張冰，紀(jì)洪，張兆存，陳守臻，史本康(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濱州56600；山東大學(xué)齊魯醫(yī)院)

糖尿病是嚴(yán)重威脅著人類健康的常見(jiàn)疾病，糖尿病神經(jīng)源性膀胱尿道功能障礙(NVUDD)是糖尿病引起的泌尿系統(tǒng)并發(fā)癥，40%～85%的糖尿病患者可并發(fā)此癥[1]。除了因糖尿病引發(fā)的膀胱逼尿肌收縮無(wú)力之外，可能存在糖尿病引發(fā)的尿道舒張機(jī)制的異常，從而加劇了NVUDD病變進(jìn)程。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)是一種多肽物質(zhì)，是維持周圍神經(jīng)正常功能的重要的細(xì)胞因子，在因各種疾病導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)變性與修復(fù)過(guò)程中起重要作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，NGF在糖尿病膀胱病變中起重要作用[3]。p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素受體(p75NTR)是NGF受體，能介導(dǎo)施旺細(xì)胞對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)因子的功能性反應(yīng)，在人類及大鼠膀胱中存在陽(yáng)性表達(dá)[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)，p75NTR在糖尿病感覺(jué)神經(jīng)病變乃至尿道病變的發(fā)病機(jī)理中起重要作用[6]。2014年7～12月，我們觀察了糖尿病模型大鼠的尿道舒張功能障礙情況，探討NGF及其受體p75NTR在糖尿病尿道舒張功能病變中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康成年雌性SPF級(jí)Wistar大鼠24只(體質(zhì)量250～300 g)，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，均飼養(yǎng)于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF實(shí)驗(yàn)室。大鼠隨機(jī)分為2組，對(duì)照組、糖尿病組各12只。

1.2 糖尿病大鼠模型制備 糖尿病組大鼠按65 mg/kg(溶解在0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液中，pH 4.5)單劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)制備糖尿病模型，對(duì)照組大鼠腹腔注射等量枸櫞酸緩沖液。48～72 h后尾靜脈采血，用血糖儀測(cè)定全血血糖。以血糖≥300 mg/dL為糖尿病模型建立。

1.3 尿道壓(UPP)、等容膀胱壓檢測(cè) 造模8周后，經(jīng)頸靜脈插管注射烏拉坦麻醉;腹部正中切口，清理降結(jié)腸內(nèi)污物，于降結(jié)腸近心端行松解結(jié)扎術(shù);切斷雙側(cè)輸尿管，使輸尿管遠(yuǎn)端表面化。于膀胱頂部插入膀胱導(dǎo)尿管和雙腔尿道導(dǎo)管(后者包括尿道內(nèi)的PE-50管子用于UPP測(cè)定，PE-160管子用于注入生理鹽水)，用于導(dǎo)管尖端的錐形塞子被置于膀胱頸。逐層關(guān)閉腹腔。使用生理鹽水通過(guò)尿道導(dǎo)管的外腔，以0.075 mL/min的速度注入尿道，通過(guò)尿道導(dǎo)管的內(nèi)腔記錄UPP。逐漸注入生理鹽水，直至誘導(dǎo)出等容膀胱節(jié)律收縮并記錄。于恥骨聯(lián)合高度放置壓力傳感器，使用POWERLAB進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。在穩(wěn)定的膀胱基礎(chǔ)活性的條件下(≥30 min)，對(duì)UPP基線值、UPP最低值及誘發(fā)尿道舒張的膀胱壓閾值進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 大鼠尿道組織NGF、p75NTR mRNA檢測(cè) UPP及等容膀胱壓檢測(cè)后，斷頸處死大鼠，完整切取尿道組織，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)尿道組織NGF、p75NTR mRNA表達(dá)。以常規(guī)TRIzol 法提取尿道總RNA，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)260 nm處測(cè)量所提取RNA濃度。兩步法試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，條件為42 ℃ 50 min、85 ℃ 10 min。所用引物由北京奧科生物技術(shù)公司負(fù)責(zé)合成。NGF上游引物5′-AACAGGACTCACAGGAGCAA-3′，下游引物5′-CTTCCTGCTGAGCACACACA-3′；p75NTR上游引物5′-GAGGGCACATACTCAGACGAAGCG-3′，下游引物5′-GTCTATATGTTCAGGCTGGTAACC-3′。

1.5 大鼠尿道組織NGF、p75NTR蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。取大鼠尿道組織，常規(guī)提取總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度；蛋白變性后SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜；5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入相應(yīng)的一抗(1∶500)封閉過(guò)夜；TBST洗膜3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶4 000羊抗鼠多抗)，室溫孵育2 h；常規(guī)洗膜3次，化學(xué)發(fā)光法顯像；用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析免疫印跡條帶進(jìn)行光密度測(cè)定，以目的蛋白與Actin光密度比值表示蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組UPP及誘發(fā)尿道舒張的膀胱壓閾值比較 糖尿病組UPP最低值及誘發(fā)尿道舒張的膀胱壓閾值均高于對(duì)照組(P<0.01)。兩組UPP基線值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 兩組UPP及誘發(fā)尿道舒張的膀胱壓閾值比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01。

2.2 各組尿道組織NGF、p75NTR mRNA及蛋白表達(dá)比較 糖尿病組尿道組織NGF、p75NTR mRNA及蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組(P均<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組尿道組織NGF、p75NTR mRNA及蛋白表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01。

