白鈺，劉應(yīng)生，馬曉麗(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，烏魯木齊830000；新疆醫(yī)科大學(xué))

糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌疾病，主要是指胰島素分泌或作用存在缺陷而引起的以慢性(長期)高血糖為主要特征的代謝異常綜合征，常見于中老年人[1,2]。糖尿病可引起多種慢性并發(fā)癥，可涉及肝、腎、肺、骨骼肌、神經(jīng)系統(tǒng)、視網(wǎng)膜、血管及皮膚等組織器官，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[3,4]。糖尿病肝臟病變相對輕微、隱匿，臨床上常常會忽視，但其卻是引起慢性肝病和肝臟酶譜異常的主要原因，且缺乏有效的治療手段。因而，尋找新的治療策略對于提高糖尿病肝臟損傷的防治水平至關(guān)重要[5,6]。雷公藤多苷是從雷公藤系衛(wèi)矛科植物中提取的活性成分，具有良好的抗炎和免疫抑制作用，能延緩糖尿病腎病進(jìn)展，但其對糖尿病肝病的效果仍需作進(jìn)一步的深入研究[7,8]。2017年1月～10月，我們對糖尿病大鼠模型給予雷公藤多苷進(jìn)行干預(yù)，探討雷公藤多苷對糖尿病大鼠肝損傷的影響及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選取SPF級健康、雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量170～210 g，購于新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物研究中心。采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選取12只大鼠作為對照組，其余48只建立糖尿病大鼠模型，成模大鼠隨機(jī)分為模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組12只。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型建立 參照文獻(xiàn)[9]中的方法將模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠制備糖尿病模型，具體方法如下：大鼠均腹腔注射含65 mg/kg鏈尿佐菌素(STZ)的檸檬酸鈉緩沖液，注射3 d后采尾部靜脈血測血糖，當(dāng)血糖濃度達(dá)到16.7～22.2 mmol/L即為造模成功。對照組大鼠注射等體積的檸檬酸鈉緩沖液。兩組大鼠飼養(yǎng)條件完全相同，每日觀察各組大鼠的一般情況，并記錄各組大鼠的體質(zhì)量和血糖水平。

1.2.2 干預(yù)方法 造模成功后，低劑量組、中劑量組和高劑量組分別給予1、3、6 mg/(kg·d)雷公藤多苷灌胃，對照組和模型組給予同等體積的蒸餾水進(jìn)行灌胃。連續(xù)給藥8周，干預(yù)期間不給予任何降糖治療。

1.2.3 血清NF-κB和TNF-α水平檢測 采用ELISA法。干預(yù) 8周后取動脈血，以3 500 r/min離心10 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清NF-κB和TNF-α水平。各檢測試劑盒均購自北京中杉金橋生物有限公司，具體檢測步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 肝組織形態(tài)觀察 各組大鼠取血后處死，取出肝臟，以冰PBS反復(fù)灌注沖洗后用濾紙吸去多余水分。取部分肝組織以10%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后做連續(xù)切片；行HE和Masson染色，顯微鏡下大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.5 肝組織Toll樣受體4(TLR4)、NF-κB mRNA表達(dá)檢測 采用RT-PCR法。取部分肝組織，采用RNA提取試劑盒提取總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為DNA，在聚合酶的作用下進(jìn)行擴(kuò)增。RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及RT-PCR試劑盒均購自美國Thermo公司。TLR4上游引物5′-GTTCATCTGCTTTCTGCTG-3′，下游引物5′-TGATTCTGCCTGATGTTGC-3′；NF-κB上游引物5′-AAAAACG-CATCCCAAGGTGC-3′，下游引物5′-AAGCTCAAGCCACCATACCC-3′。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，72 ℃ 330 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。電泳后得到目的條帶的光密度值，然后與對照組的光密度值進(jìn)行比較，最終得出TLR4、NF-κB mRNA的表達(dá)水平，具體檢測步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。以目標(biāo)mRNA灰度值/β-actin灰度值表示。

