鐘挺挺，李燕玲，何小洪，董吁鋼，馬虹，鄭振聲，張焰

(1中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州510080；2深圳市孫逸仙心血管醫(yī)院；3中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是危害人類身體健康的重大疾病，AS性心腦血管疾病已經(jīng)成為世界各國(guó)人群病死的重要原因，國(guó)內(nèi)患病率也在逐年攀升。AS始于血管內(nèi)皮損傷導(dǎo)致的功能障礙，脂質(zhì)沉積是引起上述病變的重要誘因[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)，AS病灶好發(fā)于血管分叉開口處、彎曲處，其局部流體剪切應(yīng)力較低且方向紊亂，而相對(duì)少見于直行血管，其局部流體剪切應(yīng)力較高且方向一致。剪切應(yīng)力影響血管內(nèi)皮細(xì)胞表型[3,4]，但在高脂環(huán)境下血管內(nèi)皮細(xì)胞黏著斑的變化、對(duì)流體剪切應(yīng)力的反應(yīng)及其作用機(jī)制尚未完全闡明。2013年10月～2017年12月本研究擬探討流體剪切應(yīng)力對(duì)氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和黏著斑重塑的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 ox-LDL(廣州奕元生物科技公司)，Integrin β1Antibody(美國(guó)Abcam公司)，F(xiàn)AK Antibody(美國(guó)Cell Signal Technology公司)，Paxillin Antibody(美國(guó)Cell Signal Technology公司)，Phalloidin(美國(guó)Sigma公司)，相差顯微鏡(Eclipse TS100，日本Nikon公司)，平行板流動(dòng)腔Parallel-Plate Flow Chamber(德國(guó)ibidi公司)，激光掃描共聚焦顯微鏡(LSM 780，德國(guó)ZEISS公司)等。

1.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs) 提取與培養(yǎng) HUVECs由新鮮臍帶提取，主要步驟如下：37 ℃水浴鍋復(fù)溫Ⅱ型膠原酶溶液、PBS，用20 mL注射器吸取PBS反復(fù)沖洗臍靜脈腔直至流出液變?yōu)槌吻?，吸取Ⅱ型膠原酶溶液充盈臍靜脈腔，兩端夾閉，37 ℃恒溫孵育15 min，揉搓以使臍靜脈內(nèi)皮松解，將腔內(nèi)消化液移入離心管，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，加入5 mL SFM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，移入37 ℃ 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[5]。

1.3 細(xì)胞干預(yù)及分組 將傳代培養(yǎng)4～5代的HUVECs接種于平行板流動(dòng)腔，培養(yǎng)48 h獲得致密貼合的單細(xì)胞層。將ox-LDL溶于SFM培養(yǎng)基，終濃度100 μg/mL，灌入平行板流動(dòng)腔，使用蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)管路液體流動(dòng)。參照文獻(xiàn)[6]的方法構(gòu)建5、25 dyne/cm2流體剪切應(yīng)力，計(jì)算公式τ=6 μQ/a2b，其中μ為流體黏度(dynos/cm2) ，Q為流量(mL/s)，a為流體腔高度(cm)，b為流體腔寬度(cm)，干預(yù)時(shí)長(zhǎng)為4 h。細(xì)胞隨機(jī)分為4組：靜態(tài)組、靜態(tài)加ox-LDL干預(yù)組、5 dyne/cm2流體剪切應(yīng)力加ox-LDL干預(yù)組、25 dyne/cm2流體剪切應(yīng)力加ox-LDL干預(yù)組。靜態(tài)組細(xì)胞種于平行板流動(dòng)腔內(nèi)但不予流體剪切應(yīng)力及ox-LDL干預(yù)[7]。

1.4 細(xì)胞形態(tài)觀察及留存率檢測(cè) 收集各組干預(yù)后的細(xì)胞，溫PBS清洗后4%多聚甲醛固定15 min，相差顯微鏡成像，觀察細(xì)胞形態(tài)，隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)區(qū)攝片，Image J軟件計(jì)算細(xì)胞數(shù)，分析附著于基質(zhì)的細(xì)胞留存率[8]。

