王娜，董洪昌，黃瑾

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化教研室/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002）

Neuritin是眾多神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子中的一個(gè)，又被稱為神經(jīng)可塑性相關(guān)蛋白CPG15，位于人類六號(hào)染色體 6p24-p25[1]，其開放閱讀框?yàn)?426 bp，共編碼 142個(gè)氨基酸，第28-115號(hào)氨基酸殘基為Neuritin發(fā)揮生物學(xué)活性的關(guān)鍵片段[2]。

隨著研究的深入，Neuritin在多個(gè)領(lǐng)域的重要性不斷凸顯。Neuritin在神經(jīng)領(lǐng)域的功能已被證實(shí)，Neuritin促進(jìn)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)、神經(jīng)元分支和突觸成熟、調(diào)節(jié)突觸回路形成，并且是唯一維持細(xì)胞存活的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子[3-5]。Neuritin與神經(jīng)損傷修復(fù)密切相關(guān),報(bào)道顯示，重組人Neuritin(recombinant human Neuritin,rhNeuritin)能促進(jìn)大鼠坐骨神經(jīng)損傷、脊髓損傷及功能恢復(fù)[6-7]。此外研究發(fā)現(xiàn)，Neuritin在促進(jìn)細(xì)胞遷移、分化、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管生成等方面具有其獨(dú)特作用[8-9]。深入研究Neuritin的功能，對(duì)于神經(jīng)領(lǐng)域、腫瘤以及糖尿病等疾病的治療具有重要意義[10]。

分別對(duì)2輛貨車在1127軸型下的通行記錄進(jìn)行整理并作可視化處理，可得到對(duì)比曲線見圖3。由圖3可知:正常軸型貨車(車牌為PF5168)的軸重載荷曲線與參考曲線基本上一致；當(dāng)疑似假軸貨車(車牌為CR2721)被判定為1127軸型車輛時(shí)，其軸重載荷曲線與參考曲線差別較大，很容易判別出該貨車與正常的1127軸型貨車不同，稽查人員可以此為參考，對(duì)該貨車進(jìn)行攔截和查驗(yàn)，核實(shí)后依法進(jìn)行處理。由此可證明,將軸重載荷曲線作為疑似假軸車輛的判別曲線具有一定的參考價(jià)值。

制備并純化具有生物活性的Neuritin重組蛋白，是進(jìn)行Neuritin相關(guān)的生物學(xué)功能和機(jī)制研究的重要基礎(chǔ)。純化的重組人Neuritin(recombinant human Neuritin,rhNeuritin)在功能及機(jī)制研究中都有十分良好的應(yīng)用[6-7,11]。因此，通過簡(jiǎn)易、有效的Neuritin蛋白純化方法，獲得實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)中所需的rhNeuritin并對(duì)其進(jìn)行鑒定，對(duì)于實(shí)驗(yàn)研究是至關(guān)重要的基礎(chǔ)。本研究，采用簡(jiǎn)易的手動(dòng)純化方法，對(duì)畢赤酵母中獲得的rhNeuritin進(jìn)行純化，并對(duì)其純度、生物學(xué)活性及免疫原性進(jìn)行分析，證實(shí)本研究簡(jiǎn)易純化方法具有可行性，對(duì)今后的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)揮非常重要的作用。

活性炭一般為粉末狀或顆粒狀，具有密集的多孔結(jié)構(gòu)、較大的內(nèi)表面積，因此具有良好的吸附性能，尤其對(duì)苯系等大分子氣體的脫除效果顯著。活性炭作為吸附劑可以處理大風(fēng)量、低濃度的VOCs氣體，常溫下即可應(yīng)用，運(yùn)行費(fèi)用較低，并且凈化效率高，因此應(yīng)用最為廣泛。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細(xì)胞株