3 討論

糖尿病是臨床常見(jiàn)的內(nèi)分泌疾病，其對(duì)膀胱、尿道功能的損傷受到越來(lái)越多的關(guān)注。目前對(duì)NVUDD的研究主要集中在膀胱本身的病變，對(duì)尿道病變的研究很少。對(duì)于由糖尿病引發(fā)的下尿路功能障礙，單純的糖尿病膀胱病變不能完全或很好地解釋。近年研究發(fā)現(xiàn)，尿道結(jié)構(gòu)和功能異常在NVUDD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]。Ueda等[8]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病可誘發(fā)多種神經(jīng)病變，包括影響感覺(jué)神經(jīng)和自主神經(jīng)。因此，我們推測(cè)糖尿病誘導(dǎo)的多神經(jīng)病變也可能影響尿道的舒張功能。

尿道肌肉包括尿道平滑肌和尿道橫紋肌。正常儲(chǔ)尿和排尿過(guò)程需要膀胱和尿道平滑肌及尿道外括約肌中的橫紋肌之間精確協(xié)調(diào)，儲(chǔ)尿期尿道處于收縮狀態(tài)，抑制尿液排出，而排尿期尿道處于舒張狀態(tài)，促進(jìn)尿液排出。尿道平滑肌是由交感、副交感神經(jīng)支配，而尿道外括約肌由軀體神經(jīng)支配，尿道橫紋肌主要是由軀體神經(jīng)(陰部神經(jīng))支配。膀胱和尿道的神經(jīng)、肌肉相互協(xié)調(diào)配合，完成正常的儲(chǔ)尿和排尿生理。若神經(jīng)支配方面受到損害，勢(shì)必導(dǎo)致尿道收縮或舒張功能受損。在糖尿病的情況下，尿道的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生病變，進(jìn)而導(dǎo)致NVUDD的發(fā)生和發(fā)展。有研究證實(shí)，糖尿病大鼠尿道的全層厚度、肌層厚度及結(jié)締組織區(qū)域與肌肉區(qū)域的比值均顯著大于正常大鼠[9]，說(shuō)明糖尿病大鼠尿道可能發(fā)生了肌肉萎縮以及纖維化。雖然其具體機(jī)制尚不明確，但推測(cè)糖尿病尿道形態(tài)學(xué)改變與長(zhǎng)期的慢性炎癥密切相關(guān)。Yang等[10]通過(guò)檢測(cè)糖尿病大鼠膀胱等容測(cè)壓、尿道灌注壓以及尿道外括約肌肌電圖，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠膀胱逼尿肌與尿道括約肌協(xié)同障礙，且尿道括約肌舒張減弱、對(duì)NO反應(yīng)減弱、對(duì)α受體激動(dòng)劑反應(yīng)增強(qiáng)，這些改變使尿道阻力增加，從而造成排尿障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病組UPP最低點(diǎn)及誘發(fā)尿道舒張的膀胱壓閾值均高于對(duì)照組，提示糖尿病大鼠膀胱收縮時(shí)尿道肌肉舒張功能發(fā)生異常。

NGF是一種多肽物質(zhì)，其作用有以下幾方面：①維持交感神經(jīng)和感覺(jué)神經(jīng)的生長(zhǎng)發(fā)育及功能；②誘導(dǎo)軸突發(fā)芽、決定軸突的伸長(zhǎng)時(shí)間，并可穩(wěn)定神經(jīng)結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)微絲蛋白的合成；③促進(jìn)細(xì)胞分化及創(chuàng)傷愈合；④對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡有抑制作用[11]。高血糖狀態(tài)下，NGF的表達(dá)降低，促進(jìn)了糖尿病膀胱尿道病變進(jìn)程[12]。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病同樣損傷尿道的去神經(jīng)化，直接損傷尿道括約肌及平滑肌[13]，提示在糖尿病尿道病變過(guò)程中同樣可能涉及到NGF作用障礙。p75NTR是NGF的低親和力受體，屬腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員，其通過(guò)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)以神經(jīng)細(xì)胞為主的細(xì)胞增殖、遷移、分化、生存、凋亡、突觸的建立和神經(jīng)的形成，發(fā)揮多重生物學(xué)效應(yīng)。p75NTR在神經(jīng)細(xì)胞的早期發(fā)育過(guò)程中與NGF結(jié)合，介導(dǎo)了神經(jīng)細(xì)胞的存活[14]。p75NTR主要在尿道的感覺(jué)神經(jīng)纖維中表達(dá)，NGF和p75NTR的結(jié)合可誘導(dǎo)神經(jīng)末梢向神經(jīng)細(xì)胞傳到神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)信號(hào)，對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞的存活至關(guān)重要[15]。如果NGF和p75NTR的表達(dá)下調(diào)，這種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)就會(huì)顯著的降低，進(jìn)而引起神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病組尿道組織NGF、p75NTR mRNA及蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組，提示糖尿病大鼠尿道組織中NGF和p75NTR mRNA及蛋白表達(dá)顯著下降，表明高血糖導(dǎo)致了尿道神經(jīng)細(xì)胞中NGF產(chǎn)生的減少和p75NTR表達(dá)的下降。

綜上所述，糖尿病引起的尿道舒張功能障礙是NVUDD的重要組成部分，在大鼠尿道組織中NGF和p75NTR的mRNA及蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，從而導(dǎo)致神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)的錯(cuò)亂，神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。這種尿道去神經(jīng)化是糖尿病尿道功能障礙的重要原因。

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