1.2.6 肝組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。取大鼠肝組織制備蛋白樣，并取約75 μg以10%十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。TLR4小鼠單克隆抗體、NF-κB p65兔多克隆抗體均購自英國Abcam公司。電泳分離后轉(zhuǎn)移至孔徑為0.45 μm的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，置于5%脫脂奶粉中封閉2 h；加入一抗(TLR4、NF-κB)后4 ℃孵育過夜，以0.5%TBS-T溶液洗膜3次后再加入HRP標(biāo)記的二抗進(jìn)行反應(yīng);以0.5%TBS-T溶液洗膜3次用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色，并采用軟件進(jìn)行灰度值分析，計算各目標(biāo)蛋白與β-actin的灰度比值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝臟形態(tài)觀察 HE染色顯示,對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列規(guī)則，肝細(xì)胞繞中央靜脈呈放射狀排列，細(xì)胞大小均勻，胞核呈圓形；模型組肝小葉結(jié)構(gòu)消失，肝細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞腫脹呈彌漫性大泡樣脂肪變性；低劑量組、中劑量和高劑量組肝損傷較模型組有不同程度減輕，其中高劑量組改善最為明顯。見圖1。Masson染色顯示，與對照組比較，模型組肝組織可見大量粗大藍(lán)色膠原纖維，而低劑量組、中劑量和高劑量組藍(lán)色膠原纖維均有所減少，其中高劑量組僅見少量藍(lán)色纖維。見圖2。

注：A為對照組；B為模型組；C為低劑量組；D為中劑量組；E為高劑量組。圖1 各組肝組織形態(tài)表現(xiàn)(HE染色，×40)

注：A為對照組；B為模型組；C為低劑量組；D為中劑量組；E為高劑量組。圖2 各組肝組織形態(tài)表現(xiàn)(Masson染色，×40)

2.2 各組血清NF-κB、TNF-α水平比較 模型組血清NF-κB和TNF-α水平均高于對照組(P均<0.05)。低劑量組、中劑量組和高劑量組血清NF-κB和TNF-α水平均低于模型組(P均<0.05)。中劑量組和高劑量組血清NF-κB和TNF-α水平均低于低劑量組，高劑量組血清NF-κB和TNF-α水平均低于中劑量組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組血清NF-κB及TNF-α水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與低劑量組比較，﹟P<0.05；與中劑量組比較，▲P<0.05。

2.3 各組肝組織TLR-4、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)比較 模型組TLR-4、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)均高于對照組(P均<0.05)。低劑量組、中劑量組和高劑量組TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)均低于模型組(P均<0.05)。中劑量組和高劑量組TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)均低于低劑量組，高劑量組TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)均低于中劑量組(P均<0.05)。見表2、圖3。

3 討論

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，主要是由于胰島素分泌缺陷或其生物作用受損，或兩者兼有引起，其發(fā)病率較高，現(xiàn)已成為危害人類健康的主要疾病之一[10]。糖尿病可引起多種慢性疾病的發(fā)生，其不但可引起腎臟、心臟、視網(wǎng)膜、神經(jīng)等組織器官的損害，亦可導(dǎo)致各種類型的肝臟損傷[11]。研究表明，糖尿病患者可發(fā)生非特異性肝酶學(xué)異常，其微血管病變及微循環(huán)障礙可累及機(jī)體各臟器缺血缺氧，而缺血可引起肝細(xì)胞內(nèi)二氧化碳蓄積、酸中毒、氧供減少、氧消耗增加，使肝臟轉(zhuǎn)氨酶活性增加，膽紅素代謝紊亂，重者可引起肝細(xì)胞壞死，尤其是當(dāng)合并糖尿病酮癥酸中毒時更易發(fā)生肝臟損害[12]。糖尿病與脂肪肝的關(guān)系也較為密切，在引起脂肪肝的所有病因中，糖尿病占第三位，僅次于肥胖與飲酒。另外，糖尿病患者易患病毒性肝炎，其患病率約為正常人的2～4倍，其原因可能是糖尿病患者對病毒的易感性增強(qiáng)，但目前對于糖尿病性肝臟損傷的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚，現(xiàn)有治療手段的效果也不甚理想。中藥雷公藤多苷是近些年研究的熱點之一，是一種新型的免疫抑制劑，主要是從雷公藤中提取分離而得。其具有較高的抗炎和免疫抑制活性，現(xiàn)已開始應(yīng)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的臨床治療[13]。也有研究表明，雷公藤多苷對于延緩糖尿病腎病的發(fā)展有一定的作用[14]。但對于其是否能治療糖尿病肝臟損傷，仍需作進(jìn)一步的研究。

