李一卉，孫璐，戴程婷，袁慶新(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南京210029)

糖尿病是一類由遺傳、環(huán)境、免疫功能紊亂等因素誘發(fā)的嚴(yán)重危害健康的慢性疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確[1]。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激(OS)在糖尿病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用[2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是所有分泌型蛋白和膜蛋白折疊、成熟、儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)的場所。近年研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)與糖尿病胰島β細(xì)胞功能減退和胰島素抵抗密切相關(guān)，OS與ERS的相互作用將會(huì)加重胰島β細(xì)胞的損傷[3～5]。胰島素原是胰島素的前體物質(zhì)，可裂解為一分子胰島素和一分子C肽[6]。胰島素原能否在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中正確折疊、進(jìn)而成熟為構(gòu)象未成熟胰島素原復(fù)合物(CIPC)，對(duì)于胰島素的合成及釋放起重要作用。2016年2月～2017年2月，我們觀察了抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)對(duì)OS所致胰島素原成熟及胰島β細(xì)胞分泌胰島素功能的影響，探討減輕OS對(duì)改善胰島β細(xì)胞功能的作用及機(jī)制，為預(yù)防糖尿病的發(fā)生和發(fā)展提供新方向。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與材料 小鼠胰島細(xì)胞系MIN6細(xì)胞來源于南京醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)系德偉教授實(shí)驗(yàn)室。高糖DMEM完全培養(yǎng)基(含有15 %胎牛血清、50 μmol/L β-巰基乙醇、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)、胎牛血清、雙抗(Gibco公司，美國)；β-巰基乙醇、臺(tái)盼藍(lán)、過氧化氫(H2O2，Sigma公司，美國)；2′7′-二氯熒光素-乙酰乙酸酯(H2DCFDA，Invitrogen公司，美國)；胰島素原單克隆抗體、胰島素多克隆抗體、管蛋白(Tubulin)多克隆抗體(Abcam公司，英國)；胰島素放免試劑盒(北京北方生物科技研究所，中國)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) MIN6細(xì)胞在高糖DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，每天換液。待細(xì)胞密度達(dá)75%以上時(shí)，按1∶2傳代。

1.3 H2O2最佳干預(yù)劑量的確定 培養(yǎng)MIN6細(xì)胞，生長到對(duì)數(shù)生長期時(shí)，胰酶消化，PBS清洗；終止消化后，加培養(yǎng)基吹勻，然后取等量細(xì)胞液種植在6孔板中；待細(xì)胞密度達(dá)75%左右時(shí)，選取不同濃度(0、11 nmol/L、22 nmol/L、44 nmol/L、88 nmol/L及10 μmol/L)H2O2加入培養(yǎng)基，測(cè)定不同H2O2濃度時(shí)細(xì)胞死亡率及蛋白中CIPC含量；發(fā)現(xiàn)當(dāng)H2O2濃度為10 μmol/L時(shí)，CIPC含量明顯增加，且細(xì)胞保持較低的死亡率，從而確定10 μmol/L H2O2作為OS干預(yù)的最佳劑量。

1.4 細(xì)胞分組及干預(yù)方法 分為對(duì)照組、H2O2處理組、H2O2+NAC處理組。對(duì)照組在培養(yǎng)基中不加入H2O2及NAC處理；H2O2處理組在培養(yǎng)基中加入10 μmol/L H2O2處理；H2O2+NAC處理組培養(yǎng)基中加入10 μmol/L H2O2刺激4 h后，再加入250 μmol/L NAC處理。各組細(xì)胞再次放入37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h。

1.5 細(xì)胞死亡率檢測(cè) 采用臺(tái)盼藍(lán)染色法。各組細(xì)胞放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h。向各組培養(yǎng)皿中加入臺(tái)盼藍(lán)試劑，于顯微鏡下觀察細(xì)胞生存狀態(tài)、形態(tài)；并對(duì)死亡及生存細(xì)胞進(jìn)行手動(dòng)計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞死亡率。

1.6 細(xì)胞中活性氧簇(ROS)表達(dá)水平檢測(cè) 采用H2DCFDA熒光探針法。取各組細(xì)胞，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞；用PBS洗滌后，加入H2DCFDA，放在37 ℃孵育30 min。PBS洗滌3次，熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)代表ROS表達(dá)水平越高。

1.7 MIN6細(xì)胞胰島素原、CIPC蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。取各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白；運(yùn)用非還原Tris-tricine-urea-SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳[7]，采用Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中胰島素原、CIPC蛋白表達(dá)。以Tubulin作為內(nèi)參。計(jì)算胰島素原/CIPC比例。

1.8 細(xì)胞上清胰島素相對(duì)含量檢測(cè) 采用放免法(RIA)。取各組細(xì)胞上清，4 ℃ 700 r/min離心10 min，取離心后上清150 μL。采用RIA法檢測(cè)胰島素，所用儀器型號(hào)為DFM-96型16管手動(dòng)放射免疫γ計(jì)數(shù)器，計(jì)算各組細(xì)胞上清胰島素相對(duì)含量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞死亡率比較 H2O2處理組細(xì)胞死亡率高于對(duì)照組，H2O2+NAC處理組細(xì)胞死亡率低于H2O2處理組(P均<0.05)。見表1。

2.2 各組細(xì)胞ROS表達(dá)水平比較 H2O2處理組細(xì)胞ROS表達(dá)水平高于對(duì)照組，H2O2+NAC處理組細(xì)胞ROS表達(dá)水平低于H2O2處理組(P均<0.05)。見表1。

