穆艷順 王 彬 李斯丹 朱光華 楊 駿 周 翾 王 凱 閆 巖 林 巍 秦茂權(quán) 鄭胡鏞

兒童異基因造血干細(xì)胞移植為目前治療兒童白血病的一種較好的選擇，同胞全相合異基因造血干細(xì)胞移植具有干細(xì)胞植入率高，急、慢性移植物抗宿主病(GVHD)發(fā)生率低的優(yōu)點(diǎn)，仍然作為異基因造血干細(xì)胞移植首選[1,2]。鑒于中國的國情，HLA(人類白細(xì)胞抗原)配型全相合同胞供者很難獲得，無關(guān)供者尋找時間長，可能貽誤移植時機(jī)。單倍體相合是一種有著獨(dú)特優(yōu)勢的造血干細(xì)胞來源的移植方式，供體易獲得，有很大的依從性，可以為移植后的細(xì)胞免疫治療提供巨大便利，逐漸成為尋找全相合供體失敗后的一種選擇。由于HLA單倍體的免疫學(xué)障礙，應(yīng)用常規(guī)方式移植不僅排斥反應(yīng)發(fā)生率高，重度GVHD發(fā)生率也顯著增高。隨著近年來移植技術(shù)的進(jìn)步，許多降低GVHD發(fā)生率和促進(jìn)植入的方法應(yīng)用于臨床，如清髓性預(yù)處理方案，CD34陽性造血干細(xì)胞數(shù)量、選擇性去除供者T細(xì)胞和體內(nèi)非去除T細(xì)胞等，都取得了較好的療效[3-6]。首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院(我院)應(yīng)用清髓性預(yù)處理聯(lián)方案，進(jìn)行非體外去除T淋巴細(xì)胞的親緣單倍體相合造血干細(xì)胞移植(簡稱親緣單倍體相合組)與同胞全相合造血干細(xì)胞移植(簡稱同胞全相合組)治療兒童急性白血病也取得了良好療效。

1 方法

1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①診斷為急性白血病完全緩解，符合我院移植適應(yīng)證；②年齡1～14歲；③身體一般狀況較好，無重要臟器功能不全；④采用非體外去除T細(xì)胞造血干細(xì)胞移植。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①合并嚴(yán)重慢性消耗性疾病，如糖尿病及其他惡性腫瘤；②采用無關(guān)或臍血移植；③非清髓預(yù)處理。

1.3 知情同意 采用親緣單倍體移植是根據(jù)患兒的移植配型、疾病的狀態(tài)和供受者的KIR基因分型來選擇供者，移植前患兒監(jiān)護(hù)人簽署移植同意書。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 主要觀察指標(biāo) ①移植相關(guān)病死率(TRM)：移植后非復(fù)發(fā)原因所導(dǎo)致感染、移植相關(guān)并發(fā)癥所導(dǎo)致的死亡。②復(fù)發(fā)(RR)：髓內(nèi)復(fù)發(fā)，骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查提示骨髓中原始+幼稚細(xì)胞≥20%出現(xiàn)新的病態(tài)造血，微小殘留病灶(MRD)>10-2；髓外復(fù)發(fā)，骨髓以外的任何組織檢出白血病細(xì)胞浸潤。③總體生存(OS) ：從移植后第1 d至最終隨訪或死亡的時間。

1.4.2 次要觀察指標(biāo) ①GVHD：癥狀分級和臨床分級按Glucksberg標(biāo)準(zhǔn)[7](表1和2)。發(fā)生于移植后100 d內(nèi)為急性GVHD。②巨細(xì)胞病毒(CMV) 血癥：實(shí)時熒光定量 PCR 檢測外周血 CMV-DNA>5× 102copies·mL-1。③確診CMV?。和瑫r能從特定感染部位(支氣管肺泡灌洗液、腦脊液、糞便、腸道、肝臟等標(biāo)本)中檢測到 CMV-DNA 陽性，或免疫組化染色、原位雜交等證實(shí)CMV陽性，同時具有相應(yīng)臨床癥狀。

