劉玉珍，鄧振山，高 飛，李 靜，李征霆，陳凱凱，魏婷婷

（延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 延安 716000）

植物內(nèi)生菌是細(xì)菌或真菌定植在健康植物組織，屬于植物細(xì)胞或植物組織之間無明顯癥狀的疾病組織［1-2］。這些內(nèi)生菌可以用它們的生命周期或其一部分入侵寄主植物的活組織而對(duì)被剝奪的植物不產(chǎn)生任何傷害，有時(shí)造成隱性感染和無癥狀［3］。值得一提的是，現(xiàn)存的大量植物物種是多數(shù)內(nèi)生菌的宿主，但對(duì)這些植物的內(nèi)生微生物尚未深入研究［4-5］。在與植物共生中，這些細(xì)菌是通過不同的途徑包括激素的產(chǎn)生、磷酸鹽等無機(jī)礦物的溶磷作用、大氣中氮的固定和鐵載體的產(chǎn)生來刺激植物生長［6-7］。植物內(nèi)生菌的生物學(xué)特性，可發(fā)揮定殖于植物體內(nèi)生細(xì)菌的促生和防病作用，為植物提供有效營養(yǎng)，促進(jìn)植物生長［8-9］。近年來關(guān)于有多種生物學(xué)特性內(nèi)生菌的報(bào)道陸續(xù)出現(xiàn)。姚玉玲等［10］從矮生嵩草體內(nèi)分離到1株具有多種生物學(xué)特性的植物內(nèi)生菌；姜云［11］等研究了1株人參內(nèi)生菌的多種生物學(xué)特性。目前關(guān)于促生細(xì)菌的報(bào)道較多，但因其在實(shí)際應(yīng)用中存在諸多問題如應(yīng)用效果不穩(wěn)定、易受土著微生物的影響、難以在土壤中成功定殖等，分離篩選植物內(nèi)生促生細(xì)菌并加以應(yīng)用已成為新的研究方向。

巨菌草（Pennisetumsp.）是指營養(yǎng)適合食用菌、藥用菌等微生物生長需要，太陽能利用率高，適應(yīng)性強(qiáng)，具有某些優(yōu)良特性，可作為食用菌、藥用菌等微生物培養(yǎng)基并有綜合開發(fā)利用價(jià)值的草本植物［12-13］。目前對(duì)于巨菌草內(nèi)生促生細(xì)菌的研究鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)以巨菌草為研究對(duì)象，從中篩選具有促生作用的內(nèi)生菌，研究測(cè)定其抑菌效果、固氮、溶磷、產(chǎn)鐵載體和分泌IAA的能力，通過16S rDNA鑒定該菌株的分類地位，以期為植物內(nèi)生促生菌的開發(fā)和利用提供依據(jù)，也為巨菌草微生物菌肥的開發(fā)與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集 2016年5月在陜西延安溫家溝巨菌草基地（35°31′55″N，109°31′22″E）采集完整巨菌草植株體，用無菌袋包裝帶回實(shí)驗(yàn)室。延安屬高原大陸性季風(fēng)氣候，平均海拔1000 m左右，年日照2818 h，年均無霜期170 d，平均氣溫9.2℃，年均降水量500 mm，土壤的物質(zhì)組成主要以黃土為主。

1.1.2 主要試劑和儀器 PCR所用試劑均購自上海生工生物工程有限公司，其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。所用儀器包括UV-1780紫外可見分光光度計(jì)（蘇州島津儀器有限公司），HC-3614R高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），HNZ-2-2F垂直流形超凈工作臺(tái)（南通滬南科學(xué)儀器有限公司），LS-75L型立式壓力蒸汽滅菌器（江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），LRH-250F生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），F(xiàn)LY-2102恒溫振蕩器（上海風(fēng)棱實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基與染液 PDA培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、水瓊脂培養(yǎng)基（瓊脂15～20 g，蒸餾水1000 mL，pH自然）、高氏I號(hào)培養(yǎng)基、NBRIP培養(yǎng)基、Ashby培養(yǎng)基。

100 mL CAS檢測(cè)固體培養(yǎng)基：20%蔗糖溶液1 mL，10%酸水解酪蛋白3 mL，1 mmol/L CaCl2100 μL，0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）0.5 mL，CAS染液5 mL，瓊脂粉1.8 g；CAS染液：稱取0.012 g CAS溶解于10 mL去離子水中，并與2 mL 1 mmol/L FeCl3混合，得a液；取0.015 g CTAB溶于8 mL去離子水中，得b液；a液與b液混合即得CAS染液。0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH=6.8）100 mL：NaH2PO4·2H2O 0.5905 g，Na2HPO4·12H2O 2.427 g，NH4Cl 0.250 g，KH2PO4·3H2O 0.075 g，NaCl 0.125 g。

