丁艷潔，李思源，李軍，常子濤，張震，吳媛媛(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子8300；石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院)

糖尿病是以高血糖為特征的代謝性疾病。研究表明，無論1型還是2型糖尿病的發(fā)病都與胰島素(INS)分泌異常有關(guān)[1,2]。因此，關(guān)于INS分泌的作用機(jī)制及其影響因素已成為近年來國內(nèi)外研究的熱門方向。胰高血糖素(Gn)和INS之間存在著拮抗作用：當(dāng)血糖濃度過低時(shí)，Gn分泌增多，使血糖含量升高；當(dāng)血糖濃度過高時(shí)，INS分泌增多，使血糖含量降低。本課題組前期研究表明，Gn在不同濃度葡萄糖環(huán)境下，均可促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌INS[3～5]，但其具體機(jī)制尚不明確。環(huán)磷酸腺苷(cAMP)是一種由三磷酸腺苷(ATP)脫掉兩個(gè)磷酸羧合而成的環(huán)狀核苷酸，當(dāng)血糖升高時(shí)，Gn可以刺激ATP環(huán)化為cAMP，從而增加其濃度。2016年10月～2017年1月，我們對胰島β細(xì)胞系MIN6細(xì)胞在不同濃度葡萄糖環(huán)境下進(jìn)行Gn干預(yù)，觀察對INS及cAMP含量的影響，探討Gn影響INS分泌的機(jī)制，為糖尿病治療藥物的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與材料 胰島β細(xì)胞系MIN6細(xì)胞。主要試劑有cAMP信號(hào)通路刺激劑鹽酸異丙腎上腺素(ISO)、0.25%含EDTA-胰蛋白酶液、小鼠INS-ELISA試劑盒、cAMP-ELISA試劑盒等。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用含15%胎牛血清(FBS)、4.5 g/L葡萄糖、2%青鏈霉素、1%L-谷氨酰胺及1%β-巰基乙醇的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代至4～15代用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 不同濃度Gn對MIN6細(xì)胞分泌INS及cAMP影響的觀察

1.3.1 分組及干預(yù)方法 取對數(shù)生長期的MIN6細(xì)胞，以4×105/孔的密度接種于6孔板中，分為正常對照1組、低糖1組、高糖1組，分別在葡萄糖終濃度為0、2.8、16.7 mmol/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每組均給予0、500、1 000 ng/L的Gn干預(yù)1 h。

1.3.2 細(xì)胞上清液INS含量檢測 采用ELISA法。各組細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，換2%FBS的培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)12 h后，Krebs液沖洗3遍，之后每孔分別加不同刺激的處理液，正常對照組的0 ng/L水平加入Kerbs液，37 ℃孵育1 h；吸取每孔上清液分裝，用INS-ELISA試劑盒檢測INS含量。

1.3.3 細(xì)胞上清液cAMP含量檢測 采用ELISA法。各組細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基饑餓處理12 h，之后每孔分別加入不同刺激液1 mL處理，正常對照組的0 ng/L水平加入同體積Kerbs液，37 ℃培養(yǎng)箱孵育7 min。吸除刺激液，每孔加0.1 mmol/L的HCl 1 mL，室溫孵育20 min；收集上清液，用cAMP-ELISA試劑盒檢測cAMP含量。

1.4 加入ISO后不同濃度Gn對MIN6細(xì)胞分泌INS及cAMP影響的觀察

1.4.1 分組及干預(yù)方法 取對數(shù)生長期的MIN6細(xì)胞，以4×105/孔的密度傳代于6孔板中，分為正常對照2組、低糖2組、高糖2組，分別在葡萄糖終濃度為0、2.8、16.7 mmol/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并均加入500 μL ISO，37 ℃孵育10 min，然后每組均給予0、500、1 000 ng/L的Gn干預(yù)1 h。

1.4.2 細(xì)胞上清液INS及cAMP含量檢測 同1.3.2、1.3.3。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度Gn對MIN6細(xì)胞分泌INS及cAMP的影響

2.1.1 細(xì)胞上清液INS含量比較 正常對照1組、低糖1組、高糖1組中，1 000 ng/L Gn干預(yù)后INS含量高于500、0 ng/L時(shí)，500 ng/L Gn干預(yù)后INS含量均高于0 ng/L時(shí)(P均<0.05)。見表1。

2.1.2 各組細(xì)胞上清液cAMP含量比較 正常對照1組中，1 000 ng/L Gn干預(yù)后cAMP含量高于0 ng/L時(shí)，500 ng/L Gn干預(yù)后cAMP含量高于0 ng/L時(shí)(P均<0.05)。低糖1組、高糖1組中，1 000 ng/L Gn干預(yù)后cAMP含量均高于500、0 ng/L時(shí)，500 ng/L Gn干預(yù)后cAMP含量均高于0 ng/L時(shí)(P均<0.05)。見表2。

2.2 加入ISO后不同濃度Gn對MIN6細(xì)胞分泌INS的影響

2.2.1 細(xì)胞上清液INS含量比較 正常對照2組、低糖2組、高糖2組中，1 000 ng/L Gn干預(yù)后INS含量均高于500、0 ng/L時(shí)，500 ng/L Gn干預(yù)后INS含量均高于0 ng/L時(shí)(P均<0.05)。見表1。