表1 急性移植物抗宿主病癥狀分級

表2 急性移植物抗宿主病臨床分級

注 如果器官受損較輕，但活動能力極度低下，也應(yīng)包括在Ⅳ級

1.5 兒童急性白血病造血干細(xì)胞移植的適應(yīng)證

1.5.1 兒童急性白血病第1次完全緩解 ①急性白血病誘導(dǎo)治療失?。虎诩毙粤馨图?xì)胞白血病t(9;22)或BCR/ABL融合基因陽性；③急性淋巴細(xì)胞白血病t(4;11)或MLL/AF4融合基因陽性，或其他MLL重排有移植指證的急性白血??；④急性髓性白血病高?；颊撸虎莼旌媳硇图毙园籽?；⑥轉(zhuǎn)化型急性髓性白血病(t-AML)。

1.5.2 兒童急性白血病第2次完全緩解 ①急性淋巴細(xì)胞白血病存在微小殘留??；②急性淋巴細(xì)胞白血病骨髓復(fù)發(fā)且第1次完全緩解期持續(xù)的時間<30個月；③急性髓性白血病第2次完全緩解。

1.5.3 兒童急性白血病第3次及以上完全緩解。

1.6 HLA配型與供者的選擇標(biāo)準(zhǔn) 所有供者均選擇親緣關(guān)系供者，HLA配型根據(jù)組織相容性抗原檢測HLA-A、B、C、DR位點(diǎn)，采用微量順序特異引物聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-SSP)方法。供者中各項(xiàng)常規(guī)檢查、肝腎功能、傳染病、心肺功能、肝膽脾超聲等檢查均提示為健康供者。根據(jù)配型相合程度、年齡、性別及健康狀況選擇供者。

1.7 不同預(yù)處理方案選擇原則

1.7.1 同胞全相合組預(yù)處理方案 馬利蘭(每次0.8～1.2 mg·kg-1，每日4次靜脈滴注4 d，-9、-8、-7和-6)+環(huán)磷酰胺(50 mg·kg-1·d-1，靜脈滴注4 d，-5、-4、-3和-2)。

1.7.2 親緣單倍體相合組預(yù)處理方案 ①方案1：氟達(dá)拉濱(25 mg·m-2·d-1，靜脈滴注5d，-14、-13、-12、-11和-10)+馬利蘭(每次0.8～1.2 mg·kg-1，每日4次，靜脈滴注4 d，-9、-8、-7和-6)+環(huán)磷酰胺(50 mg·kg-1·d-1，靜脈滴注4 d，-5、-4、-3和-2)+ATG(2.5 mg·kg-1·d-1，靜脈滴注5 d，-6、-5、-4、-3、和-2)；②方案2：阿糖胞苷(4 g·m-2·d-1，靜脈滴注2 d，-10和-9)+馬利蘭(每次0.8～1.2 mg·kg-1，每日4次靜脈滴注3 d，-8、-7和-6) +環(huán)磷酰胺(1.8 g·m-2·d-1，靜脈滴注2 d，-5和-4)+司莫司丁(250 mg·m-2·d-1，口服，-3 d)+ATG 2.5 mg·kg-1·d-1，靜脈滴注4 d，-5、-4、-3、和-2)。

1.8 供者造血干細(xì)胞的動員、采集及移植 采用粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)對供者進(jìn)行造血干細(xì)胞動員，劑量為5～10 μg·kg-1·d-1，于動員后第4 d采集供者骨髓造血干細(xì)胞，第5 d使用COBE Spectra血細(xì)胞分離機(jī)采集外周血液細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀對造血干細(xì)胞進(jìn)行分析，若單個核細(xì)胞數(shù)<8.0×108·kg-1、CD34+細(xì)胞數(shù)<6.0×106·kg-1，次日補(bǔ)充采集外周血造血干細(xì)胞，采集后于當(dāng)天輸給受者，回輸過程中給予患兒心電監(jiān)護(hù)，注意回輸過程中患兒生命體征變化。

1.9 植入證據(jù)監(jiān)測及植入標(biāo)準(zhǔn) 采用短串聯(lián)重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(STR-PCR)或免疫熒光原位雜交法(FISH)檢測植入情況。供受者性別不同時采用FISH檢測性染色體的嵌合比例，供受者性別相同時使用STR-PCR檢測患者外周血，并定期復(fù)查以監(jiān)測和證實(shí)造血重建。定期檢測ABO血型及其抗體效價，了解有無血型轉(zhuǎn)換。移植后定期進(jìn)行血常規(guī)、骨髓形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)(BCR/ABL融合基因等)檢查，判定疾病狀態(tài)。植入標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)3 d中性粒細(xì)胞≥0.5×109·L-1為達(dá)到臨床WBC植入，不用輸PLT的情況下，連續(xù)7 d PLT≥20×109·L-1為PLT植入。

