 5 Range analysis of callus rate in the liquid culture of the anther of Medicago falcata ‘Hulunbeier’

K1、K2、K3、K4均值分別表示在4因素各水平下新鮮花藥出愈率的平均值，R為同一因素各水平下出愈率均值的極差。

The means ofK1,K2,K3andK4indicate the means of callus induction rate of fresh anther of four factors at different levels.Ris the range of average callus induction rate of the same factor at different levels.

2.2 愈傷組織分化

為了探索用于愈傷組織分化的最佳激素組合和配比，將0.2 mg·L-1NAA和1.0 mg·L-12,4-D分別與兩個濃度水平的6-BA(0.5 mg·L-1和1.0 mg·L-1)進行組合(表6)。結果顯示，2,4-D與6-BA的組合對呼倫貝爾黃花苜蓿愈傷組織的分化作用優(yōu)于NAA與6-BA的組合。其中，2,4-D 1.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1的組合對呼倫貝爾黃花苜蓿愈傷組織的分化誘導高達88%。

2.3 分化苗生根率

呼倫貝爾黃花苜蓿在Ⅲ號培養(yǎng)基下生根率(87%)顯著高于其余3種培養(yǎng)基(表7)。同時，其分化率在0.1mg·L-1NAA的培養(yǎng)基下顯著高于0.2 mg·L-1NAA的培養(yǎng)基(P<0.05)，說明相對的低濃度NAA有利于分化苗的生根培養(yǎng)(圖1)。因此，分化苗適宜生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基+0.1 mg·L-1NAA+2%蔗糖+0.7%瓊脂。

表6 不同培養(yǎng)基上呼倫貝爾黃花苜蓿愈傷組織的分化率Table 6 Callus differentiation rate in four medium types for Medicago falcata ‘Hulunbeier’

表7 不同培養(yǎng)基上的生根率比較Table 7 Comparison of rooting rate in the callus in four types of medium

圖1 呼倫貝爾黃花苜蓿組織培養(yǎng)再生過程Fig. 1 Photographs of the tissue culture regeneration process in Medicago falcata ‘Hulunbeier’

2.4 再生植株倍性鑒定

采用改進后的前處理方法，轉速1 000 r·min-1，離心5 min，PI染色15 min，圖譜主峰明顯，碎片減少(圖2)。以已知倍性扁蓿豆(2n=16)無菌苗、草原1號雜花苜蓿(2n=32)無菌苗為對照(CK)進行倍性鑒定，固體培養(yǎng)方式下培養(yǎng)的再生植株(10株)均為四倍體，無單倍體(表8)；而在液體懸浮培養(yǎng)方式下再生植株(15株)中單倍體為27%(圖3)。

表8 呼倫貝爾黃花苜?；ㄋ幣囵B(yǎng)再生植株倍性檢測結果Table 8 Result of ploidy detection of anther culture regenerative plants of Medicago falcata ‘Hulunbeier’ %

圖2 前處理改進前(左)后(右)流式細胞儀鑒定圖譜Fig. 2 Flow cytometry identification map before (left) and after (right) the improvement of processing

圖3 呼倫貝爾黃花苜?；ㄅ嘣偕仓炅魇郊毎麅x鑒定圖譜Fig. 3 Flow cytometry identification map of anther culture regenerated plants

A，扁蓿豆 (2n=16)；B，草原1號雜花苜蓿(2n=32)；C，呼倫貝爾黃花苜蓿花培苗單倍體；D，呼倫貝爾黃花苜蓿花培苗四倍體。

A,Medicagoruthenica(2n=16); B,Medicagovaria‘Caoyuan No.1’(2n=32); C, Haploid ofM.falcata‘Hulunbeier’; D, Tetraploid ofM.falcata‘Hulunbeier’.

3 討論

3.1 外源激素對苜?；ㄋ幣囵B(yǎng)的影響

激素組合與濃度配比是誘導花藥愈傷組織出愈率高低的重要影響因素[13]，以多花黑麥草特高(Loliummultiflorum‘Tetragold’)和多年生黑麥草四季(L.perenne‘Four seasons’)的種子為外植體，激素組合為2,4-D +6-BA 時能明顯降低組培污染率，且能分別得到65.52%和63.55%的最高愈傷組織誘導率[14]；以雜交狼尾草(Pennisetumamericanum×P.purureum)的種子為材料進行試驗，發(fā)現(xiàn)種子愈傷組織分化的最佳激素組合為0.5 mg·L-1NAA+3.0 mg·L-16-BA，分化率可達62.5%[15]。由此可見，生長素與細胞分裂素的合理搭配是提高花藥愈傷組織誘導率和分化率的關鍵[16]。黃竣和姜彥秋[5]以黃花苜蓿下胚軸和子葉為材料誘導愈傷組織，發(fā)現(xiàn)2,4-D是誘導愈傷的關鍵激素[17]，激素組合為2,4-D 1.0 mg·L-1+6-BA 0.2 mg·L-1時出愈率最高，2,4-D 0.2 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1時分化率最高(20%)。伊風艷等[4]選用相同的材料做外植體誘導愈傷組織，但分化培養(yǎng)基選用了NAA和KT的組合，得出，下胚軸是誘導愈傷及分化的最佳外植體，誘導率可達100%，分化率可達80%。本研究表明，2,4-D與6-BA對呼倫貝爾黃花苜?；ㄋ幱鷤M織的分化率有顯著的提高，激素配比為2,4-D 1.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1時分化率達到88%，高于伊風艷等[4]、黃竣和姜彥秋[5]的結果，這與外植體及材料不同有一定的關系。