Salkowski’s試劑：1 mL 0.5 mol/L FeCl3溶解于49 mL 35% HClO4中。鉬銻抗試劑：將125 ml 2.5 mol/L硫酸與37.5 mL鉬酸銨溶液混合，加入75 mL抗壞血酸溶液和12.5 mL酒石酸梯鉀溶液，充分混勾（現(xiàn)用現(xiàn)混）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 巨菌草內(nèi)生菌的分離、純化 采用組織塊分離法和劃線分離法對(duì)巨菌草植株體中的內(nèi)生菌進(jìn)行篩選，在超凈工作臺(tái)對(duì)材料表面進(jìn)行消毒。選擇新鮮、健康巨菌草根、莖、葉，首先去掉表面的泥土等附著物，然后用自來水沖洗干凈，再用無菌水沖洗1次；于95%酒精中浸泡3～5 min后用無菌水沖洗3～4次，然后轉(zhuǎn)入含有效氯為5%的次氯酸鈉溶液中浸泡3～8 min，無菌水沖洗4～5次，最后用70%乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗4～5次，在無菌條件下晾干備用；在無菌狀態(tài)下將材料切成0.2 cm×0.2 cm的小塊，每平板接2～4個(gè)組織，于28℃恒溫靜置培養(yǎng)3～5 d。待培養(yǎng)基中有可見菌落時(shí)，挑取周圍菌落移入相應(yīng)培養(yǎng)基純化，并進(jìn)行菌落形態(tài)描述，編號(hào)，置于4℃冰箱中備用。將最后一次沖洗的無菌水涂布于培養(yǎng)基上作為對(duì)照，于恒溫靜置培養(yǎng)，檢驗(yàn)消毒效果［14-15］。

1.2.2 產(chǎn)IAA活性菌株的篩選 定性測(cè)定：將待測(cè)菌株接種于加入了色氨酸（1 g/L）的NA液體培養(yǎng)基，28℃ 180 r/min搖床震蕩培養(yǎng)3 d，于4℃ 12000 r/min離心后取100 μL上清液加入96孔板中，加入100 μL Salkowski’s試劑混勻，室溫下避光顯色30 min，然后進(jìn)行觀察。能夠產(chǎn)生IAA的菌株菌懸液上清與Salkowski’s試劑混合會(huì)呈現(xiàn)紅色或者粉紅色，而色氨酸是黃色或者無顏色反應(yīng)。

定量測(cè)定：制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：配置濃度梯度為 0、5、10、20、40、60 mg/L的吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。將1 mL各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液加入試管，再加入等體積Salkowski reagent比色液，避光放置30 min，以0 mg/L作空白對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)在540 nm檢測(cè)吸光值，吸光值為縱坐標(biāo)，IAA濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)其得出的回歸方程為Y= 0.0157608X（R2= 0.9945）。之后，對(duì)能產(chǎn)生IAA的各菌株，在恒溫?fù)u床內(nèi)160 r/min 28℃培養(yǎng)48 h，12000 r/min離心10 min得到上清，取上清液2 mL加入2 mL Salkowski reagent比色液，暗處放置0.5 h后在540 nm下測(cè)定吸光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算菌液中的IAA濃度［16-17］。

1.2.3 菌株YA-6其他促生特性分析

（1）溶磷性的測(cè)定。定性測(cè)定：活化篩選出的內(nèi)生細(xì)菌，培養(yǎng)36 h后，將其分別點(diǎn)接于NBRIP平板中心，每處理重復(fù)3次，28℃恒溫暗培養(yǎng)7～10 d，檢查菌落周圍是否有透明溶磷圈出現(xiàn)。出現(xiàn)透明圈，表示該菌株將難溶的磷轉(zhuǎn)化為可溶性憐，記為有溶磷活性，并測(cè)量記錄其溶磷圈大小。

定量測(cè)定：配置濃度梯度為0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將150 μL標(biāo)準(zhǔn)液、2550 μL去離子水和300 μL鉬梯抗試劑分別加入試管，混勻放置15 min，用紫外分光光度計(jì)在700 nm檢測(cè)吸光值，吸光值為縱坐標(biāo)，磷酸二氫鉀濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)其得出的回歸方程為Y= 0.121333X（R2= 0.98356）。將待測(cè)菌株接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，置于28℃搖床過夜培養(yǎng)，取150 μL接種于15 mL NBRIP液體培養(yǎng)基中，3次重復(fù)，于28℃搖床振蕩培養(yǎng)10 d后，將培養(yǎng)液12000 r/min離心5 min，上清液用于磷含量測(cè)定。將150 μL上清液，2550 μL去離子水和300 μL鉬梯抗試劑分別加入24孔板中，混勻，15 min后在700 nm波長下測(cè)定吸光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算菌液中的磷濃度［18-19］。