96孔板每孔加入0.01 mg/mL多聚賴氨酸，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中包被過夜，24 h后用無菌雙蒸水清洗后晾干備用。待PC12細(xì)胞傳兩代生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定后用培養(yǎng)基 (85%RMPI1640+10%HS+5%FBS+100U鏈、青霉素)調(diào)整細(xì)胞濃度以1×104個(gè)/孔傳代至多聚賴氨酸包被過的96孔板中。待PC12細(xì)胞在96孔板貼壁生長(zhǎng)6-8 h后，棄去培養(yǎng)基，加入含有500 ng/mL rhNeuritin完全培養(yǎng)液；陰性對(duì)照組中加含有500 ng/mL His蛋白的完全培養(yǎng)液，空白對(duì)照組加入等量的PBS，將96孔培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加入蛋白以后每日觀察PC12細(xì)胞突起生長(zhǎng)狀況，第4 d在倒置相差顯微鏡下觀察并對(duì)其拍照。

1.1.2 儀器與試劑

純化的rhNeuritin免疫SD大鼠，心臟取血，離心收集的血清即抗血清。用Western Blot的方法鑒定抗Neuritin抗血清制備（圖 4a），以未免疫前的SD大鼠血清作為陰性對(duì)照血清（圖4b），市售的Neuritin多克隆抗體做陽性對(duì)照（圖4c）。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，抗血清能有效結(jié)合rhNeuritin及細(xì)胞內(nèi)源性 Neuritin（圖 4），約在11 Kd及16 Kd處檢測(cè)出目的條帶（圖中箭頭所指）。以上結(jié)果提示：本研究中采用手動(dòng)純化方法獲取 rhNeuritin純度為 92%，rhNeuritin可有效的引起SD大鼠免疫反應(yīng)，具有良好的免疫原性并免疫獲得了具有與Neuritin特異性結(jié)合的多克隆抗體。

1.2 方法

1.2.1 重組人Neuritin的誘導(dǎo)表達(dá)與鹽析

所以，在校長(zhǎng)和家長(zhǎng)的認(rèn)識(shí)中，不排除“踢好足球，上名大學(xué)”的動(dòng)機(jī)，但是就校長(zhǎng)而言，他們更多的想法是響應(yīng)國(guó)家號(hào)召，執(zhí)行國(guó)家政策，豐富校園文化生活，提高學(xué)校知名度。就家長(zhǎng)而言，他們更多的想法是讓孩子參與校園足球，促進(jìn)孩子身心健康，讓孩子有一項(xiàng)體育特長(zhǎng)，進(jìn)而養(yǎng)成終身體育的意識(shí)。而家長(zhǎng)的這一認(rèn)識(shí)恰好契合了校園足球改革的本初含義。