圖4 呼倫貝爾黃花苜蓿花培苗單倍體和四倍體Fig. 4 Flower seeding culture haploid and tetraploid of M. falcata ‘Hulunbeier’

3.2 培養(yǎng)方式對苜?；ㄋ幣囵B(yǎng)的影響

陳愛萍等[18]以液體懸浮培養(yǎng)的方式，通過觀察小孢子的存活率和誘導率，建立了苜蓿游離小孢子培養(yǎng)體系，小孢子存活率達到30.1%。姚喜紅等[19]采用固液培養(yǎng)基結合的方式建立苜?；ㄋ帒腋∨囵B(yǎng)體系，培養(yǎng)液組合為NB+2,4-D 0.3 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1時懸浮細胞增殖最快。可見，不同的培養(yǎng)方式對苜蓿花藥培養(yǎng)影響較大。

本研究中，呼倫貝爾黃花苜?；ㄋ幵谝后w培養(yǎng)中60 d才形成愈傷組織，而固體培養(yǎng)下20 d便可形成愈傷組織，說明不同培養(yǎng)方式下花藥愈傷組織形成時間不同[20]，固體培養(yǎng)較液體懸浮培養(yǎng)下花藥愈傷組織形成時間短[21]。雖然液體懸浮培養(yǎng)花藥愈傷組織形成周期較長，但在花藥培養(yǎng)中單倍體植株出苗的頻率增高，在培育過程中，液體懸浮培養(yǎng)下單倍體比例(27%)高于固體培養(yǎng)條件下的單倍體比例(0)。高霞[12]在固體培養(yǎng)下苜?；ㄅ嗝鐔伪扼w所占比例(16%)低于本研究結果，這可能是因為液體懸浮培養(yǎng)可以使花藥充分接觸培養(yǎng)基，提供花藥愈傷組織形成所需的養(yǎng)分，并且搖床震蕩可以在培育過程中使花粉散落出來形成花粉愈傷組織，提高單倍體比例，同時固體培養(yǎng)條件下單倍體比例的差異可能是由材料不同即基因型不同所致。

3.3 前處理對再生植株倍性鑒定的影響

倍性鑒定是單倍體育種的關鍵環(huán)節(jié)，是構建雙單倍體的基礎[22]?；ㄋ幣囵B(yǎng)得到不同倍性的植株只有經(jīng)倍性鑒定后才能進行下一步的育種研究。通過流式細胞測定法進行倍性鑒定可以縮短鑒定時間[23]，但不同的測定部位、前處理方法對結果圖譜影響很大[24]。耿小麗等[25]利用流式細胞儀對苜蓿愈傷組織DNA含量進行測定，由于愈傷組織結構較松散，所以圖譜雖主峰明顯但有效細胞數(shù)較少。高霞[12]通過二步離心法鑒定苜蓿花培再生植株倍性，所得圖譜雜峰較多，這是由于前處理時間過長造成的。本研究選取再生植株的幼嫩葉片，采用一步離心法，轉速1 000 r·min-1，離心5 min，同時縮短PI染色時間(15 min)[26]，可以有效減少碎片和粘連的影響，主峰值明顯，有效細胞數(shù)量多，也可避免DNA的降解和PI染液的分解，圖譜清晰。

4 結論

1)呼倫貝爾黃花苜?；ㄋ幗M織培養(yǎng)適于液體懸浮培養(yǎng)，其愈傷形成的培養(yǎng)條件為B5+0.5 mg·L-12,4-D+0.25 mg·L-16-BA+0.4 mg·L-1NAA+3.0 mg·L-1KT；分化培養(yǎng)基為MS+2,4-D 1.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1+2%蔗糖+0.7%瓊脂；生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.1 mg·L-1NAA+2%蔗糖+0.7%瓊脂。

2)利用流式細胞儀鑒定再生植株倍性時，應選擇幼嫩的葉片，同時縮短前處理時間，可較為準確地鑒定出組織的染色體倍性；液體懸浮培養(yǎng)再生植株中單倍體占27%。

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