表2 各組大鼠肝組織TLR-4、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與低劑量組比較，﹟P<0.05；與中劑量組比較，▲P<0.05。

注：A為對照組；B為模型組；C為低劑量組；D為中劑量組；E為高劑量組。

圖3各組肝組織TLR-4、NF-κB蛋白表達(dá)情況(Westernblotting法)

糖尿病性肝損傷絕大部分表現(xiàn)為肝臟脂肪浸潤導(dǎo)致的非酒精性脂肪性肝病，這也是導(dǎo)致各種慢性肝病和肝臟酶譜異常的主要原因之一。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組肝小葉結(jié)構(gòu)消失，肝細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞腫脹呈彌漫性大泡樣脂肪變性，提示糖尿病大鼠肝臟發(fā)生了一定程度的病理性改變。低劑量組、中劑量和高劑量組肝損傷有不同程度減輕，其中高劑量組改善最為明顯；提示雷公藤多苷對于糖尿病大鼠的肝臟損傷有一定的改善作用，且隨著雷公藤多苷的劑量增加，改善效果更加明顯。

TLR4是TLRs的亞型之一，在肝實質(zhì)細(xì)胞和非實質(zhì)細(xì)胞均廣泛表達(dá)，而TLR4信號通路是多種刺激因子的共同通路，可有效調(diào)控肝臟免疫、炎癥反應(yīng)等相關(guān)基因的表達(dá)。NF-κB是TLR4信號通路中最關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在免疫和炎癥反應(yīng)過程起著重要的作用。研究表明，NF-κB的激活可啟動或增強(qiáng)多種與炎癥、免疫相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄、翻譯，進(jìn)而導(dǎo)致炎性介質(zhì)大量釋放，并能引起粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等殺傷細(xì)胞的趨化和聚集，炎性細(xì)胞浸潤，與肝臟損傷有著密切的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組TLR-4、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)均高于對照組，提示TLR-4、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)可能與肝臟損傷有著密切的關(guān)系；而高劑量組TLR-4、NF-κB mRNA和蛋白相對表達(dá)量較模型組、低劑量組和中劑量組降低，提示雷公藤多苷可有效抑制TLR-4、NF-κB mRNA和蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制TLR4/NF-κB信號通道的介導(dǎo)作用，且隨著劑量的加大，抑制作用更加明顯，而這可能是雷公藤多苷能改善糖尿病患者肝損傷的機(jī)制之一。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)， 模型組血清NF-κB和TNF-α水平均高于對照組，提示大鼠血清 NF-κB和TNF-α水平可能與肝臟損傷有著密切的關(guān)系；而低劑量組、中劑量組和高劑量組血清NF-κB和TNF-α水平均低于模型組，且高劑量組血清NF-κB和TNF-α水平均低于中劑量組及低劑量組，提示雷公藤多苷可有效抑制各種炎癥因子的表達(dá)水平，進(jìn)而改善肝損傷程度，且隨著劑量的加大，抑制效果更為明顯，其機(jī)制可能與雷公藤多苷能抑制TLR-4信號通道的介導(dǎo)有關(guān)。

綜上所述，雷公藤多苷可減輕糖尿病大鼠的肝臟損傷，其機(jī)制可能與抑制TLR-4/NF-κB介導(dǎo)的炎癥信號通路有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。

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