1.2.2 重組人Neuritin表達(dá)蛋白的簡(jiǎn)易純化策略

貼壁生長(zhǎng)的PC12細(xì)胞，分別加入含500 ng/mL His蛋白、rhNeuritin蛋白和等量PBS的完全培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，隔天換液，連續(xù)培養(yǎng)4 d后，觀察并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行拍照，并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。每組隨機(jī)選取5-10個(gè)視野，且每個(gè)視野中總細(xì)胞個(gè)數(shù)約在100個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)視野中的所有細(xì)胞數(shù)目（不計(jì)團(tuán)塊中不易計(jì)數(shù)的細(xì)胞），再計(jì)數(shù)每個(gè)視野中長(zhǎng)出突起的細(xì)胞個(gè)數(shù)，陽性細(xì)胞比例即視野中長(zhǎng)出突起細(xì)胞個(gè)數(shù)與視野中總的細(xì)胞數(shù)目的比值。對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行卡方檢驗(yàn)分析，P<0.01為極顯著性差異。本研究中，PBS培養(yǎng)組未見細(xì)胞有明顯突起生長(zhǎng)，陽性細(xì)胞在總的細(xì)胞中占比11.4%（圖3a）；His蛋白培養(yǎng)組未見明顯的細(xì)胞突起生長(zhǎng)，陽性細(xì)胞在總的細(xì)胞中占比14.59%（圖 3b）；500 ng/mL rhNeuritin培養(yǎng)組可見明顯的細(xì)胞突起生長(zhǎng)，陽性細(xì)胞在總的細(xì)胞中占比 41.76%（圖 3c）,rhNeuritin培養(yǎng)組與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組分別進(jìn)行卡方檢驗(yàn)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果為 =0（P<0.01）,即明確了rhNeuritin對(duì)促進(jìn)PC12細(xì)胞突起生長(zhǎng)具有良好效果。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，rhNeuritin培養(yǎng)組細(xì)胞突起生長(zhǎng)相較于PBS空白組和His蛋白陰性組均有極顯著性差異（圖3d），也證實(shí)本研究中的純化方法未影響rhNeuritin的生物學(xué)活性；空白組與陰性組經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)卡方檢驗(yàn)分析，=0.4(p ＞0.05),兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異，明確了His tag對(duì)PC12細(xì)胞突起生長(zhǎng)不產(chǎn)生任何作用。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在統(tǒng)計(jì)學(xué)理論分析的基礎(chǔ)上，提示：rhNeuritin蛋白有效促進(jìn)PC12細(xì)胞突起生長(zhǎng)的生物學(xué)活性；本研究中所采用的純化方法不影響rhNeuritin蛋白的生物學(xué)活性。因此，采用本研究中手動(dòng)純化獲取rhNeuritin具有可行性。

將GS115/pPIC9K- 菌株由-80℃冰箱取出，用接種環(huán)挑取適量至3 mL YPD液體培養(yǎng)基。30℃，220 r/min，培養(yǎng)至菌液稍有渾濁。用接種環(huán)蘸取菌液“Z”字劃線至含 0.5mg/mL G418的YPD平板，30℃恒溫培養(yǎng)至單克隆菌株長(zhǎng)出。在新的含0.5mg/mL G418 YPD培養(yǎng)平板底部，用記號(hào)筆劃線均勻分格，用接種環(huán)挑取單克隆菌株接種點(diǎn)至小格區(qū)域，培養(yǎng)平板用封口膜封口，置于30℃恒溫培養(yǎng)。待單克隆長(zhǎng)出后，用接種環(huán)挑取單克隆菌株于 20mL YPD液體培養(yǎng)基，30℃，220 r/min恒溫培養(yǎng)16 h，將菌液按1∶100體積比轉(zhuǎn)接于BMGY培養(yǎng)基，30℃，220 r/min培養(yǎng)。培養(yǎng)18 h后，使用分光光度計(jì)測(cè)量，將 OD600nm為 2-6的菌液，6000 r/min，5min分批離心。菌體轉(zhuǎn)入對(duì)應(yīng)體積BMMY培養(yǎng)基中，30℃，220 r/min培養(yǎng)，每24 h補(bǔ)加1次甲醇，使其終濃度保持為1%，誘導(dǎo)72 h后，將 BMMY培養(yǎng)基4℃，14000 r/min，30min分批次離心，棄去沉淀，收集上清。稱?。∟H4）2SO4加入上清蛋白液中使其飽和度為65%，同時(shí)加入1 mmol/L DTT，4℃過夜。鹽析后的蛋白液4℃，14000 r/min，30min離心收集沉淀，并用40mL溶解buffer重懸沉淀，0.22 μm濾膜過濾。

1.2.3 重組人Neuritin純化蛋白的SDS-PAGE及Western Blot鑒定

收集的蛋白樣經(jīng)15%SDS-PAGE電泳分離，恒壓83V 30min后，轉(zhuǎn)換至恒壓113V 90min。電泳結(jié)束后考馬斯亮藍(lán)R-250室溫染色2 h，脫色至清晰可見，Bandscan掃描。Western Blot檢測(cè)蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離,23 V，43 min將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜（NC）上,膜用5%脫脂奶粉室溫封閉2h,加入1∶500稀釋比的Neuritin抗體,4℃孵育過夜后,0.02%TBST洗滌NC膜1次×5min/次，3次×10min/次，加入1∶5000稀釋比的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育2 h，洗滌NC膜1次×5min/次，3次×15min/次，最后用發(fā)光試劑顯色并曝光。