表1 不同濃度Gn條件下各組細(xì)胞上清液INS分泌量比較

注：與同組0 ng/L比較，*P<0.05；與同組500 ng/L比較，﹟P<0.05。

2.2.2 各組細(xì)胞上清液cAMP含量比較 正常對照2組、低糖2組、高糖2組中，1 000 ng/L Gn干預(yù)后cAMP含量均高于500、0 ng/L時(shí)，500 ng/L Gn干預(yù)后cAMP含量均高于0 ng/L時(shí)(P均<0.05)。見表2。

表2 不同濃度Gn條件下各組細(xì)胞上清液cAMP含量比較

注：與同組0 ng/L比較，*P<0.05；與同組500 ng/L比較，﹟P<0.05。

2.3 細(xì)胞上清液cAMP與INS含量的相關(guān)性 在未添加ISO時(shí)，細(xì)胞上清液cAMP與INS含量呈正相關(guān)(r=0.897 2，r2=0.804 9，P<0.05)；在添加ISO后，細(xì)胞上清液cAMP與INS含量也呈正相關(guān)(r=0.894 7，r2=0.800 5，P<0.05)。見圖1、2。

3 討論

糖尿病是一種由于INS分泌不足和(或)INS抵抗而引起的代謝性疾病，除INS分泌絕對不足的1型糖尿病外，2型糖尿病患者亦表現(xiàn)為胰島β細(xì)胞INS分泌功能的缺陷。β細(xì)胞的INS分泌過程受到各種供能物質(zhì)及激素、多肽和神經(jīng)遞質(zhì)類等多種因素的調(diào)控[6]，其中如Gn、Gn樣肽等激素，不直接引起INS分泌，但可通過作用于胰島β細(xì)胞，增加或減少細(xì)胞內(nèi)第二信使信號(hào)系統(tǒng)的某些第二信使的濃度，發(fā)揮調(diào)節(jié)INS分泌的作用[7]。以往的研究大都針對如何減少Gn，而Gn對胰島β細(xì)胞INS分泌功能的影響則研究較少。

圖1 未添加ISO時(shí)細(xì)胞上清液中cAMP與INS含量相關(guān)性散點(diǎn)圖

圖2 添加ISO后細(xì)胞上清液中cAMP與INS含量相關(guān)性散點(diǎn)圖

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Gn對INS分泌有促進(jìn)作用[8]。Gn可能通過旁分泌作用直接到達(dá)臨近的β細(xì)胞，對INS分泌產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用；也可能通過先與細(xì)胞膜上的Gn受體結(jié)合，引起腺苷酸環(huán)化酶活化，從而使ATP環(huán)化為cAMP，再通過cAMP-PKA第二信使信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)[9,10]。因此，第二信使信號(hào)分子cAMP可能是Gn參與調(diào)控INS分泌的橋梁[11,12]，但其影響作用的機(jī)制和具體環(huán)節(jié)尚不十分清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，正常對照1組、低糖1組、高糖1組中，1 000 ng/L Gn干預(yù)后INS的分泌量高于500、0 ng/L時(shí)，500 ng/L Gn干預(yù)后INS的分泌量均高于0 ng/L時(shí)；提示Gn干預(yù)可促進(jìn)不同葡萄糖水平的細(xì)胞上清液INS含量升高[13]，且Gn濃度較高時(shí)對INS含量的促進(jìn)作用更明顯；正常對照1組、低糖1組、高糖1組中，1 000 ng/L Gn干預(yù)后cAMP含量均高于500、0 ng/L時(shí)，500 ng/L Gn干預(yù)后cAMP含量均高于0 ng/L時(shí)，提示Gn干預(yù)可使不同葡萄糖水平的細(xì)胞上清液cAMP含量升高，且Gn濃度較高時(shí)對cAMP含量的促進(jìn)作用更明顯。cAMP含量與INS分泌量呈正相關(guān)關(guān)系，提示Gn干預(yù)可使不同葡萄糖水平的細(xì)胞上清液INS含量升高的機(jī)制可能與cAMP有關(guān)。

本研究進(jìn)一步通過添加cAMP刺激劑ISO，測定Gn對第二信使信號(hào)通路cAMP產(chǎn)生的影響以及對INS分泌的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，正常對照2組、低糖2組、高糖2組中，1 000 ng/L Gn干預(yù)后INS含量均高于500、0 ng/L時(shí)，500 ng/L Gn干預(yù)后INS含量均高于0 ng/L時(shí)；提示加入ISO后，Gn干預(yù)可使不同葡萄糖水平的細(xì)胞上清液INS含量升高，且Gn濃度較高時(shí)對INS含量的促進(jìn)作用更明顯。正常對照2組、低糖2組、高糖2組中，1 000 ng/L Gn干預(yù)后cAMP含量均高于500、0 ng/L時(shí)，500 ng/L Gn干預(yù)后cAMP含量均高于0 ng/L時(shí)；提示加入ISO后，Gn干預(yù)可使不同葡萄糖水平的細(xì)胞上清液cAMP含量升高，且Gn濃度較高時(shí)對cAMP含量的促進(jìn)作用更明顯。cAMP含量與INS分泌量呈正相關(guān)關(guān)系，提示Gn干預(yù)可使不同葡萄糖水平的細(xì)胞上清液INS含量升高的機(jī)制可能與cAMP有關(guān)。

綜上所述，Gn可促進(jìn)不同葡萄糖水平下胰島β細(xì)胞INS的分泌，其濃度較高時(shí)對INS促進(jìn)作用更明顯；其機(jī)制可能為Gn通過cAMP信號(hào)通路促進(jìn)INS分泌。本研究結(jié)果為研究促進(jìn)INS分泌類的糖尿病治療藥物開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，對糖尿病病程的進(jìn)展與治療預(yù)后等具有重要意義。

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