（2）潛在固氮能力檢測(cè)。將待測(cè)菌株接種到NA液體培養(yǎng)基，28℃ 180 r/min搖床震蕩培養(yǎng)36 h 后，以100 μL/5 mL接種到Ashby液體培養(yǎng)基中，對(duì)照接種無菌水，每個(gè)處理3次重復(fù)，28℃靜置培養(yǎng)，7 d后對(duì)比接菌與對(duì)照的渾濁情況，明顯渾濁為陽性，即為有固氮活性。同時(shí)將培養(yǎng)36 h的菌株在Ashby固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，28℃暗培養(yǎng)，連續(xù)繼代3次，每次培養(yǎng)7 d，第3次仍有明顯活性的菌株，記為具有固氮活性［20-21］。

（3）產(chǎn)鐵載體能力的測(cè)定。菌種接種于CAS液體培養(yǎng)基中，28℃、160 r/min恒溫培養(yǎng)2～3 d，觀察培養(yǎng)基顏色變化。顏色由藍(lán)色變?yōu)榉奂t色，說明具有產(chǎn)鐵載體的能力，反之，則無產(chǎn)鐵載體的能力［22-23］。

（4）抑制病原真菌活性試驗(yàn)。采用平板對(duì)峙法測(cè)定其抑菌活性。選取番茄枯萎病菌、黃瓜枯萎病菌、玉米大斑病菌作為指示菌，并于PDA培養(yǎng)基上活化。用0.5 cm打孔器在菌落邊緣打成菌餅，用接種環(huán)挑取1塊病原菌菌餅置于PDA平板中央，在距離病原菌菌餅2.5 cm處的3個(gè)點(diǎn)對(duì)稱接種待測(cè)內(nèi)生細(xì)菌菌株，以僅接種病原菌的處理為對(duì)照，每個(gè)處理3重復(fù)，28℃下培養(yǎng)，觀察菌落的生長變化，直至指示菌的菌絲在對(duì)照平板上鋪滿培養(yǎng)基整個(gè)表面，以抑菌圈大小判斷抑菌作用。記錄、測(cè)定抑菌圈大小［24-25］。

1.2.4 菌株YA-6的鑒定 將純化后的菌株YA-6接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，置28℃恒溫箱中培養(yǎng)2 d后，觀察并描述菌落的形態(tài)特征，對(duì)菌體進(jìn)行革蘭氏染色。

利用CTAB法提取菌株YA-6的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增引物、反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序參見文獻(xiàn)［26-27］。具有特異性條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工公司測(cè)序，將測(cè)得的序列與GenBank中的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行Blast相似性分析。然后用Mega 5.0的鄰接法（Neighbor-Joining）建立16S rDNA基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)特征，獲得GenBank登錄號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 巨菌草內(nèi)生菌的分離

采用多種培養(yǎng)基對(duì)巨菌草植株體進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌分離，得到86株內(nèi)生細(xì)菌，其中從葉中分離到34株，占分離總菌數(shù)的39.53%，從根中分離到28株，占分離總菌數(shù)的32.56%，從莖中分離到24株，占分離總菌數(shù)的27.91%。試驗(yàn)表明，巨菌草植株體內(nèi)存在豐富的內(nèi)生細(xì)菌。

2.2 產(chǎn)IAA菌株的篩選

從86株內(nèi)生菌中篩選到8株產(chǎn)IAA能力較好的菌株，其中YA-6產(chǎn)IAA能力最強(qiáng)，顯色液反應(yīng)后呈現(xiàn)紅色，質(zhì)量濃度達(dá)到11.73 mg/L。

2.3 菌株YA-6其他促生潛能的分析

Ashby培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株YA-6可以在Ashby培養(yǎng)基上正常生長，說明其具有潛在的固氮能力；溶解無機(jī)磷平板培養(yǎng)試驗(yàn)?zāi)芸吹矫黠@的溶磷圈，說明其具有溶磷能力，鉬銻抗比色法測(cè)得其溶磷活性為7.103 mg/L；鐵載體試驗(yàn)顯色液反應(yīng)為粉紅色，說明菌株具有產(chǎn)生鐵載體的能力；但菌株YA-6不具有抑制病原菌的活性（圖1，封三）。

2.4 菌株YA-6的鑒定

2.4.1 形態(tài)特征觀察 菌株YA-6在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上形成的菌落呈淡黃色，不透明，不粘稠，邊緣整齊；通過光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)菌體呈桿狀，革蘭氏染色呈陽性。