1.2.4 重組人Neuritin純化蛋白的生物學(xué)活性鑒定

GS115／pPIC9K- 菌株由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存于-80℃[12]；PC12細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；Sprague-Dawley（SD）大鼠購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)。

文化元素在高校導(dǎo)視系統(tǒng)設(shè)計(jì)中的應(yīng)用具有極其重要的作用，因此，在進(jìn)行導(dǎo)視系統(tǒng)的設(shè)計(jì)工作中，我們不但要充分的體現(xiàn)出其功能性，也要更好的體現(xiàn)出校園的文化魅力以及深厚底蘊(yùn)，進(jìn)而將校園的文化特色更好的表現(xiàn)出來，將藝術(shù)與功能完美結(jié)合，體現(xiàn)出現(xiàn)代高校所倡導(dǎo)的時(shí)代精神以及治學(xué)思想，使高校的校園文化以及思想內(nèi)涵得到有效的傳播。

1.2.5 重組人Neuritin純化蛋白在多克隆抗體的制備中應(yīng)用

雄性壯年健康SD大鼠2只，大鼠乙醚麻醉。取1 mg rhNeuritin蛋白（1mL）與等體積的完全弗式佐劑（FAC）混合。首次免疫使用2 mL完全佐劑乳化的蛋白，背部皮下散點(diǎn)注射。首次免疫后的第3 d，進(jìn)行第二次免疫，免疫佐劑使用“弗氏不完全免疫佐劑（FAIC）”。第二次免疫后的第25 d進(jìn)行第三次免疫，方法同前。末次免疫1周后采血，大鼠在采血前一天禁食。將大鼠麻醉后仰面固定于固定架上，采用心臟取血法獲取全血血液樣本，獲取的血液立即注入滅菌的EP管中，置于37℃溫箱大約1 h，待血液完全凝固后，4 ℃，3000 r/min，15min，棄沉淀保留上清，即獲得抗血清。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組人Neuritin簡(jiǎn)易純化策略圖示

本研究通過SDS-PAGE檢測(cè)rhNeuritin的誘導(dǎo)表達(dá)和純化（圖2a），經(jīng)誘導(dǎo)的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出rhNeuritin，分子量約11 Kd處出現(xiàn)目的條帶。純化結(jié)果顯示，流出液中主要是不含rhNeuritin的雜蛋白。70mmol/L咪唑洗脫液對(duì)介質(zhì)蛋白復(fù)合物洗脫時(shí)，有少量rhNeuritin及雜蛋白被洗脫。300mmol/L咪唑洗脫液洗滌蛋白介質(zhì)蛋白復(fù)合物，rhNeuritin被洗脫，分子量約11 Kd處有明顯條帶且在約22 Kd處（圖中箭頭所指）存在少量二聚體。相同的實(shí)驗(yàn)條件下，利用Neuritin抗體進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，NC膜條帶顯示，特異性結(jié)合的蛋白條帶出現(xiàn)，分子量約11 Kd（圖中箭頭所指），即為Neuritin條帶，且300mmol/L咪唑洗脫液的實(shí)驗(yàn)組中rhNeuritin含量高，圖為曝光過度的NC膜條帶，包含大量的rhNeuritin和少量的rhNeuritin二聚體（圖2b），針對(duì)純化鑒定結(jié)果 SDS-PAGE圖做灰度值掃描。未純化時(shí)，rhNeuritin占總蛋白比例為56%左右，混有較多的非Neuritin蛋白；經(jīng)70mmol/L咪唑的洗脫液，含有300m mol/L 咪唑洗脫液洗滌rhNeuritin，收集并濃縮后鑒定結(jié)果顯示：純化后rhNeuritin占洗脫蛋白的92.55%，提示純化的rhNeuritin蛋白純度可達(dá)到 92%以上（圖 2c），證明本研究中手動(dòng)純化的可行性。