2.3 各組細(xì)胞胰島素原/CIPC比較 H2O2處理組細(xì)胞胰島素原/CIPC低于對(duì)照組，H2O2+NAC處理組細(xì)胞胰島素原/CIPC高于H2O2處理組(P均<0.05)。見表1、圖1。

圖1 各組細(xì)胞胰島素原、CIPC表達(dá)情況(Western blotting法)

2.4 各組細(xì)胞上清胰島素相對(duì)含量比較 H2O2處理組細(xì)胞上清胰島素相對(duì)含量低于對(duì)照組，H2O2+NAC處理組細(xì)胞上清胰島素相對(duì)含量高于H2O2處理組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞檢測(cè)指標(biāo)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與H2O2處理組比較，△P<0.05。

3 討論

糖尿病臨床診斷明確時(shí)，胰島β細(xì)胞的功能已經(jīng)損傷明顯。如何在糖尿病早期進(jìn)行有效的干預(yù)，是保護(hù)胰島β細(xì)胞功能、延緩和預(yù)防胰島β細(xì)胞凋亡的重要方法。胰島素的正確合成是維持血胰島素水平的基礎(chǔ)，首先是編碼胰島素的基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯，形成前胰島素原；然后前胰島素原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)剪切信號(hào)肽，形成胰島素原；胰島素原再移位到高爾基體，剪切成胰島素和C肽儲(chǔ)存在細(xì)胞質(zhì)的囊泡中，最后釋放入血[8,9]。近來有學(xué)者認(rèn)為，胰島素原向胰島素的轉(zhuǎn)換異常，即正確折疊的胰島素原減少、CIPC大量堆積，是糖尿病發(fā)生的重要原因[10]。

胰島β細(xì)胞具有高度發(fā)達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，這與其需要合成和分泌大量的胰島素及多種糖蛋白相適應(yīng)，也容易受到各種應(yīng)激的損傷。其中，OS作為糖尿病發(fā)生、發(fā)展的重要原因，已被廣大學(xué)者認(rèn)可[2]。由于體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，從而導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤、蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物，這是ROS在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用[11]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化環(huán)境對(duì)于蛋白質(zhì)的合成及分泌亦至關(guān)重要[12]，它參與二硫鍵的形成、蛋白質(zhì)的折疊和裝配、糖基化、聚糖作用，還是Ca2+貯存的重要場所[6]，分泌蛋白的正確折疊對(duì)是維持其功能正常的首要條件。未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白不能正常分泌，在細(xì)胞堆積時(shí)，即通過泛素/蛋白酶體系統(tǒng)、溶酶體系統(tǒng)或通過自噬的方式被降解、清除。胰島素原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行合成的過程中，若發(fā)生錯(cuò)誤折疊，可導(dǎo)致CIPC的產(chǎn)生。一方面，CIPC不能進(jìn)行下一步剪切，從而使胰島素合成減少，引起血糖升高。另一方面，胰島素原因轉(zhuǎn)換為CIPC無法輸出而堆積，不僅會(huì)引起ERS，還可能使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的Ca2+滲出；細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度的升高刺激線粒體產(chǎn)生更多的活性ROS，誘發(fā)或加重OS[6]，OS與ERS的相互作用、惡性循環(huán)可能加重β細(xì)胞的損傷[5]。所以，蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和ROS的產(chǎn)生是緊密相關(guān)的事件，但聯(lián)系二者的機(jī)制尚不明確。胰島素原錯(cuò)誤折疊及成熟障礙很可能是OS及ERS引起糖尿病發(fā)生、發(fā)展的重要原因[13,14]。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2處理組與對(duì)照組相比，細(xì)胞死亡率升高、ROS表達(dá)水平升高、胰島素原/CIPC降低、上清胰島素含量相對(duì)減少。這表明OS加重了胰島素原的錯(cuò)誤折疊并堆積，并可導(dǎo)致胰島β細(xì)胞出現(xiàn)OS損傷、死亡及胰島素分泌功能障礙。因此，如何減輕OS損傷，從而減少胰島素原的錯(cuò)誤折疊、促進(jìn)胰島素原的成熟，可能是保護(hù)胰島β細(xì)胞功能、預(yù)防糖尿病進(jìn)展的有效方法。

研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑可以減輕糖尿病癥狀及血糖水平[15,16]。NAC是含巰基的抗氧化劑，是體內(nèi)合成谷胱甘肽的原料，能清除體內(nèi)的ROS，保護(hù)許多蛋白質(zhì)和酶等分子中的巰基不被氧化，但其降糖機(jī)制尚不明確。本研究顯示，H2O2+NAC處理組較H2O2處理組細(xì)胞死亡率降低、ROS表達(dá)水平降低、胰島素原/CIPC升高、上清胰島素相對(duì)含量增加。這提示NAC可以改善H2O2導(dǎo)致的胰島β細(xì)胞損傷，還可以改善OS引起的胰島素原成熟障礙及胰島素的釋放異常，有效地保護(hù)胰島β細(xì)胞功能。

綜上所述，NAC可以改善H2O2導(dǎo)致的胰島β細(xì)胞損傷，改善OS引起的胰島素原成熟障礙及胰島素的釋放異常，有效保護(hù)胰島β細(xì)胞功能。因此，胰島素原成熟障礙、降解增多及相關(guān)的ERS和OS可能是糖尿病早期干預(yù)的重要靶點(diǎn)。但是，ERS是泛在的保護(hù)機(jī)制，ERS和OS關(guān)系究竟如何，以及抗氧化劑改變OS的具體機(jī)制尚待深入研究。

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