馬超白瑪央宗尼珍李建川王立輝

（1.西藏自治區(qū)高原生物研究所；2.西藏自治區(qū)生物工程技術中心，西藏 拉薩 850000）

道地藥材是一個中醫(yī)藥概念，是特定產(chǎn)地的在臨床長期實踐中被大家公認的優(yōu)質(zhì)、療效好的中藥材［1-2］。民族醫(yī)藥與中醫(yī)藥都是以藥材為基礎的傳統(tǒng)醫(yī)學，新中國成立后，民族醫(yī)藥包括蒙醫(yī)藥、藏醫(yī)藥、維吾爾醫(yī)藥等民族醫(yī)藥都取得了一定的發(fā)展，但都受其地域、群眾基礎、典籍、歷史、傳承特點等因素，發(fā)展相對滯后。［3-4］藥材是民族醫(yī)藥的載體，相對于中醫(yī)藥地道藥材，藏醫(yī)藥中缺少明確道地藥材的概念，卻存在類似的表述，藏醫(yī)名著《晶珠本草》中存在一藥多圖和藥材等級的說明，可作為道地藥材的篩選的依據(jù)［5］。中藥道地藥材也存在多藥多道地的情況［1］，藏醫(yī)藥實際應用中存在一藥多源的情況，不同產(chǎn)地及品種的藥材品質(zhì)缺少有效評價［12］，是否都是優(yōu)質(zhì)的道地藥材需要論證，藏醫(yī)用藥在典籍、文獻為基礎上，結(jié)合傳統(tǒng)用藥習慣，遴選優(yōu)質(zhì)藥材，提升藏醫(yī)藥品質(zhì)［6］。

藍花龍膽藏文音譯“榜間恩保”，在藏藥中是龍膽科七葉龍膽G.arethrusae Burk.var.delicatula Marq.、阿墩子龍膽G.atutsiensis W.W.Smith、線葉龍膽G.farreri Balf.f.、道孚龍膽G.altorum H.Smith、絲柱龍膽G.filishtyla Balf.f.等藥材的一類開藍色花的龍膽統(tǒng)稱［7-8］。藏藥用藥考究，傳統(tǒng)上藍花龍膽在藏藥中多用花而不包括其他部分，現(xiàn)行藏藥標準花或全草用藥。藍花龍膽花的成本高于全草，而實際應用多采用全草入藥，花與全草之間可能存在品質(zhì)差異，同時藍花龍膽是一類藥材，不同種藥材之間存在品質(zhì)差異。［7-10］藥材質(zhì)量是藏藥品質(zhì)的保障，中草藥龍膽主要以裂環(huán)烯醚萜類化合物龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、當藥苷等為指標成分，［11］龍膽苦苷為龍膽科植物指紋圖譜的特征峰，研究多采用以龍膽苦苷定量評價并建立指紋圖譜。［12-14］文章通過高效液相色譜HPLC對不同來源的藍花龍膽藥材以及同一藥材花及莖部馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷進行外標法定量分析和指紋圖譜分析，評價了藥材本身的質(zhì)量，為藍花龍膽的科學應用提供借鑒，也為該藏藥標準化與實際藏藥生產(chǎn)提供參考，探討民族醫(yī)藥建立道地藥材標準必要性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

安捷侖1200系列（G1315D DAD檢測器，G1311A Quat泵，G1329A ALS自動進樣器，Poroshell 120 ECC18 4μm 4.6×150mm色譜柱)，超聲清洗器KQ3200B（昆山市超聲儀器有限公司）電子天平JA5003（上海舜宇恒平科學儀器有限公司），超純水儀器（Milli-Q,美國）、氮吹儀（Organomation美國）,中藥粉碎機,移液器等。

1.2 試劑

甲醇色譜純(Fisher Scientific)，88%甲酸分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。龍膽苦苷≥98%（北京中科質(zhì)檢生物技術有限公司）批號：160403，獐牙菜苦苷≥98%（中國食品藥品檢定研究所）批號：must-12070203，馬錢苷酸≥98%（北京中科質(zhì)檢生物技術有限公司）批號：160510。

1.3 藥材來源及處理

7個來源不同的藍花龍膽樣品（表1）,去除雜質(zhì)后將部分帶花全草在花萼下部剪開分成花及莖兩部分，所有樣品置于變色硅膠干燥皿中備用。

表1 藍花龍膽信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品鑒定結(jié)果

參照中國植物志［15］鑒定7不同來源樣品，樣品由西藏自治區(qū)高原生物研究所土艷麗研究員鑒定檢查，校訂。

2.2 色譜條件

流動相A為0.1%甲酸水，流動相B為甲醇，梯度洗脫程序：0 min(12%B)、10 min(12%B)、25 min(30%B)、40 min(55%B)、50min(100%B)樣品分析 85min 檢測波長240nm；柱溫30℃；體積流量1.0 ml/min；進樣量5μL。所有組分分析85min。

2.3 三種物質(zhì)線性考察

以馬錢苷酸在19.125-91.8ug/L、獐牙菜苦苷在21.5-688ug/L龍膽苦苷32-1024ug/L范圍進行線性考察，每個梯度（n=7）進樣3次，考察不同梯度RSD，LOD、LOQ分別是信噪比S/N為3、10是樣品檢測濃度結(jié)果表2。