圖1 重組人Neuritin簡(jiǎn)易純化方法圖示Fig.1 The sample purification of rhNeuritin

2.2 重組人Neuritin的誘導(dǎo)表達(dá)及純化鑒定

將未純化的蛋白液與Ni介質(zhì)混合，4℃結(jié)合2 h后，將Ni介質(zhì)與蛋白混合液加入帶有濾膜的空柱中，收集流出液；rhNeuritin帶有His標(biāo)簽易與Ni2+結(jié)合，由于咪唑競(jìng)爭(zhēng)性的與Ni進(jìn)行結(jié)合，根據(jù)咪唑濃度大小，選取含有70、300mmol/L咪唑的洗脫液分別對(duì)柱中介質(zhì)進(jìn)行清洗，洗脫液體積為介質(zhì)體積的10倍，分別收集各洗脫液，分離獲得目的蛋白（圖 1）。

圖2 重組人Neuritin表達(dá)、純化及鑒定Fig.2 The expression,purification,and identification of rhNeuritin

2.3 重組人Neuritin純化蛋白的生物學(xué)活性鑒定

將Ni sepharoseTM介質(zhì)重懸混勻后，用移液器吸取6 mL于層析柱空柱中，待儲(chǔ)存介質(zhì)的20%乙醇流出，加Ni介質(zhì)5倍體積的過濾水沖洗介質(zhì)，待水流出。加5倍體積溶解buffer平衡Ni介質(zhì)，待溶解buffer流出，用2 mL溶解 buffer重懸Ni介質(zhì)，將介質(zhì)加入過濾后的的蛋白液中，4℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合2 h。將介質(zhì)與蛋白混合物移至空柱，并收集流出液，流出的前5mL中取樣鑒定；用10倍體積洗脫buffer 1洗滌Ni介質(zhì)蛋白復(fù)合物，流出前5mL中取樣鑒定；用10倍體積洗脫buffer 2洗滌Ni介質(zhì)蛋白復(fù)合物，流出前5mL中取樣鑒定。Neuritin蛋白洗脫液超濾濃縮后，用0.1 mol/L PBS稀釋 10倍，再超濾、濃縮，分裝凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

圖3 重組人Neuritin蛋白的生物學(xué)活性鑒定Fig.3 The biological activity of rhNeuritin

2.4 重組人Neuritin純化蛋白在多克隆抗體的制備中的應(yīng)用

Ni Sepharose TM highperformance購(gòu)自GE公司；Olympus Microscope Digital Camera顯微鏡；親和層析純化空柱、電泳儀均購(gòu)自BIO-RAD公司；離心超濾管購(gòu)自 Millipore公司；RMPI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gbico公司；多聚賴氨酸購(gòu)自SIGMA公司；酵母提取物和胰蛋白胨購(gòu)自 Oxide公司；酵母氮源（YNB）和G418均購(gòu)自 Invitrogen公司；YPD、BMGY 和 BMMY培養(yǎng)基配方見Invitrogen公司提供的畢赤酵母操作手冊(cè)；NC膜購(gòu)自 Whatman公司；Neuritin抗體購(gòu)自Abcam公司，山羊抗鼠IgG-HRP購(gòu)自中衫金橋公司；化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)置Millipore公司；96孔板購(gòu)自Coaster公司；蛋白分子量Marker購(gòu)自Thermo公司；溶解buffer（10mmol/L磷酸一氫鈉、10mmol/L磷酸二氫鈉、0.5mol/L氯化鈉、20mmol/L咪唑，pH 7.4）；洗脫 buffer 1（10m mol/L磷酸一氫鈉、10mmol/L磷酸二氫鈉、0.5mol/L氯化鈉、70mmol/L咪唑，pH7.4）；洗脫 buffer 2（10mmol/L磷酸一氫鈉、10m mol/L磷酸二氫鈉、0.5 mol/L氯化鈉、300mmol/L咪唑，pH7.4）；不完全弗氏佐劑（FAC）、完全弗氏佐劑(FAIC)購(gòu)自Thermo公司；高壓滅菌鍋購(gòu)自HIRAYAMA公司；離心管購(gòu)自Millipore公司；Neuritin多克隆抗體購(gòu)自Abcam公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