1.5 細(xì)胞內(nèi)整合素-β1(Integrin-β1)、黏著斑激酶(FAK)、樁蛋白(Paxillin)表達(dá)檢測(cè) 采用免疫熒光法。收集干預(yù)后的內(nèi)皮細(xì)胞，溫PBS清洗后4%多聚甲醛固定15 min，0.1% Triton-X-100通透30 min，1% FBS封閉抗原表位，分別加入1∶1 000稀釋的Integrin-β1、FAK、Paxillin一抗，4 ℃過(guò)夜孵育，加入1∶500稀釋的熒光二抗，37 ℃孵育1 h，加入1∶10稀釋的DAPI，常溫孵育15 min。激光掃描共聚焦顯微鏡隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)區(qū)攝片，用Image J軟件分析各視野綠色熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變及留存率比較 靜態(tài)組相差顯微鏡成像顯示內(nèi)皮細(xì)胞扁平，長(zhǎng)圓形“鵝卵石”樣，排列緊密但沒(méi)有固定的方向，內(nèi)皮細(xì)胞單層覆蓋均勻完整；靜態(tài)加ox-LDL干預(yù)組內(nèi)皮細(xì)胞失去了典型的形態(tài)，胞膜皺縮，胞體變小，圓隆，排列紊亂，表面附著有多個(gè)細(xì)胞碎片，約20%胞體脫落， 內(nèi)皮細(xì)胞單層完整性受損；5 dyne/cm2流體剪切應(yīng)力加ox-LDL干預(yù)組細(xì)胞形態(tài)已比靜態(tài)加ox-LDL干預(yù)組有所改善，脫落有所減少，但排列仍較紊亂；25 dyne/cm2流體剪切應(yīng)力加ox-LDL干預(yù)組細(xì)胞呈長(zhǎng)紡錘狀，傾向于順著流動(dòng)方向排列，細(xì)胞排列緊密，脫落較少，細(xì)胞與基質(zhì)之間的黏附較為牢固。25 dyne/cm2流體剪切應(yīng)力加ox-LDL干預(yù)組細(xì)胞留存率為95.15%±16.20 %，高于靜態(tài)加ox-LDL組(80.95%±14.72 %)、5 dyne/cm2流體剪切應(yīng)力加ox-LDL干預(yù)組(88.86%±14.23 %)(P均<0.05)。靜態(tài)加ox-LDL組細(xì)胞留存率與5 dyne/cm2流體剪切應(yīng)力加ox-LDL干預(yù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組Integrin-β1、FAK、Paxillin表達(dá)比較 靜態(tài)加ox-LDL干預(yù)組、5 dyne/cm2流體剪切應(yīng)力加ox-LDL干預(yù)組、25 dyne/cm2流體剪切應(yīng)力加ox-LDL干預(yù)組Integrin-β1、FAK、Paxillin的熒光強(qiáng)度均高于靜態(tài)組(P均<0.05)；5 dyne/cm2流體剪切應(yīng)力加ox-LDL干預(yù)組Integrin-β1、FAK、Paxillin熒光強(qiáng)度低于靜態(tài)加ox-LDL干預(yù)組(P<0.05)；25dyne/cm2流體剪切應(yīng)力加ox-LDL干預(yù)組Integrin-β1、FAK、Paxillin熒光強(qiáng)度低于靜態(tài)加ox-LDL干預(yù)組及5 dyne/cm2流體剪切應(yīng)力加ox-LDL干預(yù)組(P均<0.05)，見表1。

表1 各組Integrin-β1、FAK、Paxillin熒光強(qiáng)度比較

3 討論

血管內(nèi)皮是由單層內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜構(gòu)成的一層半選擇性通透屏障，是分隔血漿與組織液維持跨內(nèi)皮蛋白濃度梯度的重要結(jié)構(gòu)，能夠通過(guò)自分泌、內(nèi)分泌和旁分泌等途徑分泌多種活性物質(zhì)參與血管功能的調(diào)節(jié)，對(duì)于組織的氧供與代謝廢物的轉(zhuǎn)運(yùn)具有重要的意義[9,10]。內(nèi)皮細(xì)胞層的完整性取決于內(nèi)皮細(xì)胞與相鄰細(xì)胞之間的連接以及內(nèi)皮與其下方細(xì)胞外基質(zhì)的連接，內(nèi)皮與基底膜間的連接主要為黏著斑，內(nèi)皮細(xì)胞之間的連接主要為緊密連接、黏附連接和縫隙連接。血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)部為微管、微絲和中間纖維組成的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，在維持細(xì)胞形態(tài)的同時(shí)參與生命活動(dòng)[11]。研究結(jié)果顯示，機(jī)械應(yīng)力刺激首先激活細(xì)胞膜上的感受器，引起細(xì)胞膜上相應(yīng)受體蛋白活化，包括敏感性離子通道、細(xì)胞間黏附復(fù)合物、G-蛋白偶聯(lián)受體、黏著斑等，從而導(dǎo)致胞內(nèi)一系列信號(hào)蛋白的活性發(fā)生改變，最終調(diào)節(jié)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)的合成。