1.10 支持治療與并發(fā)癥的防治 移植的患兒移植前全面體檢，清除口腔、耳鼻喉、肛門及呼吸道感染灶，移植期間入住無菌層流病房，施行全環(huán)境保護(hù),，予無菌飲食、高糖、脂肪乳、復(fù)方氨基酸注射液等支持治療至能正常飲食?？诜⒖颠蝾A(yù)防真菌感染，復(fù)方新諾明預(yù)防卡氏肺囊蟲感染，應(yīng)用前列腺素、低分子肝素鈣注射液預(yù)防靜脈阻塞綜合征。應(yīng)用阿昔洛韋10 mg·kg-1每12 h 1次靜脈滴注(從預(yù)移植的第+0d至WBC穩(wěn)定植入)預(yù)防皰疹病毒感染。移植期間用PCR法每周至少檢測2次血清CMV-DNA，如CMV-DNA陽性且伴有臨床癥狀的患兒給予更昔洛韋5 mg·kg-1每12 h 1次，或膦甲酸鈉30 mg·kg-1每8 h 1次，并給予丙種球蛋白等加強(qiáng)支持治療。移植期間出現(xiàn)發(fā)熱，積極尋找病原學(xué)證據(jù)，開始經(jīng)驗(yàn)性治療，感染明確后根據(jù)病原學(xué)結(jié)果調(diào)整抗生素用藥。間斷輸注輻照PLT和RBC，在移植后+5 d時予皮下注射重組G-CSF至WBC穩(wěn)定植入。PLT<20×109·L-1時輸注輻照PLT懸液，Hb<80 g·L-1時輸注輻照RBC。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 2007年6月至2015年5月我院符合本文親緣單倍體相合組和同胞全相合組納入和排除標(biāo)準(zhǔn)的連續(xù)樣本分別為23例和21例。親緣單倍體相合組男15例，女8例，中位年齡為(7.8±3.5)歲，急性淋巴細(xì)胞白血病14例，急性髓性白血病9例；同胞全相合組男9例，女12例，中位年齡為(7.9±3.5)歲，急性淋巴細(xì)胞白血病8例，急性髓性白血病13例。兩組性別(χ2=2.21,P=0.14)、年齡(t=0.28，P=0.78)和疾病構(gòu)成(χ2=2.28，P=0.13)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。同胞全相合組按既定方案治療，親緣單倍體相合組中18例采用了方案1，5例采用方案2治療。

2.2 造血恢復(fù)情況 親緣單倍體相合組與同胞全相合組患兒WBC植入平均時間分別為(13.1±2.3)和(12.5±1.4)d, (t=1.02，P>0.05)，PLT植入時間分別為(19.4±8.0)和(22.9±7.7)d,(t=1.46，P>0.05)。+30 d行植入證據(jù)檢測均獲得植入。

2.3 主要觀察指標(biāo) ①TRM：親緣單倍體相合組2/23例(8.7%),同胞全相合組2/21例(9.5%)，χ2=0.02，P>0.05；②RR: 親緣單倍體相合組4/23例(17.4%), 同胞全相合組4/21例(19.0%)，χ2=0.02，P>0.05。③OS：親緣單倍體相合組中位隨訪時間(49.6±30.3)月，移植后OS 69.5%(16/23),7例死亡病例中，3例急性淋巴細(xì)胞白血病和1例急性非淋巴細(xì)胞白血病復(fù)發(fā)，2例移植相關(guān)死亡，1例死于重癥肺炎相關(guān)的多臟器功能衰竭。同胞全相合組，中位隨訪時間(32.5±31.6)月，移植后OS 71.4% (15/21),6例死亡病例中，1例急性淋巴細(xì)胞白血病和3例急性非淋巴細(xì)胞白血病復(fù)發(fā)，2例移植相關(guān)死亡。圖1顯示兩組OS差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.003，P>0.05)。

圖1 兩組OS統(tǒng)計

2.4 次要觀察指標(biāo) 急性GVHD癥狀分級中，親緣單倍體相合組與同胞全相合組急性GVHD(0～4+)皮膚斑丘疹癥狀分別為12和5例, 膽紅素>34 μmol·L-1分別為7和4例,腸道腹瀉量>500 mL·d-1分別為7例和2例。親緣單倍體相合組與同胞全相合組的GVHO臨床分級分別為15和5例，親緣單倍體相合組與同胞全相合組急性GVHD(Ⅰ～Ⅳ)65.2%(15/23)和23.8%(5/21)，χ2=7.59，P<0.05。