2.4.2 分子鑒定 菌株YA-6的16S rDNA序列（登錄號(hào)：KY852302）與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對(duì)分析，與其同源性較高的菌株均屬于假單胞菌屬，其中與Pseudomonas hunanensis同源性最高（99.36%），通過構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹也可以看出，菌株YA-6與Pseudomonas hunanensis聚于同一分支（圖2）。

圖2 菌株YA-616S rRNA基因片段序列系統(tǒng)發(fā)育分析

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)經(jīng)分離、篩選得到86株巨菌草內(nèi)生細(xì)菌，從86株巨菌草內(nèi)生細(xì)菌中，篩選出8株具有產(chǎn)IAA能力的活性菌株，僅占9.30%。其中菌株YA-6產(chǎn)IAA能力最強(qiáng)，質(zhì)量濃度達(dá)到11.73 mg/L，與姜云等［11］的報(bào)道基本一致，表現(xiàn)極高的產(chǎn)IAA能力。菌株YA-6在NBRIP固體培養(yǎng)基上能夠形成明顯的溶磷圈，采用定量測(cè)定溶磷能力達(dá)7.103 mg/L，表明其對(duì)無機(jī)磷具有溶解能力，但低于姚玉玲等［10］的研究結(jié)果。測(cè)定菌株YA-6溶磷能力時(shí)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液的PH較空白培養(yǎng)液 pH值有所降低，可推測(cè)產(chǎn)生有機(jī)酸是菌株YA-6溶磷的一種方式，但具體的溶磷機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。菌株YA-6能夠使CAS液體培養(yǎng)基由藍(lán)色變?yōu)榉奂t色，說明其具有產(chǎn)生鐵載體的能力。菌株YA-6經(jīng)無氮培養(yǎng)基定性測(cè)定呈陽性，說明其具有固氮能力，對(duì)宿主巨菌草的環(huán)境適應(yīng)性及生長方面具有一定利用價(jià)值。經(jīng)生理生化、分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析，初步鑒定YA-6為假單胞菌屬。

植物內(nèi)生細(xì)菌對(duì)植物生長無害，不僅可以顯示植物生長的潛力，而且有利于植物增強(qiáng)共生環(huán)境，可能通過IAA的產(chǎn)生、固氮、磷酸鹽溶解和鐵載體的產(chǎn)生來影響植物的生長［28-29］。植物內(nèi)生細(xì)菌因其具有多種有益生物學(xué)作用，已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。許多過去的研究表明［30-31］，促進(jìn)不同植物生長的細(xì)菌能產(chǎn)生IAA，植物根部含有色氨酸，可被植物內(nèi)生細(xì)菌作為生產(chǎn)IAA的前體，因此，IAA量化被認(rèn)為是描述植物內(nèi)生促生細(xì)菌的共同特征。磷，是一種限制植物生長的營養(yǎng)物質(zhì)，但由于固定機(jī)制，植物通常無法獲得。植物通過酸化、螯合、交換反應(yīng)和有機(jī)酸產(chǎn)生的過程中，溶磷菌可以改變不溶性磷酸鹽成可溶性形式；植物內(nèi)生細(xì)菌最重要的一個(gè)磷酸溶解機(jī)制是低分子量有機(jī)酸的產(chǎn)生導(dǎo)致土壤的酸化［32-33］。植物內(nèi)生固氮菌是定殖于植物體內(nèi)與宿主植物進(jìn)行聯(lián)合固氮的一類微生物，不但具有固氮作用還有生物防治促進(jìn)植物生長的作用。20世紀(jì)80年代以來，內(nèi)生固氮菌由于在禾本科作物上具有固氮活性，又能促進(jìn)植物生長，成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［34-35］。內(nèi)生菌能產(chǎn)鐵載體對(duì)植物來說是有利的，因?yàn)樗峭ㄟ^抑制植物病原體來促進(jìn)植物生長的機(jī)制之一；鐵載體有能力從染料復(fù)合體中帶走鐵，從而導(dǎo)致顏色由藍(lán)色變?yōu)槌赛S色［36］。

菌株YA-6經(jīng)16S rDNA測(cè)序，屬于假單胞菌屬，具有多種促生潛能，有望開發(fā)為促生菌株，該試驗(yàn)還需要進(jìn)一步的研究。關(guān)于假單胞菌在促生長方面的研究和報(bào)道已有很多，該屬菌株具有一定溶磷特性，能促進(jìn)植物對(duì)磷元素的利用，還能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，對(duì)污水和土壤污染治理效果明顯［37］。巨菌草內(nèi)生菌YA-5具有分泌IAA、溶磷、固氮和產(chǎn)鐵載體等生物學(xué)功能，為進(jìn)一步開發(fā)和利用植物的內(nèi)生促生菌提供了依據(jù)，也為開發(fā)經(jīng)濟(jì)環(huán)保的生物菌肥提供菌種資源。

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