表2 馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷對照品色譜峰面積回歸方程與線性范圍

2.4 樣品穩(wěn)定性及儀器精密度

取樣樣品2除去雜質(zhì)粉碎過100目篩后0.2g定容至25ml容量瓶中，甲醇超聲處理30min，靜置至室溫后補足體積，分別在0-24小時內(nèi)檢測樣品，考察馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷對應峰面積RSD分別為2.68%、4.56%、2.51%及其他分離度較高的峰面積RSD（n=6）。

2.5 重復性

樣品2除去雜質(zhì)粉碎過100目篩后取樣五份，每份0.2g，加入相同混標準液的并定容至25ml容量瓶中，甲醇超聲處理30min，靜置至室溫后補足體積，混勻后取1ml過0.22μm有機相濾膜至進樣瓶中等待分析測定樣品中馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷含量，其RSD分別為1.78%、1.87%、0.98%.樣品共有峰不包括馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷的編號4、5、6、7、8、9的共有峰考察，在重復性實驗中評價共有峰其峰面積的重復性及穩(wěn)定性RSD分別為5.59%、0.80%、0.99%、1.91%、1.29%、0.61%、2.48%（n=5）。

2.6 添加回收試驗

取樣樣品2除去雜質(zhì)粉碎過100目篩后2g定容至250ml容量瓶中，甲醇超聲處理30min，靜置至室溫后補足體積，在樣品2供試液中分別添加馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷，其中馬錢苷酸添加水平分別為0.03、0.06、0.12g/L獐牙菜苦苷分別為0.01、0.02、0.04g/L、龍膽苦苷0.75、1.5、3g/L（n=5）混勻后取1ml過0.22μm有機相濾膜至進樣瓶中等待分析測定樣品中馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷含量。

表3 藍花龍膽3種成分加標回收率

2.7 樣品處理與檢測

樣品除去雜物后分離花、莖、全草，分別粉碎過100目篩，精確稱取0.20g樣品至于25ml容量瓶中，移液器加入25ml甲醇超聲處理30min，靜置至室溫后補足體積，混勻后取1ml過0.22μm有機相濾膜至進樣瓶中等待分析測定樣品中馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷含量（表4）。

表4 不同樣品不同部分3種成分百分含量

2.8 共有峰考察及指紋圖譜分析

不同樣品特征峰主要集中在16-35min，共有峰圖譜見（圖1），其中1-3號峰分別為馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷，其他共有峰面積信息見表5。采用重要色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A分析不同藍花龍膽樣品花與莖和不同藍花龍膽樣品的相似度?；ㄅc全草的相似度較莖部高，同一藥材不同部位考察色譜圖相似度可確定樣品（圖2）與經(jīng)典分類觀察結(jié)果一致。

表5 共有峰面積表

表6 滇龍膽林藥復合栽培模式下藥材指紋圖譜相似度評價結(jié)果

圖1 不同藍花龍膽樣品花部液相色譜圖

圖2 藍花龍膽花16-36min指紋圖譜

圖3 藍花龍膽樣品270nm與240nm對比

3 分析討論

通過比較240、254、270、290nm等 8個波段指紋圖譜和不同峰全波段掃描結(jié)果顯示240、254、270nm共有峰明顯且較多，馬錢苷酸與獐牙菜苦苷最大吸收約在240nm且含量較低，而龍膽苦苷最大吸收約270nm有較高的含量，最終選擇240nm保證馬錢苷酸與獐牙菜苦苷有效的檢出，并反應出藥材自身特性（圖3）。文中看出藥材自身不同部位存在差異，且不同藥材之間也存在較大差異，分析的藍花龍膽花中龍膽苦苷含量高于莖中，高于全草中含量，部分樣品中龍膽苦苷不能達到3%，但都高于1.5%，部分樣品獐牙菜苦苷含量變化差異較大，而馬錢苷酸含量變化差異小。通過樣品之間譜圖共有峰及峰面積考察，可看出樣品主要特征峰在35min內(nèi)全部出現(xiàn)，集中出現(xiàn)在16-35min。藏藥材質(zhì)量是藏藥質(zhì)量的基礎，實際工作中可作為一種快速鑒定和評價藏藥材藍花龍膽藥材質(zhì)量的方法。

傳統(tǒng)上藏醫(yī)對藍花龍膽以花用藥，通過指紋圖譜評價不同樣品，不同樣品花和莖葉指紋圖譜存在差異大于花與全草指紋圖譜，指紋圖譜存在一定相似性，全草入藥是或許是可行的。以龍膽苦甙為標志性物質(zhì)，從道地藥材角度上分析，我們更應該尊重藏醫(yī)用藥傳統(tǒng)，采用花入藥，同時對藥材生物分類學種上應加以限制并進行質(zhì)量評價，建立藍花龍膽指紋圖譜評價系統(tǒng)，依托該方法用來龍膽品種區(qū)分與質(zhì)量評價是可行的，同時該方法可應用于篩選評價道地民族藥材。藍花龍膽僅是藏藥材中一種，類似存在多種藏藥材如綠絨蒿、虎耳草等，存在類似情況，提升民族醫(yī)藥品質(zhì)，在藏藥中建立道地藥材標準函待解決。

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