3 討論

異基因造血干細(xì)胞移植是可能治愈白血病的治療措施，但由于受HLA不合的免疫學(xué)障礙，多年來異基因造血干細(xì)胞移植多在同胞全相合供受者之間進(jìn)行，在親屬間找到HLA全相合同胞供者的機(jī)會僅為25%[8-10]，幾乎所有需要移植治療的患者均可在自己的親屬中及時找到HLA單倍體供者，親緣單倍體造血干細(xì)胞移植，成為國內(nèi)外學(xué)者一直研究的熱點(diǎn)，系統(tǒng)地對非體外去T細(xì)胞單倍體與全相合移植后免疫功能重建在成人移植中較好的療效越來越受到國際關(guān)注。近年來單倍體移植取得的效果已經(jīng)與無關(guān)供者的移植效果相當(dāng)，生存質(zhì)量相比同胞全合移植也無明顯差異，國外報道急性淋巴細(xì)胞白血病異基因造血干細(xì)胞移植后5年LFS 為58.6%，急性非淋巴細(xì)胞白血病患兒5年LFS 為(47±5)%，療效滿意[11]。本研究通過對親緣單倍體非體外去除T細(xì)胞的造血干細(xì)胞移植的23例白血病患兒及同胞全相合治療的21例白血病患兒的臨床資料對比分析顯示，所有患兒均獲得了較快速的造血重建，兩組中性粒細(xì)胞及PLT重建的中位時間相近。移植后1個月，經(jīng)性染色體FISH方法檢測、ABO血型鑒定及STR-PCR檢測證實(shí)兩種移植類型均可獲得造血干細(xì)胞成功植入。生存分析顯示，親緣單倍體組總體生存率分別為69.5%，同胞全相合組總體生存率為71.4%,差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示親緣單倍體造血干細(xì)胞組未出現(xiàn)植入延遲或植入不良現(xiàn)象。同胞全相合造血干細(xì)胞移植采用非體外去除T淋巴細(xì)胞外周血作為造血干細(xì)胞來源進(jìn)行移植，親緣單倍體移植采用非體外去除T淋巴細(xì)胞外周血和骨髓作為造血干細(xì)胞來源進(jìn)行移植，供者耐受性好，易于接受，而且在移植時可應(yīng)用血液分離機(jī)對經(jīng)G-CSF 動員的供者造血干細(xì)胞 多次單采，滿足移植所需的足夠數(shù)量的CD34+細(xì)胞，G-CSF 主要作用于髓系造血細(xì)胞的增殖、分化和活化，可使干細(xì)胞增加，且自我更新、復(fù)制能力增強(qiáng)。G-CSF 可有效刺激骨髓粒細(xì)胞系增殖，促進(jìn)骨髓造血功能重建。另外，G-CSF可趨化供者CD4+T 細(xì)胞產(chǎn)生Th-2 型細(xì)胞因子應(yīng)答，可減少IL-2 和INF-2 的分泌，從而減弱 GVHD 的嚴(yán)重度，而且經(jīng)G-CSF 動員的骨髓中間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)活性有利于降低GVHD 發(fā)生率。本文移植的23例親緣單倍體白血病患兒及同胞全相合治療的21例白血病患兒均減少了重型VHD的發(fā)生率。選擇的清髓性非體外去除T淋巴細(xì)胞，有利于患兒移植后免疫功能重建并保留移植物抗白血病作用，故移植后感染相關(guān)的病死率較低，且無導(dǎo)致白血病復(fù)發(fā)率的增加。

雖然急性GVHD發(fā)生率親緣單倍體組高于同胞全相合組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但兩組重度急性GVHD發(fā)生率低。本研究親緣單倍體移植與同胞全相合移植在植入、復(fù)發(fā)率等方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

總之，親緣單倍體移植采用非體外去除T細(xì)胞造血干細(xì)胞移植治療兒童急性白血病可以取得與同胞全相合造血干細(xì)胞移植相似的療效。在缺乏HLA全相合供者時，親緣單倍體非體外去除T細(xì)胞的造血干細(xì)胞移植是治療兒童白血病的一種安全、有效的方法。

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