圖4 重組人Neuritin蛋白抗血清的鑒定Fig.4 Identification of antiserum against Neuritin

3 討論

重組人Neuritin蛋白純化的方法及條件在我們的前期的研究中已基本確立[12]?；谇捌诓捎肎E Healthcare公司AKTA純化系統(tǒng)對(duì)重組人Neuritin蛋白的線性純化結(jié)果，本研究?jī)?yōu)化了純化步驟，獲得了純度為92%以上的Neuritin重組蛋白。在AKTA純化結(jié)果的基礎(chǔ)上，針對(duì)雜蛋白及His標(biāo)簽的Neuritin蛋白的洗脫液咪唑濃度進(jìn)行優(yōu)化，用70mmol/L咪唑的buffer1洗脫雜蛋白，用300mmol/L咪唑的buffer2洗脫目的蛋白，僅用兩步獲得了較高純度的Neuritin重組蛋白。該方法簡(jiǎn)易、有效、可節(jié)省成本、不受柱體積限制可用于各種劑量的蛋白純化、不受設(shè)備限制，且在純化過程中使蛋白與層析介質(zhì)充分混合和洗脫，提高了親和層析的效果，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，減低了純化蛋白降解的可能。

(四)1761年—1771年，亦即渥巴錫執(zhí)政時(shí)期，由于沙皇俄國(guó)控制空前加劇而造成汗國(guó)嚴(yán)重政治危機(jī)。土爾扈特人反抗壓迫在渥巴錫領(lǐng)導(dǎo)下舉族東歸祖邦，持續(xù)一個(gè)半世紀(jì)之久的土爾扈特汗國(guó)走向瓦解。留居伏爾加河流域的杜爾伯特牧民和少量土爾扈特人、和碩特人大約4700余帳，全部歸入阿斯特拉罕省長(zhǎng)辦公室下設(shè)的專門管理機(jī)構(gòu)——“特別管理處”管轄，1797年俄國(guó)政府在阿斯特拉罕成立“卡爾梅克公署”，留居伏爾加河流域的卡爾梅克人已失去了政治獨(dú)立，淪為俄國(guó)政府監(jiān)督下的俄羅斯帝國(guó)的一個(gè)行政區(qū)域。

然后，我們利用已建立的Neuritin活性鑒定平臺(tái)，觀察了純化的Neuritin重組蛋白對(duì)未分化的PC12細(xì)胞突起生長(zhǎng)的影響，進(jìn)一步明確了簡(jiǎn)易純化方法獲得的Neuritin促進(jìn)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的作用，證明該純化方法具有可行性。

最后，結(jié)合多克隆抗體制備的免疫方法[13-15]，我們利用該簡(jiǎn)易純化方法獲得的Neuritin重組蛋白免疫動(dòng)物，制備其特異性的多克隆抗體。研究顯示，成功制備的抗血清不僅能有效結(jié)合rhNeuritin，而且能識(shí)別細(xì)胞內(nèi)源性Neuritin，證實(shí)免疫動(dòng)物所用的Neuritin重組蛋白具有良好的免疫原性。

以上研究表明本研究中所采用的純化方法簡(jiǎn)易有效，是蛋白制備工作中必不可少的重要環(huán)節(jié)，對(duì)于深入開展Neuritin的功能及機(jī)制研究具有非常重要的意義。

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