細(xì)胞膜上的黏著斑是力學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)的重要樞紐，主要構(gòu)成成分為Integrin、FAK、Paxillin、紐蛋白等。黏著斑膜外與細(xì)胞外基質(zhì)連接，膜內(nèi)與細(xì)胞骨架直接相連，機(jī)械應(yīng)力即可通過(guò)黏著斑傳遞給細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)繼而傳遞到遠(yuǎn)端細(xì)胞膜、細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及細(xì)胞核，由此引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列生化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)分化、增殖及凋亡等生物學(xué)效應(yīng)[12]。

Integrin由跨膜蛋白α、β兩個(gè)亞基構(gòu)成，其胞外結(jié)構(gòu)域與配基結(jié)合而激活，繼而募集多個(gè) FAK 分子到黏著斑處，使得 FAK 酪氨酸磷酸化而被激活。FAK是由1 028個(gè)氨基酸構(gòu)成的非受體型酪氨酸激酶，參與調(diào)控多條細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，是胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的中樞分子，通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK、PI3K、p53等信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝等。Paxillin是一種細(xì)胞骨架上的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，是黏著斑蛋白vinculin的結(jié)合蛋白。近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，雖然本身可能不具有酶活性，但因?yàn)槠浞肿又泻卸喾N結(jié)構(gòu)域，能夠和一系列的信號(hào)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)合，在Integrin介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著信號(hào)傳遞“中轉(zhuǎn)站”的作用[13]。

機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞不僅可以感知外環(huán)境各種化學(xué)因素的刺激，其自身也處在各種機(jī)械環(huán)境中，當(dāng)血液在流動(dòng)的過(guò)程中，對(duì)血管壁細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生力的作用，主要包括血管內(nèi)表面的剪切應(yīng)力，血管擴(kuò)張形成的周向應(yīng)力以及對(duì)管壁的壓應(yīng)力。剪切應(yīng)力是指血液在流動(dòng)過(guò)程中與血管內(nèi)壁產(chǎn)生的摩擦力，其大小與血流速度、血液黏滯度和血管內(nèi)徑密切相關(guān)。其中，血液中各質(zhì)點(diǎn)流動(dòng)方向與血管長(zhǎng)軸平行一致的稱為層流，各質(zhì)點(diǎn)流動(dòng)方向與血管長(zhǎng)軸不一致的稱為湍流，前者見于大血管直行部位，流體剪切應(yīng)力較高(>15 dyne/cm2)且方向一致，后者見于血管分叉、彎曲、擴(kuò)張等部位，局部流體剪切應(yīng)力較低(<4 dyne/cm2)且方向紊亂。在體內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)刻處于剪切應(yīng)力的作用之下，對(duì)剪切應(yīng)力的變化非常敏感,剪切應(yīng)力影響血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和功能[14,15]。

在AS的眾多危險(xiǎn)因素中，ox-LDL被公認(rèn)為是導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞活化及血管內(nèi)皮功能障礙的最主要致病因素。在本研究中，內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)ox-LDL刺激后，胞膜皺縮，胞體脫落，細(xì)胞附著于基質(zhì)的留存率顯著下降，內(nèi)皮細(xì)胞單層完整性受損，同時(shí)黏著斑的主要成分Integrin、FAK、Paxillin表達(dá)顯著上調(diào)，提示黏著斑在這種促AS狀態(tài)下發(fā)生了重塑，但這種過(guò)度的重塑不足以代償細(xì)胞的損傷，黏著斑的功能失常，難以維持細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附。經(jīng)流體剪切應(yīng)力干預(yù)后，上述改變得到不同程度的逆轉(zhuǎn)，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)正?；?，并且傾向于順著流體的流動(dòng)方向排列，胞體脫落減少，內(nèi)皮細(xì)胞單層完整性受損現(xiàn)象明顯改善，同時(shí)Integrin、FAK、Paxillin的蛋白表達(dá)水平下調(diào)，提示ox-LDL誘導(dǎo)的黏著斑過(guò)度重塑弱化，黏著斑趨向于恢復(fù)正常形態(tài)和功能，細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附更為牢固，對(duì)于內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)的維持具有積極意義。

綜上所述，ox-LDL可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、脫落和黏著斑重塑，而生理范圍內(nèi)較高水平的層流剪切應(yīng)力能夠有效地減輕黏著斑過(guò)度重塑，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞附著于基質(zhì)，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

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